CN103421100B - 一种抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗菌肽及其制备方法和应用，所述抗菌肽包含下述SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列：SEQ？ID？NO:1：GFGC₄PFNENEC₁₁HAH？C₁₅LSIGRKFGFC₂₅AGPLRATC₃₃TC₃₅GKQ，所述氨基酸序列中的6个半胱氨酸经氧化形成三对分子间二硫键，所述三对分子间二硫键分别为第4、25位半胱氨酸、第11、33位半胱氨酸和第15、35位半胱氨酸间形成的分子间二硫键；所述抗菌肽用于抗细菌，成为研发抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢杆菌的多肽类药物先导。

Description

一种抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物制药技术领域。

背景技术

抗生素主要是由真菌和一些土壤细菌分泌的能杀死或抑制其它微生物生长的天然化合物。这些化合物及其衍生物在感染性疾病的预防和治疗中发挥关键作用。可是，由于长期广泛的使用，很多先前对抗生素敏感的病原菌产生了抗药性。如青霉素抗性的肺炎双球菌，青霉素和四环素抗性的淋球菌等。同时，一些条件致病菌也已经发展成为多重耐药性的高度致死的病原菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肠球菌、军团菌和黑曲霉等。因此，发展新型特效的抗生素药物已迫在眉睫。作为天然免疫效应分子的抗微生物肽为这一挑战带来了新的契机。

抗微生物肽是一类进化上古老的宿主防御分子，存在于几乎所有的细胞型生物中。不同的生态位和复杂的微生物环境驱动了抗微生物肽基因的加速变异并导致了广泛的序列多样性。与传统抗生素相比，抗微生物肽具有明显的优势。主要表现在，这些分子具有独特的抗菌机理，能够延缓细菌耐药性的产生。例如，大多数抗微生物肽通过直接作用和破坏细菌细胞膜达到抗菌效果。为了产生抗药性，细菌必须改变细胞膜的组分，而膜组分的任何改变都将导致细菌突变体生存能力的显著下降。另外，抗微生物肽是抗感染药物分子设计的理想模板。对天然抗微生物肽进行人工修饰能够显著提高其抗菌活性和/或结构稳定性。例如，一些防御肽在生理盐浓度条件下缺乏活性，但是环化修饰使其盐浓度敏感性消失，抗微生物活性增加。另外，一些抗微生物肽功能趋异(抗微生物/免疫调节功能)的结构元件定位于多肽分子的不同区域，为合理定向化工程设计特定功能的药物提供了可能。

虽然具有诱人的前景，但是开发人体和哺乳动物抗微生物肽面临两大挑战：一是潜在的细胞毒性限制了其全身使用；二是缺乏血清稳定性，影响了活体水平效能。因此，目前绝大多临床试验的抗微生物肽主要用于治疗局部细菌性感染。为了克服这些缺陷，一些新的来源的抗微生物肽正在被开发利用。

菌丝霉素(Plectasin)是丹麦Novozymes公司以及美国科学家从欧洲腐生真菌Pseudoplectanianigrella鉴定到的第一个来源于真菌的防御素。在动物模型实验中，该分子能够有效治疗肺炎链球菌等革兰氏阳性细菌引起的感染(MygindPH,etal.(2005)Plectasinisapeptideantibioticwiththerapeuticpotentialfromasaprophyticfungus.Nature437:975-980)。但是，菌丝霉素对于引发人类严重感染性疾病的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)以及铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)没有报道。

发明内容

因此，本发明的目的是针对目前没有能够有效抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)的抗菌肽的不足，提供一种抗菌肽及其制备方法和应用，能够有效地抗甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌，确立真菌抗微生物肽基因家族药物开发潜能。

除非另外指明，本文中的“MRSA”均是指“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌”。

除非另外指明，本文中的“PBS”均是指“磷酸盐缓冲液”。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种抗菌肽前体，所述抗菌肽前体的序列包含下述SEQIDNO:1所示的氨基酸序列：

