CN112004548A

CN112004548A - 植物乳杆菌素NC8αβ显著增强抗生素的作用

Info

Publication number: CN112004548A
Application number: CN201980027124.XA
Authority: CN
Inventors: 托尔比约恩·本特松; 哈齐姆·哈拉夫
Original assignee: Tuo ErbiyueenBentesong
Current assignee: Kulunk Co.
Priority date: 2018-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2020-11-27
Also published as: US20210162001A1; EP4056195A1; EP3755363A1; EP3755363C0; WO2019162301A1; ES2955834T3; EP3755363B9; CA3096807A1; PL3755363T3; EP3755363B1

Abstract

本发明提供药物组合物，其包含第一肽和第二肽。第一肽为细菌素PLNC8αβ的肽，其中，细菌素PLNC8αβ的肽为肽A或肽B，肽A与SEQ ID NO 1具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)，肽B与SEQ ID NO 2具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)。当第一肽为肽A时，第二肽B’具有14～34个氨基酸并包含与SEQ ID NO 3具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽。当第一肽为肽B时，第二肽A’具有15～29个氨基酸并包含与SEQ ID NO 4具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽。所述药物组合物进一步包括至少一种抗生素。所述药物组合物可以使用在细菌感染的治疗或预防中。

Description

植物乳杆菌素NC8αβ显著增强抗生素的作用

发明领域

本发明总体上涉及感染的治疗的领域。更具体地，本发明涉及药物组合物的用于感染的预防和/或治疗的用途，所述药物组合物包含细菌素PLNC8αβ，其中，药物组合物进一步包括至少一种抗生素。

发明背景

医院获得性感染(HAI)也称为医院的感染，是在医院或其他健康护理设施中获得的感染。这样的感染可以在医院，疗养院，康复设施，门诊部或其他临床环境中获得。感染在临床环境中通过各种方式被传播给易受感染的患者。除被污染的设备，床上用品或空气飞沫之外，健康护理职员也能够传播感染。据估计在欧盟和美国每年有6百万患者染上HAI，导致每年多达150 000人死亡。HAI的预防通常包括关于制服，设备杀菌，洗涤和其他预防性措施的医院卫生规程。对抗医院的感染最有效的方式之一是通过所有的医务人员在每次患者接触前和后彻底洗手和/或酒精擦拭的使用。更谨慎地使用抗微生物剂如抗生素也被认为是极重要的。

在细菌类别之间，最为人熟知的传染患者的为ESKAPE病原体(屎肠球菌(Enterococcus faecium)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌(Enterobacter))，包括MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)和VRE(耐万古霉素肠球菌,Vancomycin-resistant Enterococcus)，链球菌属(Streptococcus spp)和大肠杆菌(Escherichia coli)。在由抗生素耐药细菌引起的感染的治疗中，开发新的有效抗微生物的策略提出了当今医学中的主要挑战之一。因为大多数感染是由保护在复杂的生物膜中生活的病原体引起，因此抗菌物质需要有良好的能力来穿透或溶解生物膜。这种能力在传统的抗生素中通常是受限的/缺乏的，因此其必须用非常高的浓度弥补，通常为用于对浮游细菌进行杀菌作用所需的剂量的100-1000倍高。这种过量促进抗生素耐药性的加速发展和严重的细胞毒性作用。此外，感染通常与由细菌和机体免疫系统两者引起的高蛋白水解活性有关联，这意味着抗微生物剂可能很快地变得失活。

已知细菌素构成对传统的抗生素的有希望的潜在的替代或补充，并具有许多优点，如耐药性发展的风险低，对正常菌群影响有限，和对人组织有益的效果。细菌素是一组由细菌产生的肽，用于对抗其他细菌。细菌素可带有净正电荷并表达两亲结构，所述两亲结构与带负电荷的微生物膜作用并通常通过形成孔机制杀死微生物。与通常是常规抗生素的靶点的代谢酶相比，这些机制更难于通过发展耐药性来逃避。

因此，在细菌和细菌感染的预防或治疗中，特别是在健康护理的抗生素耐药性(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)，和耐万古霉素肠球菌(VRE))的传播中需要抗生素疗法的替代方法。

