CN102311960A - 一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程研究领域，提供了一种海洋青霉Swollenin基因、其编码的蛋白质，及其在提高纤维素酶活性方面的应用。海洋青霉Swollenin基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述海洋青霉Poswollenin能有效提高纤维素酶活性，促进结晶纤维素的水解效率，这样能减少纤维素酶的用量，节省生产成本，促进纤维素乙醇的工业化。

Description

一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用

技术领域

本发明属于基因工程研究领域，具体海洋青霉Swollenin基因、其编码的蛋白质，及其在提高纤维素酶活性方面的应用。

背景技术

木质纤维素是地球上含量最丰富的可再生资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分构成。木质纤维素可经预处理和纤维素酶水解转变为葡萄糖等单糖，后者可经微生物发酵生产纤维素乙醇，这一途径的开发和工业化对缓解当前日益严重的能源危机和温室效应具有重要意义。然而，木质纤维素中的纤维素组分因氢键而形成结晶结构(纤维素微纤丝)，而且纤维素微纤丝又和半纤维素、木质素等通过氢键形成牢固的复杂网络结构，使得木质纤维素难以被纤维素酶水解。纤维素酶对纤维素的水解效率低下是纤维素乙醇工业化生产的主要瓶颈之一。

植物扩张蛋白是从植物细胞壁中分离的一类蛋白，它没有水解酶活性，但可以破坏纤维素微纤丝之间或微纤丝和其它细胞壁多糖之间的氢键，具有松弛细胞壁结构和促进细胞生长的功能。Swollenin是丝状真菌中与植物扩张蛋白同源的一类蛋白，它也具有植物扩张蛋白类似的破坏植物细胞壁的功能。纤维素难以被纤维素酶降解的主要原因是因氢键而形成的牢固结构，因此，能破坏氢键的扩张蛋白和Swollenin有可能成为促进纤维素酶水解活性的辅助因子。植物扩张蛋白由于难以实现有效的异源重组表达而限制了它在这方面的应用。2002年，Swollenin首次在产纤维素酶真菌里氏木霉中被鉴定出来(Saloheimo M，Paloheimo M.Eur J Biochem.2002，269：4202-4211)。该蛋白能破坏棉花的纤维结构，使滤纸软化，并能破坏斛果壳的细胞壁。里氏木霉Swollenin虽能实现在酵母和黑曲霉的异源重组表达，但表达量较低；且该研究的作者未进行任何关于Swollenin促进纤维素酶活性的研究。2006年，Levasseur将里氏木霉Swollenin与黑曲霉的阿魏酸酯酶Feruloyl esterase A进行融合表达，发现该融合蛋白处理麦麸后能使阿魏酸的释放率提高50％，提示Swollenin能促进水解酶的活性(Levasseur A，Saloheimo M.Appl Microbiol Biotechnol.2006，73：872-880)。2010年，Wang成功用米曲霉表达的重组Swollenin使纤维素酶活性提高81％(Wang M，Cai J.Appl Biochem Biotechnol.2010，162：2027-2036)。从已有结果看，Swollenin的研究尚存在如下一些问题：(1)Swollenin促进纤维素酶水解纤维素的活性较弱；(2)Swollenin与纤维素酶协同作用的处理工艺较单一；(3)目前研究的Swollenin主要来源于陆生真菌，对海洋真菌Swollenin的研究未见报道。海洋因其高压、低温、无光照、高盐等生命极限环境，使得海洋真菌有可能合成更特别的蛋白并使之具有更高的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海洋青霉Swollenin基因，其核苷酸序列如SEQID No：1所示。

本发明的第二个目的在于提供一种海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第三个目的在于提供一种含有海洋青霉Swollenin基因的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种含有海洋青霉Swollenin基因表达载体的转化细胞。

本发明的第五个目的在于提供所述海洋青霉Swollenin基因在提高纤维素酶活性上的应用。

本发明的第六个目的在于提供用所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在提高纤维素酶活性上的应用。

本发明的第七个目的在于提供述海洋青霉Swollenin基因在纺织工业中的应用。

本发明的第八个目的在于提供用所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在纺织工业中的应用。

本发明的第九个目的在于提供所述海洋青霉Swollenin基因在纤维素乙醇工业中的应用。

本发明的第十个目的在于提供用所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在纤维素乙醇工业中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

1)克隆Swollenin基因：提取海洋青霉Penicillium oxalicum基因组DNA，设计引物，通过PCR技术从海洋青霉Penicillium oxalicum基因组DNA中克隆Swollenin基因，命名为poswollenin。