GFGC₄PFNENEC₁₁HAHC₁₅LSIGRKFGFC₂₅AGPLRATC₃₃TC₃₅GKQ。

优选地，所述抗菌肽前体的序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供一种抗菌肽，所述抗菌肽由本发明所述的抗菌肽前体的氨基酸序列中的6个半胱氨酸经氧化形成三对分子间二硫键而成，所述三对分子间二硫键分别为第4、25位半胱氨酸、第11、33位半胱氨酸和第15、35位半胱氨酸间形成的分子间二硫键。

优选地，所述抗菌肽来源于犬小孢子菌的防御素，命名为孢子霉素(Micasin)。

还一方面，本发明提供一种编码本发明所述的抗菌肽前体或本发明所述的抗菌肽的DNA序列，所述DNA序列具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。

再一方面，本发明提供一种制备编码本发明所述的抗菌肽前体或本发明所述的抗菌肽的DNA序列的引物，包括第一、二次PCR的上游引物和第一、二次PCR的下游通用引物，所述第一次PCR的上游引物为SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；所述第二次PCR的上游引物为SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述第一、二次PCR的下游通用引物均为SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供本发明编码所述的抗菌肽前体或抗菌肽的DNA序列的制备方法，包括通过巢式PCR从犬小孢子菌中扩增获得所述DNA序列。

优选地，所述巢式PCR的第一次PCR的上游引物为SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；所述巢式PCR的第二次PCR上游引物为SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述巢式PCR的第一、二次PCR的下游通用引物均为SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。

再一方面，本发明提供一种抗菌肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：人工合成抗菌肽的直线肽，再利用反相高效液相色谱法对折叠产物进行分离纯化，即得。

优选地，当制备本发明所述的抗菌肽时，合成抗菌肽前体后，还包括在碱性条件下将所述抗菌肽前体进行空气氧化折叠，形成分子内二硫键的步骤，利用该条件能够准确地形成分子内二硫键，且方法简单，易于操作，复性效率高，降低成本。

优选地，将所述抗菌肽前体溶解于150mMTris-HCl(pH8.3)中，形成浓度为5mg/ml的抗菌肽前体溶液，再将该溶液置于空气中，于24℃氧化48小时，形成分子内二硫键。

还一方面，本发明提供一种用于抗细菌的药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的抗菌肽和药学上可接受的辅料或载体。

优选地，所述抗菌肽的致死浓度为0.054～4.24μΜ/L。

优选地，所述辅料为NaCl溶液，优选地，所述NaCl溶液为质量体积比为0.9％的NaCl溶液。

又一方面，本发明提供一种本发明所述的抗菌肽前体、本发明所述的抗菌肽或本发明所述的药物组合物在制备用于抗细菌的药物中的应用。

优选地，所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。

优选地，所述革兰氏阳性菌选自巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和葡萄球菌。

优选地，所述金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。

优选地，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单孢菌和/或根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

优选地，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单孢菌。

本发明实用于研发抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA和铜绿脓假单孢杆菌的多肽类药物先导。

MRSA和铜绿脓假单孢杆菌是两种主要的人类条件致病菌。其中，前者能够引起菌血症、心内膜炎、肺炎和中枢神经系统的感染，被称为“超级细菌”，缺乏高选择性特效药物。从发现至今MRSA的感染已经几乎遍及全世界；而后者为医院内感染的最常见的条件致病菌之一，非常难以治疗。

本发明所述的抗菌肽为临床开发治疗这两类感染的药物提供了可能，具有十分广阔的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明所述的抗菌肽的氨基酸序列和其他真菌来源的防御素氨基酸序列的比对结果，图中1为菌丝霉素(Plectasin)(SEQIDNO:3)，2为本发明所述的抗菌肽即孢子霉素(Micasin)；

图2为克隆的编码本发明所述的抗菌肽的cDNA序列的结果，其中，图2a为巢式PCR第一次扩增的结果，图中，1为孢子霉素第一次扩增的结果，2为DNA标记(Marker)；图2b为巢式PCR第二次扩增的结果，图中，1为DNA标记(Marker)，2为孢子霉素第二次扩增的结果；