发明概述

因此，本发明优选地寻找单独或以任意组合来减轻，缓解或消除本领域中以上确定的不足和缺点中的一种或多种，并通过提供药物组合物解决至少上述问题，所述药物组合物包含第一肽和第二肽，其中，第一肽为细菌素PLNC8αβ的肽，其中，细菌素PLNC8αβ的肽为肽A或肽B，所述肽A与DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF SEQ ID NO 1具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)，所述肽B与SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ ID NO 2具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)，其中，当第一肽为肽A时，第二肽B’具有14～34个氨基酸并包含与YTLGIKILWSAYKH SEQID NO 3具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽，当第一肽为肽B时，第二肽A’具有15～29个氨基酸并包含与DLTTKLWSSWGYYLG SEQ ID NO 4具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽，其中，药物组合物进一步包括至少一种抗生素。

所述肽和抗生素协同作用并增强彼此的效果。

本发明提供药物组合物，其中，在第一肽和/或第二肽中至少90％的氨基酸为D-氨基酸残基。

与它们的相应的L-变体相比，这样的肽更稳定，并对蛋白水解性裂解敏感性更低。

本发明提供药物组合物，其中，抗生素选自由抑制细菌细胞壁合成的抗生素，抑制核酸合成的抗生素和抑制蛋白合成的抗生素组成的组。

本发明提供药物组合物，其用于细菌感染的治疗或预防。

本发明也提供药物组合物在涂覆装置的至少一部分以限制细菌在装置表面上定殖中的用途。

附图说明

通过参考附图，本发明所具有的这些和其他方面、特征和优点将能够从本发明实施方案的以下描述中清楚和阐明，其中，

图1示出PLNC8αβ显著地抑制金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的不同菌株的生长和生存。不同的葡萄球菌属在浓度增加的PLNC8αβ(1:1)存在下培养了20h。表皮葡萄球菌普遍比金黄色葡萄球菌对PLNC8αβ更易感。葡萄球菌属响应PLNC8αβ的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。

图2.PLNC8α与PLNC8β的摩尔比对最佳抗微生物活性至关重要。表皮葡萄球菌ATCC12228被暴露于不同摩尔比的PLNC8α和β中20h。PLNC8α和PLNC8β之间1:1的摩尔比对抑制和杀死表皮葡萄球菌最有效。不同摩尔比的PLNC8α和β的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。*肽的最高总浓度保持恒定为50μM，而改变PLNC8α和β各自的浓度以获得不同的摩尔比。

图3.PLNC8αβ对破坏表皮葡萄球菌生物膜有效。允许生物膜阳性株表皮葡萄球菌RP62A形成生物膜，接着除去悬浮细菌，然后与PLNC8αβ，PLNC8α或PLNC8β温育1h。A-脱落的生物膜的吸光度测定。B-余留附着的生物膜的结晶紫染色。PLNC8αβ对破坏表皮葡萄球菌的生物膜最有效和快速。

图4.具有L-或D-氨基酸的PLNC8α和β的膜破坏和抗微生物活性。

A-在利用浓度增加的PLNC8α，β或αβ(1:1)的L-或D-变体暴露于脂质体后记录了CF释放。B-将表皮葡萄球菌ATCC 12228与浓度增加的PLNC8α和β(单独或组合(1:1))温育20h。表明了PLNC8α，β和αβ的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。

图5.PLNC8αβL-和D-变体迅速渗透表皮葡萄球菌的质膜。与未经处理的细菌(C)相比，由用5μM的L-PLNC8αβ，D-PLNC8αβ或者乱序的PLNC8αβ处理2min后表皮葡萄球菌ATCC12228进行的Sytox绿的摄取。

图6.PLNC8αβ的D-形式更稳定，并对蛋白水解性裂解敏感性更低。将肽(100μM)a)L-PLNC8αb)D-PLNC8αc)L-PLNC8βd)D-PLNC8β于37℃用胰蛋白酶(5μM)在碳酸氢铵缓冲液(50mM)中处理16h，然后进行酸化(acified)(2.5％TFA)，干燥，悬浮在H₂O+0.1％TFA中，脱盐(ZipTip)并通过MALDI-ToF MS进行分析。峰上面的数字表明分子量(Da)，括号内的数字表明氨基酸的序列。分别为全长α-和β-肽，1-29和1-34。

图7.(A)PLNC8αβ的L-和D-形式两者显示出低溶血活性。将人红细胞与不同浓度(0.5-50μM)的PLNC8α，β或αβ(1:1)的L-或D-变体温育1h。在(B)中示出了经截短的形式α1-15，α1-22，β7-20，β1-20，β7-34。