2)构建重组蛋白诱导型表达载体：利用里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh 1的启动子、信号肽和终止子序列，以质粒pPICZαA为出发载体，构建重组蛋白诱导型表达载体pPIC-PT。

3)海洋青霉poswollenin在里氏木霉的诱导型表达：将poswollenin基因插入表达载体pPIC-PT的Sfi I和Not I位点之间，构建成重组质粒pPIC-poswollenin。将重组质粒pPIC-poswollenin转化里氏木霉RUT-C30原生质体，然后将得到的poswollenin木霉转化子接种诱导产酶培养基，在微晶纤维素的诱导下进行Poswollenin的合成和分泌表达。

4)Poswollenin重组蛋白的分离纯化：Poswollenin重组蛋白采用如下技术流程进行分离纯化：培养上清离心——超滤浓缩——硫酸铵沉淀——亲和层析——脱盐。

5)Poswollenin促进纤维素酶水解效率验证：

a)将不同浓度的Poswollenin与不同浓度的纤维素酶进行同步反应、分步反应，0-48h范围内不同时间取样测定反应产生的还原糖，摸索促进纤维素酶活性的最佳条件；

b)将Poswollenin与纤维素材料(滤纸、微晶纤维素等)混合作用，用显微镜观察纤维素材料的结构变化，分析Poswollenin破坏结晶纤维素的机理，为进一步优化Poswollenin与纤维素酶协同作用的条件指明方向。

本申请所述海洋青霉Poswollenin能有效提高纤维素酶活性，促进结晶纤维素的水解效率，这样能减少纤维素酶的用量，节省生产成本，促进纤维素乙醇的工业化。

另外本申请构建的蛋白表达载体pPIC-PT，能有效提高重组蛋白的产量，使得目的蛋白的生产成本降低。

附图说明

图1：青霉poswollenin的琼脂糖电泳图谱。

图2：Poswollenin的保守结构域分析。

图3：诱导型表达载体pPIC-PT的载体图。

图4：Poswollenin用载体pPIC-PT诱导表达的Western blot结果。

图5：Poswollenin重组蛋白纯化各步样品的SDS-PAGE图谱。

图6：Poswollenin与纤维素酶的同步反应结果。

图7：Poswollenin与纤维素酶的分步反应结果。

图8：Poswollenin对滤纸的崩解作用。

图9：Poswollenin对微晶纤维素破坏作用的普通光学显微镜照片。

图10：Poswollenin对微晶纤维素破坏作用的扫描电镜照片。

具体实施方式

以下优选的实施例可对本发明的技术路线做进一步说明，但不构成对本发明的限制。

实施例1  海洋青霉(Penicillium oxalicum)poswollenin基因组DNA的分离

(一)材料

1.菌株和质粒

从广东惠州海域筛选的草酸青霉Penicillium oxalicum HZ-7，大肠杆菌E.coliTop10购自Invitrogen，pMD19-T simple vector克隆载体购自TaKaRa。

2.寡核苷酸引物

表1 根据各物种swollenin基因序列设计的保守引物

表2 poswollenin 5’和3’未知序列的扩增引物

3.试剂

DNA Marker、各种DNA工具酶、基因组步移试剂盒均购自TaKaRa。

LB培养基：用于大肠杆菌的培养，含1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％琼脂(固体培养基)，pH 7.0。筛选大肠杆菌时，加入终浓度为100μg/mL氨卞青霉素或者50μg/mL卡那霉素。

4.仪器

使用的仪器包括电子天平(Mettler-Toledo，PB203-E)、pH计(Mettler-Toledo，320-S)、PCR仪(ABI，2720)、小型离心机(Eppendorf，Minispin)、冷冻离心机(Sigma，3K15)、琼脂糖凝胶电泳仪(上海天能，EPS-300)、凝胶成像系统(SIEMENS，Dolphin-Doc)、高压灭菌锅(NBS，M1253-0003)、超纯水机(TECHCOMP LIMITED，BRANT)、低温摇床(苏坤，SKY-200B)、低温培养箱(上海爱朗，LTI-700)。

(二)方法

1.海洋青霉P.oxalicum HZ-7基因组DNA的提取

P.oxalicum HZ-7基因组DNA的提取采用通用的CTAB法。

2.P.oxalicum poswollenin保守序列的扩增

查找并比对分析NCBI公布的各个物种的swollenin基因序列，设计3对保守引物(表1)。以P.oxalicum HZ-7基因组DNA为模板，用表1引物进行PCR扩增，条件如下：94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；30cycles。