图3为本发明所述的抗菌肽的结构鉴定结果，其中，图3a为所述的抗菌肽的串联飞行时间质谱(MAIDI-TOF)鉴定结果，图中，O表示氧化产物；R表示还原产物；图3b为所述的抗菌肽的核磁共振二维谱(核欧佛豪瑟效应频谱)，图中的d_NN(i，i+1)表示：第i个残基的酰胺质子与第(i+1)个残基的酰胺质子之间的距离，角标N代表酰胺质子；d_αN(i，i+1)表示：第i个残基的α-碳原子的质子与第(i+1)个残基的酰胺质子之间的距离；d_{βN (i，i+1)}表示：第i个残基的β-碳原子的质子与第(i+1)个残基的酰胺质子之间的距离；d_NN(i，i+2)表示：第i个残基的酰胺质子与第(i+2)个残基的酰胺质子之间的距离；d_αN(i，i+2)表示：第i个残基的α-碳原子的质子与第(i+2)个残基的酰胺质子之间的距离；d_αN(i，i+3)表示：第i个残基的α-碳原子的质子与第(i+3)个残基的酰胺质子之间的距离；d_αN(i，i+4)表示：第i个残基的α-碳原子的质子与第(i+4)个残基的酰胺质子之间的距离；d_{αβ(i，i+4)}表示：第i个残基的α-碳原子的质子与第(i+4)个残基的β-碳原子的质子之间的距离；图3c为所述的抗菌肽的核磁共振结构，图中，α表示α-螺旋；β表示β-转角；

图4为本发明所述的抗菌肽的杀菌动力学试验结果，其中，图4a为本发明所述的抗菌肽的杀菌速度结果，图4b为本发明所述的抗菌肽对敏感细菌的细胞膜完整性影响的试验结果，图中的C_L是指致死浓度；

图5为透射显微电镜观察本发明所述的抗菌肽的巨大芽孢杆菌细胞的影响结果，其中，图5a为万古霉素对巨大芽孢杆菌细胞的影响结果，图5b为所述的抗菌肽的巨大芽孢杆菌细胞的影响结果，图中的箭头指示蛋白质样颗粒沉淀；

图6为本发明所述的抗菌肽对哺乳动物血细胞的影响结果，其中，图6a为本发明所述的抗菌肽对哺乳血细胞的溶解效应；图6b为本发明所述的抗菌肽在血清中稳定存在的试验结果；

图7为本发明所述的抗菌肽治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株以及铜绿假单孢菌造成的腹腔感染的试验结果，其中图7a为比较孢子霉素和万古霉素对感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠生存率的影响的结果，图7b为比较孢子霉素和万古霉素对感染铜绿假单孢菌的小鼠生存率的影响。

具体实施方式

除非特别指明，本发明以下实施例所用的试验材料：小鼠的品种为ICR小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心。

除非特别指明，本发明以下实施例所用的胃粘膜素(Meucin)购自上海博耀生物科技有限公司。

除非特别指明，本发明以下实施例所用的pGM-T质粒购自天根生化科技(北京)有限公司。

除非特别指明，本发明以下实施例所用的逆转录酶、聚合酶和限制性内切酶均购自北京赛百盛基因技术有限公司。

除非特别指明，本发明以下实施例所用的试剂均为分析纯试剂，且可从常规渠道商购获得。

实施例1本发明所述的抗菌肽的编码序列的获得

利用分子生物学技术，通过巢式PCR扩增(参见Goodeetal.,(2002)NestedRT-PCR.MethodsinMolecularBiology.Volume193,II,65-79)，得到该基因的cDNA克隆。具体试验设计为首先提取犬小孢子菌总RNA，然后用dT3AP引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3(SEQIDNO:4))；再按照以下方法进行逆转录：逆转录条件为取10μl总RNA，1μldT3AP(100μM)，70℃温育5分钟后立即放置冰上；然后将其加入到RT-PreMix反应管中。42℃60分钟合成cDNA合成，最后94℃5分钟灭活逆转录酶。逆转录试剂盒RT-PreMix由北京赛百盛基因技术有限公司提供，按照说明书操作进行逆转录。参见：GaoB,PeigneurS,DazielJ,TytgatJ,ZhuS(2011)Moleculardivergenceoftwoorthologousscorpiontoxinsaffectingpotassiumchannels.CompBiochemPhysiolAMolIntegrPhysiol159:313–321.，逆转录成第一链cDNA用作模板。

