CN114478720A - 用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因及其非催化蛋白和应用 - Google Patents

用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因及其非催化蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因，所述非催化蛋白基因包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2中任意一种，其中SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1的突变序列。本发明提出了非催化蛋白基因和非催化蛋白，将非催化蛋白基因进行异源表达并研究其功能，提出特定的非催化蛋白基因和非催化蛋白具有高效协同纤维素酶水解纤维素的能力。本发明通过在纤维素酶中添加该非催化蛋白SY1或者其突变蛋白SY1mut，可以高效协同纤维素酶水解木质纤维素，并且具有丰富的底物谱，使得纤维素酶水解产还原糖量提高1.5‑7.6倍，在能源、饲料和食品等行业中具有很好的应用前景。

Description

用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因及其非催化蛋 白和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因及其非催化蛋白和应用。
背景技术
纤维素作为地球上数量最多、分布最广的有机物，经处理后转化为生物能源和化工制品对于人类可持续发展有着重要的意义。纤维素是多糖化合物，需转变为单糖才可以被进一步利用。传统的降解纤维素的方法主要是酸解和酶解。酸解法处理纤维素在生成葡萄糖的同时，也会产生甲基糖醛等副产物，降低了葡萄糖生成率；众多副产物会对下游微生物具有抑制或毒害作用。利用纤维素酶水解纤维素较化学处理有几方面优势，如高转化率和低副产物、反应条件温和、反应环境非腐蚀、还有能量需求低等特点，因此酶解法是较为可行的方法。
但是在目前纤维素酶的应用方面面临着众多的瓶颈，由于纤维素的高度结晶结构，以及底物的组分复杂，导致纤维素酶的酶解效率很低。目前许多学者针对这一问题展开一系列的研究，其中一种有效的途径是在酶解过程中添加酶解助剂如非离子表面活性剂以及生物表面活性剂等方法，可以增加纤维素酶法糖化得率。但非离子表面活性剂或者生物表面活性剂大都比较昂贵，极大的提高了纤维素酶解的成本，并且Tween助剂等表面活性剂在使用过程中容易产生气泡，危及工业的安全性。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因，本发明的非催化蛋白基因编码的重组非催化蛋白具有高效协同纤维素酶水解纤维素的能力，可使纤维素酶水解纤维素产还原糖量的效率显著提高。
本发明还提供所述用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白、重组载体、工程菌和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因，所述非催化蛋白基因包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2中任意一种，其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别为密码子优化和突变序列，SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1的突变序列；SEQ ID NO.1-2分别命名为非催化蛋白SY1基因，非催化蛋白SY1mut基因。
本发明所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因编码的非催化蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3-4所示；SEQID NO.3-4分别命名为非催化蛋白SY1，非催化蛋白SY1mut。
本发明所述的重组载体包括所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因中的任意一种或者多种。
本发明所述的重组载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)选取非催化蛋白的氨基酸序列，去除信号肽，根据去除信号肽部分核苷酸序列经密码子优化后合成SEQ ID NO.1的基因；或者在SEQ ID NO.1基础上进行易错PCR扩增，获得SEQ ID NO.2的基因；
(2)合成基因与pET-22b(+)质粒载体进行无缝连接，构建重组表达质粒；突变基因与pET-22b(+)质粒载体进行双酶切后进行连接，构建重组质粒。
本发明所述的重组菌，包括所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因或者所述的重组载体。
其中，所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以E.coli BL21作为宿主细胞。
其中，所述重组菌通过诱导蛋白表达、纯化从而获得重组非催化蛋白。
本发明所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因在促进纤维素酶水解木质纤维素中的应用。
本发明所述的非催化蛋白在促进纤维素酶水解木质纤维素中的应用。
其中，所述非催化蛋白基因或者非催化蛋白在协同纤维素酶水解木质纤维素产还原糖中的应用。
其中，所述非催化蛋白和纤维素酶混合反应，获得木质纤维素的水解液进行底物中木质纤维素水解，所述底物为滤纸、棕榈粕、微晶纤维素、水稻秸秆一种或者多种；所述纤维素酶购自国药。
本发明提出了非催化蛋白SY1及其编码基因与在促进木质纤维素酶酶解中的应用。其中非催化蛋白SY1基因全长1785bp，编码595个氨基酸，含有36个氨基酸的信号肽序列，去除信号肽后，进行密码子优化，合成的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。以pET-22b(+)为表达质粒，以大肠杆菌E.coli BL21为表达宿主，实现了该非催化蛋白的高效表达。将该非催化蛋白应用于促进木质纤维素酶酶解，将木质纤维素加入缓冲液中，再加入0.2mg/ml的非催化蛋白和0.03-0.15PFU/g的纤维素酶，在50℃温度下反应12-24h，获得木质纤维素的水解液。
同时本发明还构建了非催化蛋白SY1突变体，非催化蛋白的170位T(苏氨酸)突变为H(组氨酸)，254V(缬氨酸)突变为F(苯丙氨酸)，385位N(天冬酰胺)突变D为(酪氨酸)。