3.P.oxalicum HZ-7 poswollenin 5’和3’未知编码序列的扩增

用TAIL-PCR技术来扩增P.oxalicum poswollenin 5’和3’未知编码序列，相关操作按照基因组步移试剂盒(Genome Walking kit，TaKaRa)说明书进行。扩增poswollenin未知编码序列使用的引物见表2。

4.P.oxalicum poswollenin完整编码序列的扩增

根据得到的P.oxalicum poswollenin 5’和3’未知编码序列，设计完整编码序列的上下游引物，从P.oxalicum基因组DNA中扩增poswollenin的完整编码序列。

(三)结果

以P.oxalicum HZ-7基因组DNA为模板，用引物Posense 2和Poantisense 1(表1)进行PCR扩增，得到一条约200bp的特异条带。将该DNA条带切胶回收，进行DNA测序，结果显示该200bp DNA序列与其它物种swollenin基因的编码序列具有较高的同源性，将之命名为poswo1。然后使用基因组步移试剂盒(TaKaRa)来扩增青霉poswollenin 5’和3’端未知编码序列。经过各三轮TAIL-PCR扩增，得到了一个850bp左右的5’端片段和一个950bp左右的3’端片段，命名为poswo5’和poswo3’。将poswo1、poswo5’和poswo3’三段基因序列进行拼接，得到完整的青霉poswollenin编码序列，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。序列分析表明，poswollenin序列是一个完整的开放阅读框，全长1905bp，以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAG结束，包含6个内含子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；共编码499个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示，蛋白理论分子量52kD。

用生物软件DNAssist 2.0对Poswollenin进行分析表明，组成Poswollenin的499个aa中，丝氨酸占12％，苏氨酸占8％。由于这两种氨基酸都是潜在的糖基化位点，因此该分析表明Poswollenin的糖基化程度可能很高。Poswollenin序列中有28个半胱氨酸，占5％，表明蛋白可能形成多对二硫键。此外，预测的等电点为4.8。用软件ProtParam进行蛋白质稳定性分析表明，Poswollenin的半衰期超过20小时，蛋白不稳定指数为38.09。数据库结论为：该蛋白具有良好的稳定性。信号肽分析表明，Poswollenin的信号肽为N端19或20个氨基酸，其中N端20个氨基酸为信号肽的可能性更大，即蛋白质从第21个氨基酸Q开始为成熟肽。糖基化位点分析表明，Poswollenin蛋白中有32个潜在的糖基化位点，其中相当一部分位于60～110aa的Linker区域。蛋白质的糖基化修饰对蛋白抵御蛋白酶的攻击而保持自身的稳定性可能具有重要作用。序列同源性分析结果表明，Poswollenin含有已公布物种Swollenin的保守结构域，包括N端的纤维素结合结构域(CBD)、Linker和C端的糖苷水解酶第45家族蛋白催化域类似结构域(Family-45 endoglucanase-like domain)、Expansin纤维素结合结构域(ExpansinCBD)；含有四对二硫键，其中两对位于N端的CBD，另外两对位于C端，如图2所示。

实施例2  Poswollenin重组蛋白的制备

(一)材料

1.菌株和质粒

大肠杆菌Top10、里氏木霉Trichoderma reesei RUT-C30。质粒pPICZαA，作为构建诱导表达载体的骨架；质粒pAN7-1作为诱导表达载体共转化质粒，带有真菌筛选标记潮霉素抗性基因hph和大肠杆菌筛选标记氨苄青霉素抗性基因Ap。

2.寡核苷酸引物

表3构建里氏木霉重组蛋白诱导型表达载体的引物

3.试剂

PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20％土豆浸出液，1％葡萄糖，2％Agar。20％土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20g土豆加水100mL，煮沸30min，用三层纱布过滤，加入葡萄糖后定容。筛选里氏木霉转化子时加入终浓度为50-100μg/mL的潮霉素。

里氏木霉液体基本培养基：含100mL/L Mandels营养液浓缩液，1.0mL/LMandels微量元素浓缩液，20g/L无水葡萄糖，1.0g/L蛋白胨，50mL/L pH 4.5的1mol/L的柠檬酸缓冲液，1.0-2.0g/L吐温80。

