CN105254723A - 一组具协同效应的抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组具协同效应的抗菌肽，所述抗菌肽选自下述序列中的任一个氨基酸序列：SEQ？ID？N33、SEQ？ID？N35。本发明所述的抗菌肽，兼具高协同效应与高效广谱抑菌作用；本发明所述的抗菌肽高效、低毒；与抗生素联用可形成更加高效的抗菌组合物，部分组合物可令抗生素用量减少128倍。本发明所述的抗菌肽及由上述抗菌肽得到的抗菌肽-抗生素组合物，在抗菌剂、防腐剂、饲料添加剂中有潜力应用。

Description

一组具协同效应的抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及药物应用领域，尤其涉及抗菌肽在抗菌剂、防腐剂、饲料添加剂中的应用以及抗菌肽与抗生素形成组合物后在抗菌药物、饲料添加剂中的应用。

背景技术

随着我国养殖业规模化和集约化的发展，抗生素作为主要的饲料添加剂与治疗药物，得到了越来越广泛的应用。然而，滥用抗生素造成产品及环境中抗生素的残留和蓄积，严重的影响了我国养殖业的发展。国家为此陆续出台法规，限制抗生素在养殖业中的使用范围与用量。寻找减少或取代抗生素使用的新型绿色饲料添加剂具有很大的实用意义。

抗生素的过量应用，导致养殖业中出现的耐药菌与泛耐药菌的种类与数量不断提高。临床分离的耐药菌如MRSA也与抗生素滥用有关。我们需要找到一种能有效杀死临床常见的耐药细菌，且不易诱导细菌耐药的方法。

抗菌肽(antimicrobialpeptides)由20-60个氨基酸残基构成，分子量在2000-7000左右，是古老而广泛存在于生物界中的一种活性多肽，是纯天然的抗菌活性成分。1972年，Boman在北美天蚕的血淋巴中发现了具有抗菌作用的多肽，这类抗菌肽被命名为天蚕素(Cecropins)。后来，人们发现抗菌肽是生物非特异性免疫的重要组成部分,细菌、真菌、原虫、植物、动物、乃至人类都能产生抗菌肽。依据不同的蛋白质序列组成和结构特点，抗菌肽可分为：α-螺旋型(α-helix)，β-折叠型(β-sheet)，富含脯氨酸类(pro-rich)，环化类(loop)。已发现的抗菌肽作用机理包含桶板模型、环形孔模型，地毯模型等。抗菌肽的抗菌作用机制与传统抗生素不同。传统抗生素针对的是病原体的受体，作用靶点单一，抗生素靶点的改变会令抗生素失效。病原微生物的基因突变常能改变抗生素的靶点，产生耐药菌株。抗菌肽是一类多靶点的药物，目前发现的作用机理有破坏细胞膜、抑制生物大分子的合成、抑制胞内酶活性等，病原微生物难以获得抗药性，因为需要改变的靶点太多了。抗菌肽多靶点的作用机制，极大减少耐药菌株产生。抗菌肽抗菌谱广，具有抗多重耐药菌，真菌的作用，部分抗菌肽还具有抗病毒和肿瘤细胞的功能。

虽然人们对抗菌肽进行了广泛与深入的研究，目前仍没有任何一类抗菌肽药物上市销售。其原因在于，现在所发现的抗菌肽虽然广谱性很好，但活性并不够强。常见的抗生素，其活性一般比抗菌肽高一个数量级。这就大大限制了抗菌肽的实际应用，我们需要提高抗菌肽的活性，拓展其应用范围，促使抗菌肽尽早实现产业化。

申请人在前期研究中，设计得到了一组具有高抗菌活性，低毒性的抗菌肽，其中含脯氨酸铰链结构与α-螺旋序列，能够结合细菌胞内大分子，起到快速杀菌的作用。

为了进一步扩大抗菌肽的应用范围，本发明在前期研究的基础上，进一步优选得到两个新抗菌肽。我们的新抗菌肽抗菌作用强，复合抗生素氨苄西林、卡那霉素、环丙沙星可起到协同增效作用，降低抗生素的使用量。对抗菌肽的杀菌曲线与纸片法实验证实了上述多肽的抗菌活性。