本发明首次将该非催化蛋白或者非催化蛋白突变体在大肠杆菌中表达并将重组的非催化蛋白或者非催化蛋白突变体应用于促进木质纤维素酶酶解反应中。本发明通过添加该非催化蛋白或者非催化蛋白突变体，可以高效协同纤维素酶水解木质纤维素，使得纤维素酶水解产还原糖量提高1.5-7.6倍，在能源、饲料和食品等行业中具有很好的应用前景。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明提出了序列SEQ ID NO.1-2非催化蛋白基因和序列SEQ ID NO.3-4非催化蛋白，将非催化蛋白基因进行异源表达并研究其功能，提出特定的非催化蛋白基因和非催化蛋白具有高效协同纤维素酶水解纤维素的能力。
2、本发明通过在纤维素酶中添加该非催化蛋白，可以高效协同纤维素酶水解木质纤维素，并且具有丰富的底物谱，使得纤维素酶水解产还原糖量提高1.5-7.6倍，在能源、饲料和食品等行业中具有很好的应用前景。
附图说明
图1非催化蛋白SY1表达纯化SDS-PAGE图。A:SY1的表达图，泳道1为未诱导表达细胞破碎液上清，泳道2-5为诱导表达细胞破碎液上清(IPTG浓度为分别为0.5mM,0.3mM,0.1mM and 0.05mM)，泳道6为蛋白质marker。B:SY1的纯化图，泳道1为蛋白质marker，泳道2为纯化的目的蛋白SY1。
图2易错PCR琼脂糖电泳图。泳道1为DNA marker，泳道2-5为PCR产物。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
生化试剂：基因的克隆表达酶类及试剂购于TaKaRa公司，纤维素酶购于国药公司。
表达宿主大肠杆菌(Escherichia coli)株系BL21和pET-22b(+)为均为市售可得。
实施例1
根据Genebank中非催化蛋白的序列(NC_012034.1)进行密码子优化，由通用生物公司合成SEQ ID NO.1非催化蛋白SY1基因，并与质粒pET-22b(+)无缝克隆连接(通用生物公司合成重组质粒)，即获得重组质粒pET-22b(+)/SY1，非催化蛋白SY1基因其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
将重组质粒pET-22b(+)/SY1在42℃热击90s转化宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含氨苄青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子，接入LB液体培养基中37℃培养过夜，转接至新鲜的LB培养基中37℃培养至OD600nm达0.6-0.8，添加终浓度0.05-0.5mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)在16℃下进行产酶诱导16h，非催化蛋白SY1成功表达(图1A)。
将重组菌发酵液于4℃，8000rpm离心10min，去除上清；离心收集的细胞悬浮于缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH7.5)中，制备成菌悬液；菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200W功率下工作300次，每个循环工作2s停9s；细胞裂解液4℃下10，000rpm离心30min，所得上清液即为无细胞抽提液。取无细胞抽提液用0.45μm滤膜过滤制备成上样样品，将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，冲柱流速2mL/min，而后对样品进行上柱，上柱流速1mL/min，待完全吸附后，分别用含缓冲液A～含500mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，洗脱流速2mL/min，分别收集各阶段洗脱峰，收集50mM咪唑洗脱获得纯化的催化蛋白SY1(图1B)，作为后续实验的纯化蛋白。
以pET-22b(+)/SY1质粒作为易错PCR的DNA模板，根据SEQ ID NO.1，设计易错PCR引物，见表1。PCR反应条件：95℃、5min；95℃、10s，55℃、5s，72℃、90s，30个循环；72℃、10min。反应体系如表2所示。
表1易错PCR引物
引物名称 引物序列
PF CGCGGATCCAGCAGTAAACTGGGTGACA
PR CCGCTCGAGTTCCAGTTCAACCACCTTGA
表2易错PCR反应体系
Figure BDA0003450220270000041
Figure BDA0003450220270000051
用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离(图2)。将目的片段割胶回收，目的片段和载体用BamHI和XholI双酶切后，经T4连接酶连接过夜构建突变体重组质粒。非催化蛋白突变体重组菌的构建以及非催化蛋白突变体的纯化方法同非催化蛋白。
对纯化蛋白进行协同能力的测定，反应体系为：10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.6)，20mg/ml的滤纸，0.03FPU/g纤维素酶，0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应12h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。结果发现其中突变株SY1mut协同能力突出。提取质粒，对质粒进行测序，获得突变的碱基序列SEQ ID NO.2。将SEQ ID NO.2进行蛋白翻译后获得SEQ ID NO.4，发现该突变与SEQ ID NO.3相比为：170位T(苏氨酸)突变H(组氨酸)，254V(缬氨酸)突变为F(苯丙氨酸)，385位N(天冬酰胺)突变D(酪氨酸)。
以羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、滤纸、棕榈粕、水稻秸秆为底物测定SY1和SY1突变体的催化水解酶活，反应体系为：非催化蛋白浓度0.2mg/mL，羧甲基纤维素浓度为2mg/ml，其他底物的浓度为20mg/ml，反应温度50℃，水解时间为24h。结果发现SY1和SY1突变体对这些底物均没有水解活性，确定SY1和SY1mut为没有催化活性的蛋白。
实施例2
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.03FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到)、20mg/ml的滤纸，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应12h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