图8.PLNC8α和PLNC8β的经截短的肽的氨基酸序列。

图9.PLNC8β的经截短的形式的抗微生物活性。在A.中，用β肽1-34(全长)，7-34，1-20和7-20获得膜的破坏和(6)-羧基荧光素(CF)从脂质体的释放。在B.中，当与全长PLNC8α肽组合时，用其他经截短的肽也获得了效果，尽管是以更高的浓度。在C中，L-PLNC8β的经截短的肽的氨基酸序列。在D中，利用经截短的L-PLNC8β在有和没有L-PLNC8α的情况下50％CF释放的定量。在E中，经截短的PLNC8β在不存在或存在全长α-肽的情况下，针对表皮葡萄球菌ATCC 12228的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。表皮葡萄球菌的生长被全长β1-34，β7-34，β1-20和β7-20抑制。

图10.PLNC8α的经截短形式的抗微生物活性。(A)利用α1-22和全长α1-29获得了从脂质体的(6)-羧基荧光素(CF)的释放。当与全长PLNC8β肽组合时，用其他经截短的肽也获得了效果，尽管是以更高的浓度。(C)L-PLNC8α的经截短的肽的氨基酸序列。(D)通过经截短的L-PLNC8α肽在有和没有L-PLNC8β的情况下，50％CF释放的定量。(E)经截短的PLNC8α针对表皮葡萄球菌ATCC 12228的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。表皮葡萄球菌的生长和生存被α1-29和α1-22与β-肽的组合而抑制。

图11.经截短的PLNC8α与PLNC8β的组合的抗微生物活性。经截短的PLNC8α与PLNC8β的组合针对表皮葡萄球菌ATCC 12228的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。由β1-20和β7-20分别进行的表皮葡萄球菌的生长和生存抑制，没有通过与α1-22或α1-15共温育而进一步提高。

图12.通过使用TEM和SEM，PLNC8αβ对上表皮葡萄球菌的形态学影响。PLNC8α引起大量泡(bleb)形成，而PLNC8β诱导的细菌裂解通过细胞内成分的胞外释放而显示。PLNC8αβ最有效，引起完全的细菌裂解。PLNC8β的经截短形式β1-20和β7-20诱导了细菌细胞壁片段化，并与PLNC8α组合而诱导了表皮葡萄球菌经历裂解。

图13.制剂中的PLNC8αβ针对表皮葡萄球菌有效并在长期储存后保持其活性。通过研究由暴露于含有不同浓度(5-100μM)的PLNC8αβ的凝胶的表皮葡萄球菌ATCC 12228的Sytox绿摄取，细菌裂解被可视化。具有100μM PLNC8αβ的制剂的活性，也在时间0和在4℃长期储存后在具有表皮葡萄球菌的血琼脂平板上进行了试验。通过用塑料环将凝胶散布在琼脂表面而创建了PLNC8αβ的梯度。细菌生长的抑制由半透明的区域证实。

图14.PLNC8αβ针对表皮葡萄球菌的异质性菌株有效。从假体关节感染分离的表皮葡萄球菌，包括异质性糖肽中间体表皮葡萄球菌(heterogeneous glycopeptideintermediate S.epidermidis)(hGISE)被暴露于L-PLNC8αβ下20h并测定了MIC(最小抑制浓度)和MBC(最小杀菌浓度)。

图15.PLNC8αβ与抗生素协同地作用。抗生素和L-或D-PLNC8αβ之间的协同抗微生物效果。将表皮葡萄球菌(菌株154)暴露于L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ(3.1μM)，以及替考拉宁，万古霉素，利福平和庆大霉素(它们是单独的或与3.1μM L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ组合)的连续稀释液中。

图16.替考拉宁和PLNC8αβ之间的协同抗微生物效果。PLNC8β和经截短的PLNC8α显著地放大了替考拉宁针对表皮葡萄球菌的抑制效果。将表皮葡萄球菌(菌株154)暴露于替考拉宁的连续稀释液或全长/经截短的PLNC8αβ中，这些为单独的，或它们的组合(替考拉宁的连续稀释液与6.25μM全长/经截短的PLNC8αβ)，