两个套式的上游引物序列为：

Mic-F(第一次PCR上游引物)：ATGCAGTTCACCAAGCTTGCCAC(SEQIDNO:5)；

Mic-Fn(第二次PCR上游引物)：ATCCTCCTCGTCTCCCTTATG(SEQIDNO:6)；

下游通用引物均为3AP(CTGATCTAGAGGTACCGGATCC)(SEQIDNO:7)。

PCR扩增体系(10μM上游引物0.5μl；10μM下游通用引物0.5μl；cDNA模板1.0μl；10×PCR缓冲液2μl；dNTPs(10mMeach)0.5μl；ddH₂O15μl；TaqDNA聚合酶0.5μl)。

采用94℃预变性；(94℃45s,60℃45s,721min)x35个循环；72℃延伸的PCR反应条件完成两轮扩增，结果如图2所示。PCR产物纯化后连接到pGM-T质粒。提取阳性克隆的质粒用T7引物(T7：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQIDNO:8))完成DNA测序，测序证明克隆的质粒是目的质粒。

然后，利用获得的cDNA序列，通过比较基因组的方法从模式真菌基因组中发现了一个家族的防御素分子，其中来源于犬小孢子菌的防御素命名为Micasin(中文名称：孢子霉素)。该分子由38个氨基酸组成，序列如下：

GFGCPFNENECHAHCLSIGRKFGFCAGPLRATCTCGKQ，其中6个半胱氨酸形成三对分子内二硫键(图1)。

实施例2本发明所述的抗菌肽的化学合成

利用经典的化学合成方法，我们人工合成了抗菌肽的直线肽，即抗菌肽前体(由上海强耀生物科技有限公司合成)。然后，在碱性条件下(100-200mMTris-HCl,pH8.0-8.3)进行空气氧化折叠。利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对折叠产物进行分离纯化获得了高纯度均一的抗菌肽。具体如下：

(一)试验仪器和材料

1.原料：树脂：取代度为0.3的2-CL-TrtResin(购自天津南开和成科技有限公司)；氨基酸原料：Fmoc保护的各种氨基酸(其中半胱氨酸侧链的巯基为Trt保护的氨基酸)。

2.仪器：

十二通道半自动多肽合成仪，购自上海强耀生物科技有限公司；高效液相色谱(HPLC)，型号：Waters2695；高速离心机，抽滤瓶，水泵等。

(二)合成步骤

按常规方法，根据十二通道半自动多肽合成仪的厂家说明书合成直线肽，即本发明所述的抗菌肽前体。

(三)空气氧化折叠

将步骤(二)制得的直线多肽，溶解在150mMTris-HCl(pH8.3)，形成浓度为5mg/ml的抗菌肽前体溶液浓度，将该溶液置于空气中，于24℃氧化48小时。反应产物用RP-HPLC分离纯化和鉴定，纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

实施例3本发明所述的抗菌肽的确认

将实施例2制得的抗菌肽，通过基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MAIDI-TOF)鉴定，如图3a所示，其分子量为4055.7Da，与理论计算的分子量完全吻合。该结果证实了氧化产物形成了三对分子内二硫键。

并且将实施例2制得的抗菌肽通过核磁共振仪(BrukerAvance600nmrspectrometer，InternationalEquipmentTradingLtdUSA)测定，核磁共振二维谱(核欧佛豪瑟效应频谱)如图3b所示，并且根据核磁共振二维谱的数据，通过CYANA(CombinedassignmentanddynamicsalgorithmforNMRapplications)软件(Güntert,P.(2004).AutomatedNMRproteinstructurecalculationwithCYANA.Meth.Mol.Biol.278,353-378.)计算得到本发明所述的抗菌肽的核磁共振结构，如图3c所示，表明抗菌肽具有典型的半胱氨酸稳定的α(alpha)-螺旋-β(beta)片层(CSαβ)的结构类型。