实施例3
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.09FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到)、20mg/ml的滤纸，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应12h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
实施例4
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.03FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到)、20mg/ml的滤纸，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应24h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
实施例5
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.09FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到、20mg/ml的滤纸，，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应24h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
实施例6
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.09FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到)、20mg/ml的棕榈粕，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应12h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
实施例7
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.15FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到)、20mg/ml的棕榈粕，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应12h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
实施例8
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.09FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到)、20mg/ml的棕榈粕，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应24h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
实施例9
10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)反应体系，包括0.15FPU/g纤维素酶、0.2mg/mL非催化蛋白SY1或者非催化突变蛋白SY1mut(实施例1纯化得到)、20mg/ml的棕榈粕，以不加非催化蛋白的同样体系为对照，50℃反应24h离心取上清，用DNS测定还原糖的含量。
表3非催化蛋白SY1协同纤维素酶水解木质纤维素情况
Figure BDA0003450220270000061
Figure BDA0003450220270000071
从实施例2-9的表3结果可知，非催化蛋白SY1协同纤维素酶降解滤纸或者棕榈粕的葡萄糖产量比纤维素酶单独降解的葡萄糖产量提高了1.5～5.0倍，无论协同水解时间是12h还是24h，以滤纸和棕榈粕作为底物的协同水解效果都优于单一的纤维素酶水解，可见非催化蛋白SY1对纤维素酶降解有协同作用，可以提高纤维素酶对滤纸或者棕榈粕的降解效率。
而采用本发明的非催化突变蛋白SY1mut协同纤维素酶降解滤纸的葡萄糖产量比纤维素酶单独降解的葡萄糖产量提高了2.2-7.6倍，效果更优于非催化蛋白SY1协同纤维素酶降解滤纸和棕榈粕的效果，本发明的突变蛋白SY1mut可以进一步提高还原糖产量倍数，效果非常的显著，产还原糖量可以达到753.2μg/ml。同时实验发现采用本发明的突变蛋白，当延长水解时间为24h和增加纤维素酶用量，水解滤纸和棕榈粕时其还原糖产量倍数也会进一步提高，优于单一延长时间或者增加酶量的提高倍数，说明延长水解时间和增加纤维素酶用量对于突变蛋白的产还原糖产量倍数有协同促进作用。协同的底物不限于滤纸和棕榈粕，其他的纤维素底物如水稻秸秆、微晶纤维素，均有协同作用。
序列表
<110> 淮阴工学院
<120> 用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因及其非催化蛋白和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列(SY1Artificial Sequence)
<400> 1
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attaataagc gcgcaatgga ttatgccttt aaatataatg gccattacta cctggcaagt 360
cagaaaggca gtaatgttcc gtggctggtt atctataata aggatctgat gctggaagaa 420
ggcattgatg aagaagaaat gccgctggcc ctgtataaaa aaggtcgttg gaattgggat 480
acctttgcag cactggcaaa aaagctgcac gccgatacca ataaggatgg caaaattgat 540
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ccggaaaaag tgaaaatcta tggttggcat gattataccg ttagttttga tgttaaggtg 1440
ctgaaagcac ctaaagcagg caaaaccacc gttgtgtgta gcattctgaa tgataccaaa 1500
ccgaatgcca ccagctatgg tagtattacc aaaaccattg ataagggcca gaccgtgtat 1560