图17.PLNC8αβ显著渗透并杀死不同种的链球菌。用5μM PLNC8αβ将链球菌属(变形链球菌(Sm)，星群链球菌(Sc)和咽峡炎链球菌(Sa))处理2min，接着分析Sytox绿的摄取。星群链球菌和咽峡炎链球菌比变形链球菌对PLNC8αβ更易感，

图18.PLNC8αβ独立于它们对抗生素的耐药性地引起金黄色葡萄球菌的快速裂解。(A)通过Sytox绿染色表明，暴露于PLNC8αβ5min后，细菌裂解发生剂量依赖性地增加。(B)表明了MSSA和MRSA的MIC和MBC值。(C)时间杀伤分析表明，PLNC8αβ以剂量依赖性方式迅速杀死细菌，

图19.PLNC8αβ促进人角质细胞的伤口愈合。将HaCaT细胞暴露于不同浓度的PLNC8αβ或MSSA中24h。(A)PLNC8αβ促进伤口愈合，所述伤口愈合是在体外使用划痕分析测定的。而(B)IL-6和(C)CXCL8通过金黄色葡萄球菌而提高，这些炎症介质没有被PLNC8αβ改变，

图20.PLNC8αβ拮抗由金黄色葡萄球菌介导的细胞毒性和人角质细胞的炎症反应。HaCaT细胞用MSSA感染1h，接着添加PLNC8αβ6h。(A)PLNC8αβ拮抗由金黄色葡萄球菌介导的细胞毒性，所述细胞毒性通过LDH活性进行测定，并促进细胞生存力。(B)IL-6和(C)CXCL8的分泌被所述肽显著降低。(D)il-6和cxcl8的基因表达分析通过预防金黄色葡萄球菌感染角质细胞而证实了PLNC8αβ的效果。此外，细胞内信号事件涉及c-jun和c-fos，暗示了转录因子AP-1通过MAPK发挥的作用，

图21.PLNC8αβ促进人角质细胞的伤口愈合和降低炎症反应。将HaCaT细胞在PLNC8αβ存在或不存在下用MSSA感染24h。(A)在利用金黄色葡萄球菌感染后，PLNC8促进伤口愈合。由金黄色葡萄球菌引起的(B)IL-6和(C)CXCL8的分泌的提高被所述肽显著降低，

图22.PLNC8αβ在体内抑制感染并促进伤口愈合。伤口愈合使用猪伤口愈合模型在体内进行了评价。伤口未暴露于金黄色葡萄球菌或用金黄色葡萄球菌(10⁸CFU/ml)感染3天。每隔一天添加一次庆大霉素(100μg/ml)和/或PLNC8αβ(50μM)，伤口被监控7天(共计4次给药)。单独的或与庆大霉素组合的肽拮抗感染并促进伤口愈合，

图23.记录了聚集(虚线)和ATP释放(实线)以确定由L-PLNC8αβ引起的细菌裂解。

图24.PLNC8αβ在脂质体上引起快速的膜透化。PLNC8β和PLNC8αβ(1:1)(而不是PLNC8α)的(A)L-形式和(B)D-形式两者在2min后引起了脂质体的完全裂解。

图25.PLNC8αβ的CD光谱。在PBS中不具有(虚线)和具有(实线)脂质体(0.5mg/ml，～660μM)的(A)L-PLNC8αβ和(B)D-PLNC8αβ(各100μM)的CD测量。具有PBS的三个重复作为背景。含有脂质体的样品在测量前温育至少30min。

图26.在PLNC8αβ的存在或不存在下的感染的角质细胞的IncuCyte活细胞分析。金黄色葡萄球菌MOI:1在8h后引起细胞死亡。单剂量的PLNC8αβ阻止细菌生长并保护细胞至长达32h。在整个实验期间(72h)，PLNC8αβ/庆大霉素(5μg/ml)组合有效地消除了金黄色葡萄球菌并预防了感染以及随后的细胞死亡，和

图27.在PLNC8αβ的存在或不存在下的感染的角质细胞的IncuCyte活细胞分析。A-金黄色葡萄球菌MOI:0.1在10h后引起细胞死亡。单剂量的PLNC8αβ阻止细菌生长并保护细胞长达42h。整个实验期间自始至终(72h)，PLNC8αβ/庆大霉素(5μg/ml)组合有效地消除了金黄色葡萄球菌并预防了感染和随后的细胞死亡。B-通过量化细菌的GFP荧光测量的细菌生长在8-9h后达到最大水平。PLNC8αβ阻止和延迟细菌生长长达38h，并且PLNC8αβ/庆大霉素组合有效地消除了所有的细菌。