实施例4蝎毒液抗菌肽条斑素(Meucin-49)的制备

首先利用电刺激条斑钳蝎尾节毒腺收集毒液.将2mg毒液溶解在1ml0.1体积％三氟乙酸中,利用RP-HPLC方法分离纯化得到条斑素，RP-HPLC所用乙腈浓度为0到60体积％,流速1min/ml(纯化方法见参考文献:Zhuetal.(2010)MeuTXKβ1,ascorpionvenom-derivedtwo-domainpotassiumchanneltoxin-likepeptidewithcytolyticactivity.BBA(ProteinsandProteomics)1804:872–883)。

实施例5本发明所述的抗菌肽的致死浓度

通过传统的抑菌圈试验发现在微摩尔浓度下抗菌肽能够抑制各种细菌的生长，具体试验设计为：挑取下述表1所示的细菌的单克隆，接种到LB培养基，37℃培养至晚对数生长期。取10μl细菌培养物和6mlLB培养基混合后倒平板。然后在平板上打直径为3mm的孔。每孔加入不同浓度的实施例2制得的本发明所述的抗菌肽后在37℃温育过夜，测量抑菌圈大小，计算致死浓度(参见HultmarkD(1998)Quantificationofantimicrobialactivity,usingtheinhibition-zoneassay.TechniquesinInsectImmunology,edsAWiesneretal.(SOSPublicationsFair),pp103–107.)。

结果如下表1所示，本发明所述的抗菌肽对巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的致死浓度达到了纳摩尔浓度水平。抗菌肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株以及铜绿假单孢菌有效。

表1抗菌肽对敏感细菌的致死浓度

以上的菌均为已知菌，且均可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心或中国典型培养物保藏中心。

实施例6本发明所述的抗菌肽的杀菌动力学和透膜化试验

杀菌动力学试验：挑取单克隆细菌接种到LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀＝0.25。然后计数并取2×10⁶个细胞加入5倍致死浓度的实施例2制得的本发明所述的抗菌肽，37℃温育一定时间间隔(30,60,90,120,150和180分钟)后取样用LB培养基稀释后涂平板。37℃温育过夜，计算克隆形成单位，按同样的方法取5倍致死浓度的万古霉素(vancomycin)作为对照。结果如图4a所示，表明本发明所述的抗菌肽比万古霉素具有更快的杀菌速度。

细胞膜透化测定：为了评估孢子霉素对巨大芽孢杆菌细胞膜的影响，我们将5x10⁵个细胞稀释到500μlPBS缓冲液中，加入碘化丙啶使其终浓度为1μM在黑暗中放置5分钟，再加入适量的实施例2制得的本发明所述的抗菌肽(孢子霉素)，37℃温育一定时间间隔(100，200,300,400,500，600，700和800s)后取样，用F-4500FL分光光度计(HitachiHigh-TechnologyCompany)测定荧光吸收值(λ_exc＝525nm；λ_ems＝595nm)，按同样的方法加入条斑素处理巨大芽孢杆菌，并测其荧光吸收值。结果表明，如图4b所示，与其它大多数抗微生物肽不同的是，在杀菌浓度下抗菌肽对敏感细菌的细胞膜完整性没有影响，比条斑素对细胞膜完整性的影响要小很多。

透射电子显微镜观察：首先制备实施例2制得的本发明所述的抗菌肽(孢子霉素)处理的巨大芽孢杆菌，然后利用2.5体积％戊二醛进行化学固定，再用体积百分比为30％→50％→70％→90％→95％→100％的乙醇进行梯度脱水。利用环氧丙烷和环氧树脂(SPI-ChemChemicals)完成渗透。最后用环氧树脂100体积％+1.5质量％加速剂(Epirez,Australia)进行包埋。利用LeicaEMUC6切片机(LeicaMicrosystemsLtd)进行切片。再经醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色。最后用TecnaiSpirit(120kV)MEGAVIEW^G2透射电子显微镜(OLYMPUSSOFTIMAGINGSOLUTIONS)，于室温常规条件下观察。

