CN102070711A

CN102070711A - 组织因子途径抑制物及其制备和应用

Info

Publication number: CN102070711A
Application number: CN 201010544921
Authority: CN
Inventors: 张敏; 孙黎
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2011-05-25

Abstract

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是组织因子途径抑制物及其制备和应用。组织因子途径抑制物TFPI-1如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示；组织因子途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。其制备方法：将质粒pE15TFPI1和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI2，将其用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后通过亲和层析纯化重组蛋白，即为TFPI-1和TFPI-2。所述组织因子途径抑制物具有高效杀菌作用，因此可以抵抗细菌感染，用于疾病防治。本发明的TFPI可以有效裂解多种致病菌，从而抑制细菌感染。

Description

组织因子途径抑制物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)及其制备和应用。

背景技术

组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是一种天然抗凝蛋白，能够抑制组织因子(tissue factor，TF)介导的凝血激活。TFPI的作用机制在于它能与Xa因子形成一个稳定的复合物TFPI-Xa，从而使Xa失活。TFPI-Xa还能够抑制TF与VIIa因子的复合物，从而阻碍Xa的产生。TFPI包括两种类型，即TFPI-1和TFPI-2，二者均有抑制凝血作用。研究表明，人类TFPI-1参与天然免疫以及炎症反应过程，TFPI-2则具有丝氨酸蛋白酶抑制因子活性并且在肿瘤细胞生长和转移过程中起重要作用。最近动物模型研究发现，纯化的重组人类TFPI-1能够缓解人工感染引起的败血症症状，但其具体机制尚不清楚。

发明内容

本发明目的在于提供组织因子途径抑制物TFPI及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种组织因子途径抑制物：组织因子途径抑制物TFPI-1如序列表SEQID No.1中氨基酸序列所示；组织因子途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ IDNo.2中氨基酸序列所示。

组织因子途径抑制物的构建方法：

1)质粒pE15TFPI1的构建：

以美国红鱼cDNA为模板，用引物TP1F1和TP1R1进行PCR扩增，扩增产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSTP1；

将上述质粒pBSTP1和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0.78kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为pE15TFPI1；

2)质粒pE15TFPI2的构建：

以美国红鱼cDNA为模板，用引物TP2F1和TP2R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSTP2；

将上述质粒pBSTP2和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0.6kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pE15TFPI2；

3)组织因子途径抑制物TFPI-1和TFPI-2的制备：

将上述步骤1)和2)的质粒pE15TFPI1和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选转化子即为BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI2。将BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI分别于含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养OD600为0.6，并加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再以37℃继续培养4-5小时，而后用nickel-nitrilotriaceticacid亲和层析柱纯化重组蛋白，即分别为序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-2。

所述步骤1)中引物TP1F1和TP1R1分别为TP1F1：5’-GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA-3’和TP1R15’-GATATCGATGGAGCGATGAAGAAT-3’。

所述步骤2)中引物TP2F1和TP2R1分别为TP2F15’-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTGT-3’和TP2R1 5’-GATATCAGCCTGCAAGAAAGTGATG-3’。

组织因子途径抑制物的应用：所述序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列组织因子途径抑制物TFPI-1和序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列组织因子途径抑制物TFPI-2可作为鱼类细菌的杀菌剂。

本发明具有如下优点：

1.稳定表达。本发明的细菌表达系统可以稳定高效地表达TFPI。

2.高效抑菌作用。本发明的TFPI可以有效裂解多种致病菌，从而抑制细菌感染。

附图说明

图1为本发明实施例纯化得到的TFPI-1电泳图谱，(其中纯化得到的TFPI-1为泳道2，泳道1为分子量marker。)。

图2.本发明实施例纯化得到的TFPI-1电泳图谱，(其中纯化得到的TFPI-2为泳道2，泳道1为分子量marker。)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

组织因子途径抑制物TFPI-1如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示；组织因子途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。

序列表SEQ ID No.1为：

MAPVKWWILCAVLLCCVPRFGSCRRDRQADGPLPELFIFNELCALKDEPGPCKAIKDRFFFNVDTGHCELFEYGGCGGNA

NNFETLEDCEETCVVSDNKNPCHLAEAPGPCRGLVTRYFFDSGSQQCKHFYYGGCFGNANNFKSMAECQAKCQNPENPTK

APEVHTQPAGKSNVVQPTILTGEMTVSEPQVQTNETHKNPKVLRPTELCFDPVDRGTCQGSEKRFAYNPITKRCHAFSYS

GCGGNRNNFAYRKDCMIKCRRRKVHGPMIRIRKKNLDNILHRSI

(a)序列特征：

●长度：284

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：美国红鱼

结构特征：该蛋白的最明显结构特征是含有3个Kunitz结构，分别由氨基酸41-94，100-153，以及207-260构成。

序列表SEQ ID No.2为：

MEFCTLTLVALFSTFYNVLALSPKGVCLLQVDEGPCRGEIERYYYNTITQKCEIFYYGGCQGNANNFKSYQECQKTCFRI

PKIPQICRFPKEEGPCRALLHRYFFNMTTMQCESFSYGGCQGNMNRFQDLTSCMEYCSPRKTVPVLCLDPLDKGRCSASI

PRYYYNTATKMCEEFIYSGCGGSSNNFVSRQSCMDVCVKGGKKYKRQGKGHRMRRYRNNHITFLQA

(a)序列特征：

●长度：226

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：美国红鱼

结构特征：该蛋白的最明显结构特征是含有3个Kunitz结构，分别由氨基酸25-78，85-138，以及145-198构成。

实施例2

组织因子途径抑制物TFPI-1和TFPI-2的制备方法：

1)质粒pE15TFPI1的构建：

以美国红鱼cDNA为模板，用引物TP1F1和TP1R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，52℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应7-10min。PCR产物纯化后与载体pBS-T(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSTP1。