具体实施方式

以下描述关注于本发明的实施方案，所述实施方案适用于使用与抗生素一起使用的源自植物乳杆菌NC8细菌素的肽来对抗感染特别是医院获得性感染(HAI)(也包括其他种类的感染)。然而，应该理解，本发明不受限于这些应用，这些肽可以应用在许多其他用途中，包括例如消毒和表面涂层。

存在着与对抗感染(例如医院获得性感染(HAI))相关的若干个问题。这些问题包括：对许多重度和危重细菌感染的处理策略不足；在健康护理中抗生素耐药性(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和表皮葡萄球菌(MRSE))的发展和传播；社会用于预防和治疗传染性疾病的巨大费用(例如，治疗与健康护理相关的感染(HAIs)的年度住院费用在美国估计为400亿美元，在瑞典为65亿瑞典克朗)：罹患传染性疾病的人(在美国和欧盟，每年约6百万罹患HAI的患者，150000人死亡)。

处理这些问题并非易事，因为它们包括以下方面：如生物膜形式的顽固性感染，拮抗抗菌剂作用的感染中的高蛋白水解活性，抗菌剂的受限的稳定性和活性，慢性感染和炎症，以及缓慢和复杂的伤口愈合。

本发明人设想，根据特定的乳杆菌物种主要通过表达和分泌某些细菌素来抑制病原体的能力，所述特定的乳杆菌物种确实可能能够有助于解决这些问题。

植物乳杆菌为高度多功能的乳酸菌，在唾液，和胃肠道以及发酵的蔬菜，肉和乳制品中发现。植物乳杆菌NC8在全世界许多实验室中用作模型菌株，是天然的无质粒植物乳杆菌菌株。植物乳杆菌NC8已经被证明产生双肽细菌素PLNC8αβ，PLNC8αβ被归类为IIb类细菌素。发明人已经证明PLNC8αβ对牙周病原体牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonasgingivalis)有效，并刺激细胞增殖(1，2)。

本发明的思想是利用可溶或固定化形式的未经修饰的或经截短的细菌素PLNC8αβ与抗生素一起的抗菌效果，用于预防和治疗急性和慢性感染，如牙周炎，伤口感染，植入物相关的感染和泌尿道感染。基于细菌素与传统抗生素结合的产品在医疗保健中是极大重要的，并改善公共卫生和对社会经济产生积极影响。

因为在医疗保健中抗生素抗性的发展和传播主要涉及耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和表皮葡萄球菌(MRSE)，因此研究了PLNC8αβ对不同菌株的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的效果。从图1和表1可以看出，PLNC8αβ显著抑制了所有细菌菌株的生长和存活(图1)。

表1

进一步，探究了使用联合疗法是否可以提高抗微生物效果。在联合疗法中，将抗微生物剂的组合用于预防耐药性的发展和缩短治疗时间的长度。调查了PLNC8αβ与不同的传统抗生素一起的组合是否会在表皮葡萄球菌的治疗中有效。在图15中，总结了PLNC8αβ与利福平，万古霉素，庆大霉素或替考拉宁一起的结果。在此出乎意料地发现PLNC8αβ使替考拉宁针对表皮葡萄球菌的MIC(最小抑制浓度)和MBC(最小杀菌浓度)降低了超过15倍(图15)。发现PLNC8αβ和利福平的组合甚至更有效。

当在L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ的存在下治疗表皮葡萄球菌时，利福平的MIC(最小抑制浓度)和MBC(最小杀菌浓度)降低了超过100倍。此外，L-PLNC8αβ使庆大霉素针对表皮葡萄球菌的MIC和MBC降低了15-30倍。L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ使万古霉素的MIC和MBC降低了2倍。(图15和表2)。

表2.使用PLNC8αβ联合疗法使抗微生物效果提高。

这示出了出乎意料强大的协同效果，其中，抗生素针对特定细菌的MIC和MBC降低了多达百倍。在不拘于理论的情况下，这可能归因于PLNC8αβ的膜透化效果，其可损伤细菌膜并因此帮助抗生素通过，因此抗生素更容易达到它们的细胞内靶点(例如，核糖体，RNA聚合酶)。结果是可以显著降低抗生素的浓度并降低抗生素耐药性和细胞毒性副作用这两个问题。