Mandels营养盐浓缩液配制：(NH4)2SO4：14g/L，尿素：3g/L，KH2PO4：20g/L，CaCl2·2H2O：4g/L(或CaCl2：3g/L)，MgSO4·7H2O：3g/L，加水至1000mL。

Mandels微量元素浓缩液配制：FeSO4·7H2O：5g/L，ZnSO4·7H2O：1.7g/L(或ZnCl2：0.7g/L)，CoCl2·6H2O：3.7g/L(或CoCl2：2g/L)，MnSO4·H2O：1.6g/L(或MnCl2：1.67g/L，或MnSO4·7H2O：2.6g/L)，加水至1000mL。

1mol/L柠檬酸缓冲液配制：柠檬酸：210g，加NaOH(纯度96％)约78g，加水750mL，冷却后加水至1000mL。

诱导产酶培养基：含微晶纤维素30g/L，Mandels营养液浓液200mL/L，Mandels微量元素浓液2.0mL/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨1.0g/L，pH 4.5，1mol/L柠檬酸缓冲液50mL/L，吐温801.0～2.0g/L。

2％CMC-Na底物溶液：2g CMC-Na加热溶解于pH 4.8，0.05mol/L的柠檬酸缓冲液，定容至100mL。

DNS(3，5-二硝基水杨酸试剂)：将7.5g 3，5-二硝基水杨酸和14.0g NaOH充分溶解在1000mL水中，加入216.0g酒石酸钾钠、5.6mL预先在50℃水浴中溶化的苯酚和6.0g偏重亚硫酸钠，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后使用。

组氨酸标签单克隆抗体(ABGENT)，羊抗鼠IgG-AP二抗(Proteintechgroup)，显色底物BCIP/NBT(BBI)。

4.仪器

使用的仪器包括超滤仪(sartorius，Vivaflow 50)、冷冻离心机(Sigma，3K15)、快速液相色谱(GE，AKTAFPLC)、蛋白电泳仪(Bio-Rad，MP3)、分子杂交箱(Labnet，ProBlot 12S)。

(二)方法

1.诱导型表达载体pPIC-PT的构建

以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，用表3的引物CBH-Ter-1和CBH-Ter-2扩增cbh 1的终止子序列，PCR产物(800bp)用Not I和Sal I双酶切，连接经同样酶切的pPICZαA，成pPIC-Tcbh；以QM9414基因组DNA为模板，用引物CBH-Pro-SS-1和CBH-Pro-SS-2扩增cbh 1的“启动子-信号肽”序列，PCR产物(1548bp)用EcoR I和Kpn I双酶切，连接经同样酶切的pPIC-Tcbh，构成诱导型表达载体pPIC-PT。

2.海洋青霉poswollenin在里氏木霉的诱导型表达

以Penicillium oxalicum HZ-7基因组DNA为模板，用引物Poswo2和Poswo3扩增，PCR产物回收并以之为模板，用Poswo1和Poswo3扩增，得到poswollenin(5’端含6×His Tag的编码序列)；将poswollenin用Sfi I和Not I双酶切，并与经同样酶切的载体pPIC-PT连接，构建成重组质粒pPIC-poswollenin。

将重组质粒pPIC-poswollenin转化里氏木霉原生质体。里氏木霉RUT-C30原生质体制备和转化方法如下：将里氏木霉孢子接种于PDA固体平板，28℃培养7天。用无菌水制备孢子悬液，取0.8-1.0×108个孢子，接种到40mL液体培养基中，于28℃、250r/min培养11-15h；待孢子萌发，取25mL菌液置于25mL离心管，6000r/min，5min。去上清，菌丝用1mol/L MgSO4洗2遍，8000r/min，5min；用10mL酶解液(100mg溶壁酶溶于10mL 1mol/L MgSO4后过滤除菌)重悬菌丝并置于100mL三角瓶中，28℃，70r/min，2～2.5h，用显微镜观察原生质体的情况。往酶解液中加入1-2倍体积的STC(1.2mol/L山梨醇-0.01mol/LTris·Cl(pH 7.5)-50mmol/L CaCl2)8000r/min，离心15min，沉淀原生质体。去上清，用STC溶液洗涤原生质体两次，8000r/min，离心10-15min；最后将原生质体悬浮于1mL STC溶液中并进行细胞计数。调整原生质体的浓度为108个/mL，取200μl，加入20μg重组质粒pPIC-poswollenin(总体积不超过20μL)，轻轻混匀；48℃热激2min；加入50μl 60％的PEG 4000(用pH 7.5含0.05mol/LCaCl2和0.01mol/L Tris·Cl的缓冲液配制)，于室温静置20min。溶液先转移到25mL离心管中，再加入2mL 60％的PEG4000，混匀后于室温静置5min；加入8mL STC，8000r/min，离心15min；用1mL STC溶液重悬原生质体沉淀后加入到10mL原生质体液体再生培养基中，于28℃，70r/min的条件下培养24h，8000r/min，离心10min，用0.5-1.0mL STC溶液悬浮细胞沉淀，将悬浮液涂布于5个含50-100μg/mL潮霉素的PDA固体平板上，28℃培养2天左右；待平板上长出菌丝(平板底部变黄)，将菌丝连同其下方的一层薄薄的琼脂块一同挖下，菌丝朝下接种到新的含潮霉素PDA固体小平板上，28℃培养7天左右，再次转接到不含潮霉素的PDA固体小平板上以产生孢子。