发明内容

本发明提供一组兼具高抗菌活性与高协同效应的抗菌肽，作为饲料添加剂、化妆品防腐成分、抗菌药物的应用以及上述抗菌肽与抗生素形成组合物后在抗菌药物与饲料添加剂中应用。本发明的有益效果是:本发明所述的抗菌肽，兼具高协同效应与高效广谱抑菌作用；本发明所述的抗菌肽高效、低毒；与抗生素可形成更加高效的抗菌组合物，令抗生素用量减少4-128倍。显著降低抗生素用量，减轻现有抗菌药物的滥用而导致畜牧业生产及临床上耐药菌不断增加的状况。

本发明所述的抗菌肽，可在抗菌剂、防腐剂、饲料添加剂领域拓宽抗菌肽类物质的用途。

本发明的技术方案是：

抗菌肽N33或N35作为抗菌药物的应用；

抗菌肽N33或N35作为饲料添加剂的应用；

抗菌肽N33或N35，联合抗生素作为抗菌药物的应用；

抗菌肽N33或N35，联合抗生素作为饲料添加剂的应用；

抗菌肽N33或N35，联合抗生素作为抗MRSA抗菌药物的应用。

进一步地，抗菌肽N33与抗生素联合的比例为1:8-8:1，抗菌肽N35与抗生素联合的比例为1:8-8:1时，能得到较好的协同效应。大大增加抗生素的抗菌活力，使抗生素的用量降低4-128倍。

进一步地，所述抗生素包括氨苄西林、卡那霉素、头孢曲松钠、环丙沙星、丁胺卡那霉素。

本发明的有益效果：

本发明在前期研究的基础上，进一步优选得到的两个抗菌肽序列抗菌肽N33与抗菌肽N35，单独使用对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有效，能够对常见的致病性大肠杆菌，如O78，O157，鸡沙门氏菌，有强杀菌效果；对MRSA也有明确的效果。

附图说明

图1为抗菌肽N33的质谱图；

图2为抗菌肽N35的质谱图；

图3为抗菌肽、抗生素及抗菌肽-抗生素组合物对大肠杆菌的杀菌曲线；

图4为抗菌肽、抗生素及抗菌肽-抗生素组合物对金黄色葡萄球菌的杀菌曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1：

本实施例中共有2个抗菌肽，如下所示：

(1)N33即SEQIDN33：

LysTrpLysLeuPheLysLysValValLysProValTyrIleProArgProArgValHisArgLeuLeuArgLys；

即KWKLFKKVVKPVYIPRPRVHRLLRK；

分子量：3186.3。

(2)N35即SEQIDN35：

ArgIleTrpValIleTrpArgLysValValLysGlyIleGlyValGlyLysThrIleHisArgLeuValThrGly；

即RIWVIWRKVVKGIGVGKTIHRLVTG；

分子量：2872.6。

实施例2：

将实施例1所述的2条抗菌肽用多肽合成仪进行固相有机合成，合成方向从C端到N端逐一进行，采用Fmoc保护合成法，具体步骤如下：

称取Fmoc树脂0.1mmol，装柱，再按照抗菌肽的氨基酸序列，从C端至N端，将氨基酸置于多肽合成仪中。于室温20℃，首先用20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺(DMF)溶液将Fmoc脱保护，再用DMF溶液进行清洗。将Fmoc的游离氨基酸溶解，活化并上柱循环偶合反应，DMF溶液清洗。重复活化、缩合，脱保护、洗涤这一系列过程直至多肽合成结束。

取下反应后的树脂，加裂解液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％异丙基硅烷)，室温反应3h，过滤，收集滤液，加入乙醚沉淀，4000转/10分钟离心收集沉淀，干燥。

抗菌肽的纯化：

将干燥后的抗菌肽，加入0.1％三氟乙酸溶解，反向柱分离(洗脱液为20％-80％乙腈的0.1％三氟乙酸，梯度洗脱)，收集洗脱峰。经鉴定，合成多肽纯度达90％。

质谱鉴定：将上述得到的多肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图(图1、图2)中显示的分子量与实施例1中的理论分子量一致。

实施例3：

抗菌肽的杀菌活性检测：

以下实施例中所用的菌种大肠杆菌CMCC44102，金黄色葡萄球菌CMCC26003来源于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；铜绿假单胞菌ATCC27853来源于广州市微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌O78，大肠杆菌O157鸡沙门氏菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC43300来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心。采用CLSI介绍的微量肉汤法，以抗生素氨苄西林，阿米卡星，氯霉素，卡那霉素为对照。以固相合成法合成了2条多肽，测定了多肽的杀菌活性。