所述膜透化效果示于图23中，其中L-PLNC8αβ有效地裂解表皮葡萄球菌，这通过ATP的剂量依赖性释放得到证实。也证实了当暴露于低浓度的L-PLNC8αβ时细菌发生聚集。此外，在图24中，结果显示，PLNC8αβ引起脂质体的快速膜透化。PLNC8β和PLNC8αβ(1:1)(而不是PLNC8α)的L-形式和D-形式两者在2min后引起了脂质体的完全裂解。

PLNC8αβ和传统抗生素之间的针对葡萄球菌耐药菌株的协同抗微生物效果示于下表3中。这里显示了万古霉素或替考拉宁与L-PLNC8αβ组合针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的效果。

在图25中，CD光谱显示L-和D-PLNC8αβ两者在脂质体中具有有序的二级结构，这表明α-螺旋按照确定的顺序排列以使肽具有活性。

表3.PLNC8αβ和传统抗生素之间针对葡萄球菌耐药菌株的协同抗微生物效果。

*hGISE株

这显示，PLNC8αβ和抗生素的联合疗法是一种有效的治疗策略。在使用ESKAPE病原体和全世界的医院感染的主要原因之一的大肠杆菌的试验期间，这点得到进一步显示。缩写ESKAPE包括6种致病性细菌种类(屎肠球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯氏菌，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，铜绿假单胞菌和肠杆菌)。这些细菌已变得对多种抗生素具有耐药性，并与更高的发病和死亡率关联，指示需要新策略来预防和治疗这些类型的感染。因为多重耐药性是对全球公共卫生的严重威胁，因此WHO将ESKAPE病原体列为优先事件，以促进新抗菌剂的研究和发展。由这些病原体引起的感染通常是医院获得的，并对需要医疗装置(如导管，呼吸机和植入物)的患者造成特别的威胁。

从表4中可见，PLNC8αβ单独并不影响大肠杆菌的生长，然而所述肽的亚MIC浓度显著提高了不同抗生素的效果。

相似地，PLNC8αβ单独针对屎肠球菌既具有抑制作用又具有杀菌作用，并且亚MIC浓度的添加显著提高了不同抗生素的效果。这示于下表5中。

此外，在表6中，结果显示尽管PLNC8αβ单独时不影响铜绿假单胞菌的生长，但所述肽的亚MIC浓度的添加提高了不同抗生素的效果。

表4.PLNC8αβ显著地增强抗生素针对大肠杆菌的抑制和杀菌效果

*与抗生素组合的肽浓度为10μM

表5.PLNC8αβ显著地增强抗生素针对屎肠球菌的抑制和杀菌效果。

*与抗生素组合的肽浓度为1.5μM

表6.PLNC8αβ显著地增强抗生素针对铜绿假单胞菌的抑制和杀菌效果。

*与抗生素组合的肽浓度为15μM

许多医院获得的细菌感染发现于与慢性伤口和医疗装置(包括导管和假体关节植入物)的插入相关联的浅表感染和严重感染中。这可能在随后增加发展为危及生命的病况(例如败血症)的风险。

角质细胞构成表皮中的主要细胞类型。尽管角质细胞的基本功能是形成针对微生物的物理屏障，但这些细胞也参与针对入侵微生物的炎症反应的启动。

在图18中，示出了PLNC8αβ针对金黄色葡萄球菌为抑制性和杀菌的，而与它们针对抗生素的无抗性模式无关。

在图19中，示出了PLNC8αβ促进人角质细胞的伤口愈合，这是在体外使用划痕分析测定的。虽然金黄色葡萄球菌提高了IL-6和CXCL8，但这些炎症介质没有被PLNC8αβ改变。

在图20中，示出了所述肽有效抵消金黄色葡萄球菌对人角质细胞的细胞毒性和炎症作用。

感染的细胞受损而导致IL-6和CXCL8的分泌提高。这里，这些分泌物的显著减少可以被归因于所述肽。在图21中，显示了在用金黄色葡萄球菌感染后，PLNC8促进伤口愈合。