扫描电子显微镜观察：首先制备实施例2制得的本发明所述的抗菌肽(孢子霉素)处理的巨大芽孢杆菌，然后利用2.5体积％戊二醛室温固定1h。再依次用体积百分比为30％→50％→70％→90％→95％→100％的乙醇梯度洗涤，从而进行脱水。用BAL-TECCPD030干燥仪(BalTecCorporation130TechnologyDriveCanonsburg,Pennsylvania,USA)进行二氧化碳临界点干燥。再用BAL-TECSCD005离子溅射仪(BalTecCorporation130TechnologyDriveCanonsburg,Pennsylvania,USA)喷金，厚度为10nm。最后用FEIQUANTA200扫描电镜(CzechRepublic)，于室温常规条件下观察，结果表明细胞膜的整个结构没有明显变化，即对细胞膜没有明显影响，而细胞内部的蛋白聚集无法观察到(具体结果未显示)。

如图5所示，电子显微镜观察显示，本发明所述的抗菌肽能够导致菌体内蛋白质样颗粒的沉积。

实施例7本发明所述的抗菌肽对哺乳动物的细胞没有显著的溶解效 应

溶血实验方案：从小鼠眼睛取500μl血液，迅速与50μl0.5MEDTA混匀抗凝，43,000g5min离心，弃上清，沉淀用冰冷PBS洗涤一次，弃上清。用PBS将沉淀稀释成20％悬液(v/v,沉淀体积/总体积)，25μl/份分装。通过加等体积溶于PBS的系列浓度梯度的实施例2制得的本发明所述的抗菌肽(6.25μM,12.5μM,25μM,50μM)使悬液变成10体积％浓度，按同样的方法取蝎毒液抗菌肽条斑素(Meucin-49)处理小鼠血液，作为对照。具体计算方法如下：不加本发明所述的抗菌肽和加1体积％TritonX-100分别作为零溶血(A_blank)和完全溶血(A_tot)对照。加了本发明所述的抗菌肽的读值作为A_pep。30℃温育15min。加等体积(即50μl)冰冷PBS终止反应，然后4℃10,000g离心5min，上清用DU800核酸蛋白分析仪(BECKMANCOULTER,INC.FULLERTOWNCALIFORNIA,USA)于570nm测OD值。溶血率＝A_pep/A_tot，结果如图6a所示，在高于杀菌浓度数倍的剂量下，本发明所述的抗菌肽(孢子霉素)对哺乳动物血细胞没有显著的溶解效应，比蝎毒液抗菌肽条斑素(Meucin-49)对血细胞的溶解效应要低很多。

血清稳定性试验：将实施例2制得的本发明所述的抗菌肽即孢子霉素分别溶于小鼠血清和水中，配成0.5nmol/1μl浓度，于37℃处理，分别取处理0、3、6、24小时的小鼠血清和水2μl，加入抑菌平板，培养过夜后测定抑菌圈大小(参见HultmarkD(1998)Quantificationofantimicrobialactivity,usingtheinhibition-zoneassay.TechniquesinInsectImmunology,edsAWiesneretal.(SOSPublicationsFair),pp103–107。)结果，如图6b所示，在老鼠血清中37℃处理过夜，杀菌效能没有明显的下降，表明本发明所述的抗菌肽具有极高的血清稳定性。

实施例8本发明所述的抗菌肽能够治愈耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 以及铜绿假单孢杆菌造成的腹腔感染