取106个Poswollenin转化子孢子，接种25mL Mandels液体基本培养基，28℃，250r/min培养2天，按5-10％的接种量转接新鲜的诱导产酶培养基，继续培养5天，将培养物4℃，12,000r/min，离心10min，取上清进行SDS-PAGE和免疫印迹检测。

3.Poswollenin重组蛋白的分离纯化

Poswollenin重组蛋白纯化流程如下：

培养上清离心——超滤浓缩——硫酸铵沉淀——亲和层析——脱盐

(1)发酵液的回收。Poswollenin转化子液体培养物，4℃，12,000r/min，离心10min，取上清。

(2)超滤浓缩。将Poswollenin培养上清液用三层滤纸抽滤，去除残留的细胞和纤维素颗粒；然后用孔径为10,000MW的超滤膜超滤，将上清液浓缩10倍。

(3)硫酸铵沉淀。往超滤浓缩的Poswollenin样品中边搅拌边加入研细的硫酸铵粉末，使达到10～90％的饱和度。4℃静置2h以上。然后4℃，12,000r/min，离心10min，弃上清。取沉淀进行SDS-PAGE，评估目的蛋白的沉淀效率，并选择沉淀效率较高同时能去除一部分杂蛋白的硫酸铵的饱和度。

(4)亲和层析。利用Poswollenin N端的6×His Tag进行亲和层析分离目的蛋白。用100mL平衡缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)溶解100mg硫酸铵沉淀的蛋白样品，上样到镍离子琼脂糖凝胶亲和柱，平衡至UV值平稳后，用咪唑洗脱溶液(0.05mol/L Tri-HCl，0.5mol/L NaCl，0.5mol/L咪唑，pH 8.0)进行线性洗脱，用仪器自动收集样品，5mL/管。

(5)脱盐。用脱盐柱对亲和层析高浓度咪唑洗脱样品进行脱盐，同时将样品缓冲液变为NaAc缓冲液(0.05mol/L NaAc buffer，pH 4.8)

上述每步取样，进行SDS-PAGE鉴定，并计算Poswollenin的回收率和纯度。

(三)结果

1.丝状真菌诱导型表达载体的构建

以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，分别扩增cbh 1基因的“启动子-信号肽”序列和终止子序列，插入骨架载体pPICZαA，构建成诱导型表达载体pPIC-PT(图3)。cbh 1信号肽中有一个Sfi I位点，终止子上游有一个Not I位点，通过这两个酶切位点将目的基因插入载体pPIC-PT，在纤维素的诱导下进行重组表达。其中Sfi I的识别序列是GGCCNNNNNGGCC，Not I的识别序列是GCGGCCGC。由于Sfi I和Not I这两个酶切位点在各个物种的基因组中都比较罕见，因此载体pPIC-PT具有良好的通用性。使用Sfi I酶切载体pPIC-PT，会导致cbh 1信号肽下游缺失TTGGCCACAGCTCGTGCT这18个碱基；这些碱基可以在PCR扩增待表达的基因序列时通过设计上游引物来补充完整。