使用猪伤口愈合模型时也显示PLNC8αβ在体内抑制感染并促进伤口愈合。在图22中，单独的或与庆大霉素组合的肽拮抗金黄色葡萄球菌的感染并促进伤口愈合。

在图26中，在存在或不存在PLNC8αβ下的由金黄色葡萄球菌(MOI:1)感染的角质细胞的IncuCyte活细胞分析。单剂量的PLNC8αβ阻止细菌生长并保护细胞长达32h。没有所述肽的细菌生长在8-9h后达到最大水平。在整个实验期间(72h)，PLNC8αβ/庆大霉素(5μg/ml)的组合有效地消除了金黄色葡萄球菌并预防了感染和随后的细胞死亡。

图27.在存在或不存在PLNC8αβ下的由金黄色葡萄球菌(MOI:0.1)感染的角质细胞的IncuCyte活细胞分析。单剂量的PLNC8αβ阻止细菌生长并保护细胞长达42h。没有所述肽的细菌生长在10h后达到最大水平。在整个实验期间(72h)，PLNC8αβ/庆大霉素(5μg/ml)的组合有效地消除了金黄色葡萄球菌并预防了感染和随后的细胞死亡。

针对抗生素的细菌防御的再一个方面是细菌生物膜的形成。细菌生物膜似乎对抗生素，消毒剂化学物质，并对噬菌作用和先天性和适应性炎症防御系统的其他成分建立了抵抗力。因此，至关重要的是治疗能够对抗细菌生物膜的形成，也破坏已经存在的生物膜。

因此细菌素不只使用浮游状态的细菌进行试验，也使用了由表皮葡萄球菌组成的生物膜进行试验。发现PLNC8αβ有效地破坏生物膜并杀死细菌(示于图3中)。此外，PLNC8的α和β肽尽管为更高浓度，也通过本身对生物膜发挥了破坏的效果。

生物膜为细菌的结构化聚生(consortium)，包埋在由多糖，蛋白和细胞外DNA组成的自我产生的聚合物基质中。生物膜从上自下存在营养物质和氧的梯度，位于营养不良区域的细菌细胞的新陈代谢活性下降，倍增时间增加。这些或多或少的休眠细胞造成了一些对抗生素的耐性。因此，重要的是抗微生物剂能够渗透生物膜以使生物膜细菌暴露于抗生素或抗微生物剂，并在那里发挥抗菌效果。

然而，迹象为例如葡萄球菌属生物膜不是完全地对抗生素不渗透，某些荧光标记的抗菌剂(如达托霉素)已显示通过扩散而渗透金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜。

在本发明中，据假设可以通过修饰细菌素来提高PLNC8αβbe的生物膜渗透性。因此，开发了PLNC8αβ的经截短的形式。这些细菌素的经截短的形式更迅速地扩散进入生物膜，这归因于它们有限的尺寸。然后调查了这些经截短的形式是否表达相似于天然细菌素的抗菌活性，或甚至它们是否更有效。

PLNC8α和PLNC8β的经截短的肽分别以6-7个氨基酸的序列构建，以对应于形成α螺旋需要的氨基酸数(示于图8中)。在脂质体系统(类似于细菌)和表皮葡萄球菌两者上试验了经截短的PLNC8α和PLNC8β的效果。用β-肽1-34(全长)，7-34，1-20和7-20获得脂质体膜的破坏，所述破坏通过(6)-羧基荧光素(CF)的释放显示(图9)。当与全长PLNC8α肽组合时，用其他经截短的肽也获得了效果，尽管是以更高的浓度。因此，出乎意料地发现表皮葡萄球菌的生长分别序列β1-20和β7-20最有效地抑制，这些经截短的肽与全长天然PLNC8β(1-34)相比同样有效，或甚至更有效(图9)。

进一步发现，肽β-序列β7-13和β14-20对PLNC8β的效果至关重要，当与β1-6组合时更有效。因此，肽β1-20对抑制表皮葡萄球菌最有效。此外，发现β1-20和β7-20与全长α-肽组合时效果没有进一步提高。

进一步探测经截短的形式的PLNC8α的抗微生物活性，如图10和表2中所示。通过羧基荧光素的释放显示，α-肽的经截短的形式1-22和全长α-肽(1-29)破坏了脂质体的膜。与β-肽联合时，α1-22对表皮葡萄球菌发挥抑制和杀菌效果(图10)。

经截短的α1-22或α1-15与β1-20或β7-20的组合，及对针对表皮葡萄球菌的MIC和MBC的效果示于图11中。α1-22和α1-15没有进一步增强β1-20和β7-20的抑制效果。