取甘油菌种，在LB平板上划线，37℃培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基内，37℃，120rpm摇菌过夜。将菌液稀释至cfu＝1*10⁶/ml，备用。将多肽或抗生素在96孔细胞培养板上倍比稀释，每孔50ul，每孔加入50ul菌液。此时多肽或抗生素梯度为：256ug/ml，128ug/ml，64ug/ml，32ug/ml，16ug/ml，8ug/ml，4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.25ug/ml，0ug/ml；每孔菌液终浓度为：cfu＝5*10⁵/ml。将96孔细胞培养板加盖置于恒温培养箱内37℃孵育16h。MIC数据见表1。

表1抗菌肽和抗生素的最小抑菌浓度(MIC，单位ug/ml)

表1用最小抑菌浓度值(MIC)表征抗菌肽的抗菌能力，MIC值愈小则说明抗菌能力愈强。由上表可见，本发明抗菌肽的抗菌能力强，达到了常用抗生素的水平。对MRSA有效，显示了较抗生素更广的抗菌谱。抗菌肽N33与N35可作为抗生素替代药物应用。

实施例4：

纸片法测抗菌肽抗菌活性：

纸片法为抗菌活性检测的传统方法，申请人也采用纸片法检测了抗菌肽N33/N35的抗菌活性，检测方法如下：检测菌种为金黄色葡萄球菌CMCC26003与大肠杆菌CMCC44102；检测培养基为LB琼脂培养基，采用倾注平板法。LB琼脂培养基高压灭菌后冷却至40-50℃，加入菌液令菌浓度＝10⁶cfu/ml；参照中国药典方法，采用直径为9cm的培养皿，每块平板加培养基25ml。自制含抗菌肽纸片：纸片直径6mm，每张纸片含多肽量分别为0，10ug，20ug，40ug，80ug。将含抗菌肽纸片放置于含菌平板上，将平板置于4℃扩散2h。而后置于37℃培养箱培养24h，游标卡尺测抑菌圈大小，实验设三重复组，结果取平均值。

实验结果显示，两种多肽对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌都显示了良好的抗菌活性，80ug组抗菌肽对大肠杆菌抑菌圈达15-17mm，对金黄色葡萄球菌抑菌圈达21-25mm。显示了良好的抗菌活性。

实施例5：

抗菌肽的协同效应检测：

以下实施例中所用的菌种大肠杆菌，金黄色葡萄球菌来源于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；来源于广州市微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌CICC10413，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC43300来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

采用棋盘法检测，按联合用药方法计算抗菌肽-抗生素，抗菌肽-溶菌酶的联合用药指数FIC，表征其协同效应。

取甘油菌种，在LB平板上划线，37℃培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基内，37℃，120rpm摇菌过夜。将菌液稀释至cfu＝1*10⁶/ml，备用。按照棋盘法的要求，将多肽或抗生素在96孔细胞培养板上，依照横向与纵向，倍比稀释，每孔50ul，每孔加入50ul菌液，每孔菌液终浓度为：cfu＝5*10⁵/ml。将96孔细胞培养板加盖置于恒温培养箱内37℃孵育16h。联合用药数据见下表。

表2抗菌肽和抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的联合用药指数(FIC)

表3抗菌肽和抗生素对大肠杆菌CICC10413的联合用药指数(FIC)

表4抗菌肽和抗生素对大肠杆菌078ATCC35401的联合用药指数(FIC)

表中用联合用药指数(FIC)表征抗菌肽的抗菌能力，FIC值愈小则说明联合用药增效作用愈强。由上表可见，本发明抗菌肽的协同增效作用强，大大降低了抗生素的用量，起到了减少抗生素使用的效果。

实施例6：

抗菌肽及其组合物的抗菌动力学检测：

抗菌肽的抗菌动力学检测方法如下：

抗菌动力学用药物：抗菌肽N33/N35；抗生素盐酸环丙沙星；抗菌肽N33与盐酸环丙沙星按1:2的比例配制的组合物，记为33-H；抗菌肽N35与盐酸环丙沙星按1:2的比例配制的组合物，记为35-H,环丙沙星记为H；抗菌肽N33与N35分别记为33/35。