catgttgaag gcaatattac caatatcccg gataatagcg ataaaatgtg tctgcgtatt 1620
ggcgtgcagg aaggtgttga ttttgtgatt gataatatca aggtggttga actggaa 1677
<210> 3
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列(SY1Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Ser Lys Leu Gly Asp Ile Ser Phe Leu Arg Pro Gly Phe Ser Lys
1 5 10 15
Glu Ser Leu Lys Ser Thr Asp Ile Phe Asn Lys Ala Val Ala Lys Ala
20 25 30
Ile Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Tyr Gly Gly Lys Val Asn Ile Val Tyr
35 40 45
Ser Asp Trp Asn Asn Trp Gln Thr Lys Ile Ile Ala Arg Met Ala Ala
50 55 60
Gly Asp Pro Ile Asp Val Ile Phe Gly Gly Thr Gly Thr Phe Pro Ala
65 70 75 80
Phe Tyr Asn Arg Gly Leu Val Gln Pro Leu Asp Lys Tyr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Ala Pro Tyr Ile Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr Ala Phe Lys Tyr
100 105 110
Asn Gly His Tyr Tyr Leu Ala Ser Gln Lys Gly Ser Asn Val Pro Trp
115 120 125
Leu Val Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Met Leu Glu Glu Gly Ile Asp Glu
130 135 140
Glu Glu Met Pro Leu Ala Leu Tyr Lys Lys Gly Arg Trp Asn Trp Asp
145 150 155 160
Thr Phe Ala Ala Leu Ala Lys Lys Leu Thr Ala Asp Thr Asn Lys Asp
165 170 175
Gly Lys Ile Asp Arg Tyr Gly Val Asn Phe Trp Ala Ala Thr Ala Ile
180 185 190
Val Tyr Ala Asn Gly Thr Gln Phe Val Lys Val Asp Ser Ser Gly Lys
195 200 205
Gly Lys Val Asn Phe Asp Asn Pro Ala Leu Gln Arg Ala Leu Asn Phe
210 215 220
Tyr Lys Lys Gly Ala Lys Glu Gly Trp Leu Ala Arg Asp Trp Asp Ile
225 230 235 240
Thr Val Ser Gly Leu Lys Lys Arg Gln Thr Val Met Leu Val Ala Pro
245 250 255
Gln Tyr Lys Phe Asp Gln Asp Lys Arg Glu Val Glu Asp Glu Leu Glu
260 265 270
Ala Ala Pro Leu Pro Leu Gly Pro Asp Asn Lys Ser Gly Leu Tyr Pro
275 280 285
Phe Asp Ala Asp Gly Tyr Gly Ile Met Lys Gly Ser Lys Asn Pro Val
290 295 300
Gly Ala Gly Lys Phe Ile Asn Leu Leu Leu Glu Ser Val Gln Lys Asn
305 310 315 320
His Asp Asp Val Asn Ala Lys Asn Arg Pro Lys Tyr Leu Val Asp Phe
325 330 335
Val Asn Lys Leu Ala Glu Lys Ser Phe Tyr Pro Gly Leu Gly Glu Ser
340 345 350
Met Leu Gly Met Pro His Trp Asp Ile Phe Gly Arg Val Asp Ser Ser
355 360 365
Asp Ser Val Ala Ala Ala Leu Ser Ser Leu Arg Pro Gln Val Glu Lys
370 375 380
Asn Val Lys Glu Ala Ser Ala Gly Ala Ile Asn Ala Val Tyr Lys Pro
385 390 395 400
Phe Lys Pro Phe Thr Ile Asn Phe Glu Asp Gly Lys Leu Asp Thr Phe
405 410 415
Lys Val Leu Asp Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Leu Ser Ile Ala Ser
420 425 430
Gly Lys Glu Ala Ile Lys Gly Lys Ser Leu Lys Val Thr Trp Asp Gln
435 440 445
Gly Lys Asp Gly Gly Glu Ile Tyr Val Val Thr Ala Pro Glu Lys Val
450 455 460
Lys Ile Tyr Gly Trp His Asp Tyr Thr Val Ser Phe Asp Val Lys Val
465 470 475 480
Leu Lys Ala Pro Lys Ala Gly Lys Thr Thr Val Val Cys Ser Ile Leu
485 490 495
Asn Asp Thr Lys Pro Asn Ala Thr Ser Tyr Gly Ser Ile Thr Lys Thr
500 505 510
Ile Asp Lys Gly Gln Thr Val Tyr His Val Glu Gly Asn Ile Thr Asn
515 520 525
Ile Pro Asp Asn Ser Asp Lys Met Cys Leu Arg Ile Gly Val Gln Glu
530 535 540