2.Poswollenin在里氏木霉的诱导型重组表达

将扩增的poswollenin基因用Sfi I和Not I双酶切，插入经同样酶切的pPIC-PT，得到了重组质粒pPIC-poswollenin。构建重组质粒时，在Poswollenin的N端引入了一个6×His Tag，在目的蛋白表达成功后，可以用抗6×His Tag的单克隆抗体进行Western blot检测。将重组质粒pPIC-poswollenin转化里氏木霉RUT-C30，经含潮霉素的PDA固体平板筛选和PCR鉴定得到了poswollenin的阳性转化子。将poswollenin的阳性转化子经微晶纤维素诱导培养，取上清进行SDS-PAGE鉴定和用6×His Tag单克隆抗体进行免疫印迹检测。SDS-PAGE和免疫印记结果表明，诱导表达的重组Poswollenin分子量为81kD，远大于其理论分子量52kD，估计是翻译后糖基化修饰所致。在得到的poswollenin阳性转化子中，第20号菌株的目的蛋白表达量最高，达100mg/L以上(图4)，比里氏木霉内源的Swollenin表达量提高100倍以上，说明本发明构建的载体pPIC-PT能特别有效地提高重组蛋白的产量。

3.重组蛋白Poswollenin的分离纯化

根据构建重组质粒时在Poswollenin N端引入的6×His Tag，用亲和层析法(金属螯合层析)纯化Poswollenin重组蛋白。首先对蛋白粗制品进行超滤浓缩：将蛋白样品通过超滤仪10,000MW孔径的滤膜，使体积缩小到十分之一。浓缩得到的蛋白样品再进行硫酸铵沉淀使蛋白与溶液中的柠檬酸钠分离(柠檬酸钠是强螯合剂，会影响下游的亲和层析)。经过对10～90％的硫酸铵饱和度进行摸索，最后确定70％的饱和度为最佳——70％饱和度硫酸铵沉淀，既能最大限度地回收目的蛋白，又能去掉一部分杂蛋白。将70％硫酸铵沉淀的蛋白用亲和层析平衡缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH8.0)溶解(每100mg总蛋白溶于100mL平衡缓冲液)，通过镍离子琼脂糖层析柱，然后用0.5mol/L的咪唑溶液对吸附在镍离子琼脂糖柱的His-Poswollenin进行线性洗脱，按5mL/管自动收集。结果表明，在0.06mol/L和0.12mol/L咪唑处各出现一个洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定表明，60mmol/L咪唑洗脱峰含有许多非特异性吸附的杂蛋白，而120mmol/L咪唑峰含有很纯的Poswollenin(图5，泳道5)。通过密度扫描软件进行计算，结果表明，亲和层析纯化的Poswollenin纯度达95％以上。经过蛋白定量，Poswollenin的蛋白回收率约为19％。

实施例3.Poswollenin促进纤维素酶水解效率的工艺研究及验证

(一)材料

1.试剂

RUT-C30纤维素酶，纯化的Poswollenin蛋白，滤纸(Whatman NO.1)，微晶纤维素Avicel(Sigma PH101)。

2.仪器

电热恒温振荡水槽(上海一恒，DKZ-2)，分子杂交箱(Labnet，ProBlot 12S)，普通光学显微镜(Olympus，CX41-32C02)，扫描电子显微镜(美国TA公司，JSM-5910)。

(二)方法

1.Poswollenin与纤维素酶的同步反应

将Poswollenin与纤维素酶对微晶纤维素进行同步反应。分别取不同浓度的Poswollenin(0.3，3，10，30μg)与不同浓度的纤维素酶(0.02FPU，0.002FPU)和2.5mg微晶纤维素Avicel混匀，用0.05mol/L NaAc缓冲液(pH 4.8)定容至250μl，在50℃振荡反应，不同时间(4，8，12，24，36，48h)取样测定还原糖，并计算Poswollenin与纤维素酶作用的协同度。对照组：不同浓度Poswollenin或不同浓度纤维素酶与2.5mg微晶纤维素Avicel单独反应。

协同度定义为Poswollenin与纤维素酶共同作用产生的还原糖除以两者单独作用产生的还原糖之和，即

协同度＝还原糖(Poswollenin+纤维素酶)/(还原糖Poswollenin+还原糖纤维素酶)

2.Poswollenin与纤维素酶的分步反应

将Poswollenin与纤维素酶对微晶纤维素进行分步反应。

首先进行Poswollenin对微晶纤维素的预处理程序：取10μg Poswollenin加入称有2.5mg微晶纤维素粉末的离心管中，用0.05mol/L NaAc缓冲液(pH 4.8)定容至250μl，在50℃振荡48h。然后对微晶纤维素进行如下洗涤程序去除Poswollenin：1mol/L NaCl洗涤1次，沸水浴10min，0.05mol/L NaAc buffer洗涤2次。本实验以不含Poswollenin的0.05mol/LNaAc buffer(pH 4.8)对微晶纤维素的预处理作为阴性对照。