利用血琼脂平板复壮耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSAP1386以及铜绿假单孢菌CCTCCAB91095；接种单克隆至LB培养基，培养至OD₆₀₀＝0.5-0.6，将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CCTCCAB91095和铜绿假单孢菌的菌液分别与0.1％胃粘膜素(Meucin，v/v,溶于0.9质量％NaCl)等体积混合，每只小鼠(25-30克/只)腹部注射0.3ml，8只/组，形成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSAP1386造成的腹腔感染治疗组和铜绿假单孢菌CCTCCAB91095造成的腹腔感染治疗组。1小时后，对照组尾静脉注射200μl0.9质量％NaCl，治疗组尾静脉注射万古霉素(Vancomycin)(10mg/kg)或实施例2制得的本发明所述的抗菌肽即(Micasin)(4.5mg/kg)(均溶于200μl0.9质量％NaCl；每天观察小鼠生存情况，实验观察7天。

在该测定中，没有给予药物治疗的对照组(8只)老鼠24小时后全部死亡。相反，尾静脉注射4.5mg/kg剂量的本发明所述的抗菌肽的小鼠存活率达到了79.5±5.7％(S.aureusMRSAP1386)和91.7±5.7％(P.aeruginosa)。如图7所示，本发明所述的抗菌肽的治愈率与万古霉素相当。

利用小鼠腹膜炎模型，我们证实了本发明所述的抗菌肽能够治愈耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株以及铜绿假单孢菌造成的腹腔感染。而菌丝霉素主要针对肺炎链球菌等革兰氏阳性细菌引起的感染。

Claims (14)

1.一种抗菌肽前体，所述抗菌肽前体的序列为下述SEQIDNO:1所示的氨基酸序列：

GFGC₄PFNENEC₁₁HAHC₁₅LSIGRKFGFC₂₅AGPLRATC₃₃TC₃₅GKQ。

2.一种抗菌肽，所述抗菌肽由权利要求1所述的抗菌肽前体的氨基酸序列中的6个半胱氨酸经氧化形成三对分子间二硫键而成，所述三对分子间二硫键分别为第4、25位半胱氨酸、第11、33位半胱氨酸和第15、35位半胱氨酸间形成的分子间二硫键。

3.一种编码权利要求1所述的抗菌肽前体或权利要求2所述的抗菌肽的DNA序列，所述DNA序列具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。

4.一种用于制备权利要求3所述的DNA序列的引物，包括第一、二次PCR的上游引物和第一、二次PCR的下游通用引物，所述第一次PCR的上游引物为SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；所述第二次PCR的上游引物为SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述第一、二次PCR的下游通用引物均为SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的DNA序列的制备方法，包括通过巢式PCR从犬小孢子菌中扩增获得所述DNA序列。

6.根据权利要求5所述的DNA序列的制备方法，其中，所述巢式PCR的第一次PCR的上游引物为SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；所述巢式PCR的第二次PCR上游引物为SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述巢式PCR的第一、二次PCR的下游通用引物均为SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的抗菌肽前体的制备方法，所述方法包括以下步骤：按照常规方法人工合成抗菌肽的直线肽，即抗菌肽前体，再利用反相高效液相色谱法对折叠产物进行分离纯化，即得。

8.根据权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：按照常规方法人工合成抗菌肽的直线肽，即抗菌肽前体；在碱性条件下，将所述抗菌肽前体进行空气氧化折叠以形成分子内二硫键；

其中，所述空气氧化折叠以形成分子内二硫键的步骤包括：将所述抗菌肽前体溶解于pH为8.3的150mMTris-HCl中，形成浓度为5mg/ml的抗菌肽前体溶液，再将所述抗菌肽前体溶液置于空气中，于24℃氧化48小时，形成分子内二硫键。

9.一种用于抗细菌的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求2所述的抗菌肽和药学上可接受的辅料或载体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗菌肽的致死浓度为0.054～4.24μΜ/L。

11.根据权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述辅料为NaCl溶液。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，NaCl溶液为质量体积比为0.9％的NaCl溶液。

13.根据权利要求1所述的抗菌肽前体、权利要求2所述的抗菌肽、权利要求4所述的引物或权利要求9-12中任一项所述的药物组合物在制备用于抗细菌的药物中的应用；所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；其中，所述革兰氏阳性菌选自巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌选自铜绿假单孢菌和/或根癌农杆菌。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单孢菌。