将上述质粒pBSTP1和质粒pET259(质粒pET259的构建过程参见Zheng，W.J.，Hu，Y.H.，Sun，L.，2010.Cloning and analysis of a ferritinsubunit from turbot(Scophthalmus maximus).Fish.Shellfish.Immunol.28(5-6)，829 836.)分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0.78kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pE15TFPI1。

所述引物TP1F1和TP1R1分别为：TP1F1为5’-GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA-3’，TP1R1为5’-GATATCGATGGAGCGATGAAGAAT-3’。

2)质粒pE15TFPI2的构建：

以美国红鱼cDNA为模板，用引物TP2F1和TP2R1进行PCR扩增。PCR条件与步骤1)相同。PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含100ug/ml的安卡青霉素、40ug/ml的Xgal、24ug/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSTP2。

将上述质粒pBSTP2和质粒pET259(质粒pET259的构建过程参见Zheng，W.J.，Hu，Y.H.，Sun，L.，2010.Cloning and analysis of a ferritinsubunit from turbot(Scophthalmus maximus).Fish.Shellfish.Immunol.28(5-6)，829 836.)分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0.6kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，在含50ug/ml的卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pE15TFPI2。

所述引物TP2F1为5’-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTGT-3’，TP2R1为5’-GATATCAGCCTGCAAGAAAGTGATG-3’。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水。

3)组织因子途径抑制物TFPI-1和TFPI-2的表达和制备：

将步骤1)和2)的质粒pE15TFPI1和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含50ug/ml的卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI2。将BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI分别于含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使培养基中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度达到1mM，37℃继续摇动培养4-5小时，而后用GE Healthcare(美国)公司的nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯化重组蛋白(层析条件：用4-5ml Wash buffer洗柱两次，随后用0.5-1ml Elution buffer洗柱，收集所有洗脱液)。将洗脱液中的重组蛋白进行N-端氨基酸测序，证实其分别为序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-2。

上述Wash buffer成分为：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0；上述Elution buffer成分为：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mMimidazole，pH 8.0.

实施例3

组织因子途径抑制物TFPI-1和TFPI-2的应用

1)迟缓爱德华氏菌制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TX1(保存于CGMCC，编号为CGMCC No.2330)至OD₆₀₀为0.5，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁵cfu/ml。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na₂HPO₄.12H₂O，0.024％NaH₂PO₄。

2)组织因子途径抑制物TFPI-1和TFPI-2杀菌效应。将20ul上述步骤1)的菌液分别与0.5uM实施例2制备的TFPI-1、TFPI-2和PBS(对照)混合，于25℃保温3-5h。随后将混合液涂布于LB固体平板，28℃培养32-48h。菌落计数发现，与PBS相比，TFPI-1和TFPI-2处理导致细菌数目减低约90％，即约90％的细菌被TFPI-1和TFPI-2杀死。

另将上述实施例2制备的TFPI-1和TFPI-2处理鳗弧菌，处理过程按照上述操作，与PBS相比，TFPI-1和TFPI-2处理导致细菌数目减低约90％，即约90％的细菌被TFPI-1和TFPI-2杀死。因此，TFPI-1和TFPI-2具有良好的杀菌效应，可防止鱼类细菌性病害，既可作为鱼类细菌的杀菌剂。

Claims

1.一种组织因子途径抑制物，其特征在于：组织因子途径抑制物TFPI-1如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示；组织因子途径抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。

2.一种权利要求1所述的组织因子途径抑制物的构建方法，其特征在于：

1)质粒pE15TFPI1的构建：

2)质粒pE15TFPI2的构建：

将上述质粒pBSTP2和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和Swa I酶切后回收0.6kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pE15TFPI2；

3)组织因子途径抑制物TFPI-1和TFPI-2的制备：

将上述步骤1)和2)的质粒pE15TFPI1和pE15TFPI2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选转化子即为BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI2。将BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI分别于含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养OD₆₀₀为0.6，并加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再以37℃继续培养4-5小时，而后用nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯化重组蛋白，即分别为序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示的组织因子途径抑制物TFPI-2。

3.按权利要求2所述的组织因子途径抑制物的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中引物TP1F1和TP1R1分别为TP1F1：5’-GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA-3’和TP1R15’-GATATCGATGGAGCGATGAAGAAT-3’。

4.按权利要求2所述的组织因子途径抑制物的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中引物TP2F1和TP2R1分别为TP2F15’-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTGT-3’TP2R1 5’-GATATCAGCCTGCAAGAAAGTGATG-3’。

5.一种权利要求1所述的组织因子途径抑制物的应用，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列组织因子途径抑制物TFPI-1和序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列组织因子途径抑制物TFPI-2可作为鱼类细菌的杀菌剂。