Gly Val Asp Phe Val Ile Asp Asn Ile Lys Val Val Glu Leu Glu
545 550 555
<210> 4
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列(SY1mutArtificial Sequence)
<400> 4
Ser Ser Lys Leu Gly Asp Ile Ser Phe Leu Arg Pro Gly Phe Ser Lys
1 5 10 15
Glu Ser Leu Lys Ser Thr Asp Ile Phe Asn Lys Ala Val Ala Lys Ala
20 25 30
Ile Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Tyr Gly Gly Lys Val Asn Ile Val Tyr
35 40 45
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530 535 540
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Claims (10)

1.一种用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因，其特征在于，所述非催化蛋白SY1基因包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2中任意一种，其中SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1的突变序列。
2.一种权利要求1所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因编码的非催化蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4任意所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求1所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因中的任意一种或者多种。
4.一种权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取非催化蛋白的氨基酸序列，去除信号肽，根据去除信号肽部分核苷酸序列经密码子优化后合成SEQ ID NO.1；或者在SEQ ID NO.1基础上进行易错PCR扩增，获得SEQ IDNO.2的基因；
(2)合成的基因与pET-22b(+)质粒载体进行无缝连接，构建重组表达质粒；突变基因与pET-22b(+)质粒载体进行双酶切后进行连接，构建重组质粒。
5.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌包括权利要求1所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白SY1基因或者权利要求4所述的重组载体。
6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌以Escherichia coli BL21作为宿主细胞。
7.一种权利要求1所述的用于促进木质纤维素酶酶解的非催化蛋白基因在促进纤维素酶水解木质纤维素中的应用。
8.一种权利要求2所述的非催化蛋白在促进纤维素酶水解木质纤维素中的应用。
9.根据权利要求7或者8所述的应用，其特征在于，所述非催化蛋白基因或者非催化蛋白在协同纤维素酶水解木质纤维素产还原糖中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述非催化蛋白和纤维素酶混合反应，获得木质纤维素的水解液进行底物中木质纤维素水解，所述底物优选为滤纸、棕榈粕、微晶纤维素、水稻秸秆一种或者多种。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995002675A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Novo Nordisk A/S A detergent composition comprising two cellulase components
CN101423853A (zh) * 2007-11-02 2009-05-06 中国科学院过程工程研究所 一种利用秸秆细胞壁蛋白构建的高效纤维素酶解体系
CN102311960A (zh) * 2011-07-13 2012-01-11 深圳大学 一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995002675A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Novo Nordisk A/S A detergent composition comprising two cellulase components
CN101423853A (zh) * 2007-11-02 2009-05-06 中国科学院过程工程研究所 一种利用秸秆细胞壁蛋白构建的高效纤维素酶解体系
CN102311960A (zh) * 2011-07-13 2012-01-11 深圳大学 一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RENATA等: "Protective effects of non-catalytic proteins on endoglucanase activity at air and lignin interfaces", 《BIOTECHNOLOGY PROGRESS》, pages 3134 *
ROVERA等: "Enzymatic hydrolysis of bacterial cellulose in the presence of a non-catalytic cerato-platanin protein", 《JOURNAL OF APPLIED POLYMER SICENCE》, pages 51886 *
UNIPROT: "B9MMA1", 《UNIPROT》, pages 9 *
刘南 等: "纤维素降解辅助蛋白及其作用机理研究进展", 《化工进展》, pages 1118 - 1129 *
肖芳: "产纤维素酶增效蛋白放线菌的筛选及增效蛋白的分离纯化研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》, pages 016 - 274 *

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