‘331MIC’表示：杀菌动力学实验中使用的抗菌肽的药物浓度为1倍MIC；同理‘332MIC’表示：抗菌肽的药物浓度为1倍MIC；‘33H1MIC’表示：抗菌肽与环丙沙星组合物的药物浓度为1倍MIC；同理‘33H2MIC’表示：抗菌肽与环丙沙星组合物的药物浓度为2倍MIC。具体MIC数下表。

表5抗菌肽和抗生素的最小抑菌浓度(MIC，单位ug/ml)

微生物与培养基：大肠杆菌CMCC44102，金黄色葡萄球菌CMCC26003，培养

至对数生长期备用

用微量肉汤法计算抗菌肽/组合物/抗生素MIC。根据MIC将各组药物按2MIC/1MIC进行稀释。用分光光度计测浊度，将菌悬液配置为cfu＝1*10⁶/ml，备用。用96孔无菌平板，加入菌悬液与药物溶液，菌液终浓度cfu＝5*10⁵/ml，药液终浓度为2MIC/1MIC，(如35H1MIC即复配N35与环丙沙星1MIC)，总量200ul，于0h/1h/2h/4h取100ul培养物，梯度10倍稀释涂LB平板计数，以不同时间点的菌落数的对数绘制杀菌曲线。实验重复两遍，取平均值。抗菌动力学对数数据表见表6表7；抗菌动力学部分曲线见图3与图4。

表6抗菌肽、抗生素及抗菌肽-抗生素组合物对金黄色葡萄球菌的对数杀菌曲线

	0h	1h	2h	4h
					空白	5.6	5.9	6.28	7.63
H 1MIC	5.6	6.04	5.18	3.15
					H 2MIC	5.6	5.26	5	3.3
35-1MIC	5.6	0	0	0
					35-2MIC	5.6	0	0	0
35H 1MIC	5.6	5.45	5.08	3
					35H 2MIC	5.6	5.48	5	0
33 1MIC	5.6	0	0	0
					33 2MIC	5.6	0	0	0
33H 1MIC	5.6	5.57	5.7	0
					33H 2MIC	5.6	5.52	5.5	0

表7抗菌肽、抗生素及抗菌肽-抗生素组合物对大肠杆菌的对数杀菌曲线

	0h	1h	2h	4h
					空白	5.26	5.34	6.11	7.65
H 1MIC	5.26	5.3	4.18	3
					H 2MIC	5.26	5.26	4.15	2.3
33 1MIC	5.26	0	0	0
					33 2MIC	5.26	0	0	0
33H 1MIC	5.26	5.08	4.93	2.3
					33H 2MIC	5.26	5.04	4.48	0
35-1MIC	5.26	0	0	0
					35-2MIC	5.26	0	0	0
35H 1MIC	5.26	4.6	2.6	0
					35H 2MIC	5.26	4.7	3.15	0

从结果看，抗菌肽是强烈的浓度依赖型抗菌药物，与环丙沙星复配后，强化了环丙沙星浓度依赖型杀菌的特点。比单用环丙沙星杀菌速度快1个数量级。这说明环丙沙星复配抗菌肽能在短时间内杀灭细菌，有效弥补了抗菌肽成本较高与稳定性较差的弱点，能更有效的作为抗菌剂与饲料添加剂在畜牧业中应用。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一组抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽选自下述序列中的任一个氨基酸序列：

SEQIDN33、SEQIDN35。

2.如权利要求1所述的一组抗菌肽，其特征在于：

所述SEQIDN33为：

LysTrpLysLeuPheLysLysValValLysProValTyrIleProArgProArgValHisArgLeuLeuArgLys；

所述SEQIDN35为：

ArgIleTrpValIleTrpArgLysValValLysGlyIleGlyValGlyLysThrIleHisArgLeuValThrGly。

3.如权利要求1所述的一组抗菌肽用于制备抗菌剂的用途。

4.如权利要求3所述的一组抗菌肽用于制备抗菌剂的用途，其特征在于：所述细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。

5.如权利要求1所述的一组抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽用于制备饲料添加剂或食品添加剂的用途。

6.如权利要求1所述的一组抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽用于制备防腐剂的用途。

7.如权利要求1所述的一组抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽与喹诺酮类、青霉素类、氨基糖苷类、头孢菌素类任一种的组合物用于制备抗菌剂。

8.如权利要求1所述的一组抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽与喹诺酮类、青霉素类、氨基糖苷类、头孢菌素类任一种抗生素的组合物用于制备饲料添加剂。