Poswollenin去除完毕，加入纤维素酶(0.02FPU，0.002FPU)在50℃下反应，不同时间取样测定还原糖，分析Poswollenin预处理对纤维素酶水解效率的影响。

3.Poswollenin对滤纸的崩解作用

将10μg Poswollenin与50mg Whatman No.1滤纸分别加入2mL离心管，用0.05mol/LNaAc buffer(pH 4.8)定容至1.8mL，在50℃振荡48h，取上清液加入比色皿，观察溶液的浊度，并以0.05mol/L NaAc buffer(pH 4.8)为空白调零测定OD600。本实验以NaAc buffer与滤纸的反应作为阴性对照，并将使OD600读数升高0.01所需要的Poswollenin的量定义为一个滤纸崩解活力单位。

4.Poswollenin对微晶纤维素的破坏作用

将10μg Poswollenin加入称有2.5mg微晶纤维素粉末的离心管中，用0.05mol/LNaAc buffer(pH 4.8)定容至250μL，50℃振荡反应48h，然后取少量微晶纤维素样品用Olympus CX41普通光学显微镜和JSM-5910扫描电子显微镜观察纤维素结构的变化。本实验以NaAc buffer与微晶纤维素的反应作为阴性对照。

(三)结果

1.Poswollenin与纤维素酶的同步反应

为研究Poswollenin与纤维素酶之间是否存在协同作用，分别取不同浓度的纤维素酶(0.02FPU，0.002FPU)与不同浓度的Poswollenin(0.3，3，10，30μg)和2.5mg微晶纤维素Avicel在50℃反应，不同时间取样测定还原糖，分析Poswollenin与纤维素酶作用的协同度。协同度定义为Poswollenin与纤维素酶共同作用产生的还原糖除以两者单独作用产生的还原糖之和，即

协同度＝还原糖(Poswollenin+纤维素酶)/(还原糖Poswollenin+还原糖纤维素酶)

从图6看，当加入0.002FPU纤维素酶时，纤维素酶与Poswollenin之间存在较好的协同作用，如图8中A和B两部分所示，并且随着Poswollenin的浓度升高，协同作用也增加，比如0.002FPU纤维素酶与10μg和30μg Poswollenin进行同步反应时，在36h和48h纤维素酶活性提高0.5倍左右，协同度达1.5。值得注意的是，在48h，10μg Poswollenin的协同度比30μg Poswollenin还要高。当加入0.02FPU纤维素酶与不同浓度Poswollenin进行同步反应时如图8中C，和D两部分所示，协同作用不明显，并且随着Poswollenin浓度的升高，两者同步反应产生的还原糖甚至低于纤维素酶单独反应产生的还原糖，即协同度小于1。

将图8的结果综合起来分析，我们认为，Poswollenin跟纤维素酶之间可能既存在协同作用，又存在竞争抑制作用。

2.Poswollenin与纤维素酶的分步反应

既然Poswollenin之间可能既存在协同作用，又存在竞争抑制作用，那么应该设法在发挥两者协同作用的同时，又尽可能避免竞争性的抑制作用。将Poswollenin与纤维素酶对纤维素进行分步反应可能是一个较好的办法。

首先对微晶纤维素进行Poswollenin的预处理，即取10μg Poswollenin与2.5mg微晶纤维素在50℃作用48h。然后对微晶纤维素进行如下处理以去除Poswollenin：1mol/L NaCl洗涤1次，沸水浴10min，0.05mol/L NaAc buffer 2次。上述每步处理后，离心取上清进行蛋白定量，分析Poswollenin去除的效果。本实验以不含Poswollenin的0.05mol/L NaAc buffer(pH 4.8)对微晶纤维素的预处理作为阴性对照。Poswollenin去除完毕后，加入纤维素酶(0.02FPU，0.002FPU)在50℃反应，不同时间取样测定还原糖，分析Poswollenin预处理对纤维素酶活提高的作用，结果见图7。

从图7看，当纤维素酶用量为0.002FPU时，微晶纤维素的Poswollenin预处理对纤维素酶水解效率的提高具有较明显的作用，在48h时Poswollenin预处理组的还原糖产量比对照组(NaAc buffer预处理组)提高1.5倍，协同度达2.5，如图7中B部分所示。从图7中A部分看，对照组在24h后反应速率下降，反应进入平台期；而Poswollenin预处理组在24～48h过程中仍保持较高的反应速率，还原糖产量较高。然而，当纤维素酶用量为0.02FPU时，纤维素酶活力促进作用表现得不明显。从图7中D部分看，Poswollenin预处理组的纤维素酶活力只在反应的初始阶段比对照组提高10％左右，即协同度达1.1；随着时间的推移，促进效果变得不明显，并在36h后出现抑制现象(还原糖比对照组还要低)。为何会出现这样的现象？可能的原因是：Poswollenin对微晶纤维素的破坏需要一段较长的时间，当纤维素酶浓度较高时，Poswollenin预处理使底物暴露出来的可反应位点在较短的反应时间内便消耗完，接下来跟对照组便无明显区别。从图7中A部分看出，Poswollenin预处理使纤维素酶活力提高是发生在还原糖产量为300μg的范围内，而在这个范围内，0.02FPU的反应速率很快，如图7中C部分所示。也许在反应的初始阶段，如10min内，Poswollenin预处理组也表现出较明显的纤维素酶水解效率提高效应，只不过该效应发生得太早而没有被记录下来。

上述结果表明，将Poswollenin与纤维素酶对微晶纤维素进行分步反应，能更有效提高纤维素酶的水解效率，在较低浓度纤维素酶时该现象更加明显。

3.Poswollenin对滤纸的崩解作用

为分析Poswollenin对纤维素材料的作用，我们研究了Poswollenin对滤纸的崩解作用。将10μg Poswollenin与50mg Whatman No.1滤纸在50℃振荡反应48h，取上清液加入比色皿，测定OD600。本实验以0.05mol/L NaAc buffer与滤纸的反应作为空白调零，并将使OD600读数升高0.01所需要的Poswollenin的量定义为一个单位(U)滤纸崩解活力。

从图8看，Poswollenin与滤纸作用的上清液，如图8中A-2部分所示，明显比NaAc buffer与滤纸作用的上清液浑浊，如图8中A-3部分所示，表明Poswollenin能使滤纸崩解，导致滤纸屑大量脱落。OD600测定值表明，10μgPoswollenin约具有21U的滤纸崩解活性，如图8中B部分所示。上述过程中，Poswollenin不产生明显可检测的还原糖。

4.Poswollenin对微晶纤维素的破坏作用

将10μg Poswollenin与2.5mg微晶纤维素在50℃振荡48h，然后取少量微晶纤维素样品用Olympus CX41光学显微镜和JSM-5910扫描电子显微镜观察纤维素结构的变化。本实验以NaAc buffer与微晶纤维素的反应作为阴性对照。

图9中，A和C部分(分别放大100倍和400倍)为与NaAc buffer反应的微晶纤维素，B和D部分为与Poswollenin反应的微晶纤维素。从图9中看，与阴性对照，图9中A和C部分相比，Poswollenin作用过的微晶纤维素颗粒变细，如图9中B和D部分所示。

图10中，A和C部分(分别放大5,000倍和20,000倍)为与NaAc buffer反应的微晶纤维素，B和D部分为与Poswollenin反应的微晶纤维素。从图10中看，与NaAc buffer反应的微晶纤维素表面仍比较完整，如图10中A和C部分所示；而与Poswollenin反应的微晶纤维素则出现表面凹陷，褶皱增加，如图10中B部分所示，甚至表面开裂的现象，如图10中D部分所示。

综合上述结果，证明Poswollenin破坏了微晶纤维素微纤丝之间的氢键，纤维素结晶度下降而变得松散；在溶液内振荡过程中，甚至出现纤维素组分相互分离，在宏观上呈现颗粒变细的现象。上述变化过程中，不产生明显可检测的还原糖。

上述Poswollenin对滤纸和微晶纤维素的破坏作用印证了如下事实：先用Poswollenin对纤维素材料进行预处理，能有效增加纤维素的可接触面积，使得纤维素酶能更有效接触其底物而促进了纤维素酶对纤维素的水解作用。

Claims (10)

1.一种海洋青霉Swollenin基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求1所述海洋青霉Swollenin基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的转化细胞。

5.权利要求1所述海洋青霉Swollenin基因在提高纤维素酶活性上的应用。

6.权利要求2所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在提高纤维素酶活性上的应用。

7.权利要求1所述海洋青霉Swollenin基因在纺织工业中的应用。

8.权利要求2所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在纺织工业中的应用。

9.权利要求1所述海洋青霉Swollenin基因在纤维素乙醇工业中的应用。

10.权利要求2所述海洋青霉Swollenin基因所编码的蛋白质在纤维素乙醇工业中的应用。

Images