因此，本创新涉及PLNC8αβ和抗生素的组合的协同效果，所述效果为针对特定细菌的抗生素的MIC和MBC的若干倍降低。此外，通过截短PLNC8αβ)为更短的α和β肽(例如，α1-22，β1-20和β7-20)，协同抗菌特性得到保持，同时在细菌生物膜中获得了更高的扩散率。这是因为扩散系数随着系统尺寸增加而强力增加。在凝胶例如细菌生物膜中，扩散甚至更受到粒径的影响，因为更大的颗粒也将具有被截留在凝胶的孔中的更高风险。

因此，在一个实施方案中，药物组合物包含第一肽和第二肽，其中，第一肽为PLNC8αβ的肽，其中，PLNC8αβ的肽为肽A或肽B，所述肽A与DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF(SEQID NO 1)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)，所述肽B与SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH(SEQ ID NO 2)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)，其中，当第一肽为肽A时，第二肽B’具有14～34个氨基酸并包含与YTLGIKILWSAYKH(SEQ ID NO 3)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽，当第一肽为肽B时，第二肽A’具有15～29个氨基酸并包含与DLTTKLWSSWGYYLG(SEQ ID NO 4)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽，并且其中，药物组合物进一步包括至少一种抗生素。

因此，如表2所示，根据本发明，组合物提供了出乎意料的高抗微生物效果，其中，所述组合物包含以下组合：全长α与经截短的或全长β以及抗生素一起，或全长β与经截短的或全长α以及抗生素一起，或全长α和全长β的组合(高协同效果，MIC和MBC降低数倍)。此外，包含经截短的α和/或β的组合也具有以下优点：更高的扩散率，导致针对细菌生物膜的活性效果更好。

根据一个实施方案，肽B’与选自由SEQ ID NO 5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24和2组成的组的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)。

在一个实施方案中，肽B’为选自由SEQ ID NO 5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24和2组成的组的序列。

在一个实施方案中，肽A’与选自由SEQ ID NO 1，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37和4组成的组的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)。

在一个实施方案中，肽A’具有选自由SEQ ID NO 1，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37和4组成的组的序列。

在一个实施方案中，肽A’与选自由SEQ ID NO 1，25，26，27，28，29，30和31组成的组的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)。

在一个实施方案中，肽A’具有选自由SEQ ID NO 1，25，26，27，28，29，30和31组成的组的序列。

在一个实施方案中，第一肽为DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF(SEQ ID NO 1)，且第二肽选自SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH(SEQ ID NO 2)，SVPTSVYTLGIKILWSAYKH(SEQ ID NO 5)，和YTLGIKILWSAYKH(SEQ ID NO 3)。

在一个实施方案中，第一肽为DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF(SEQ ID NO 1)，且第二肽为SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH(SEQ ID NO 2)。

在一个实施方案中，第一肽为DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF(SEQ ID NO 1)，且第二肽为SVPTSVYTLGIKILWSAYKH(SEQ ID NO 5)。

在一个实施方案中，第一肽为DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF(SEQ ID NO 1)，且第二肽为YTLGIKILWSAYKH(SEQ ID NO 3)。

在一个实施方案中，第一肽为SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH(SEQ ID NO2)，且第二肽选自DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNL(SEQ ID NO 31)。

在一个实施方案中，第一肽为SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH(SEQ ID NO2)，且第二肽选自DLTTKLWSSWGYYLG(SEQ ID NO 4)。

如本文所描述的序列同一性(％SI)可以通过任何便利的方法进行评估。为此目的可使用将序列对进行比较和对齐的程序，如ALIGN(Myers和Miller,CABIOS,4:11-17，1988)，FASTA(Pearson,Methods in Enzymology,183:63-98,1990)和gapped BLAST(Altschul等.,核酸Res.,25:3389-3402,1997)，或BLASTP(Devereux等.,核酸Res.,12:387,1984)。如果手边没有这样的资源，根据一个实施方案，序列同一性(％SI)可以按(％SI)＝100％*(在成对序列比对中相同残基的Nr)/(最短的序列的长度)而计算。

肽序列的列表提供在表7中。

表7：序列表

为证实PLNC8αβ的肽与抗生素一起的协同效果，从抗生素的三个最大类中选择了抗生素并进行试验：抑制细菌细胞壁合成的抗生素，抑制核酸合成的抗生素，和抑制蛋白合成的抗生素。抗生素与PLNC8αβ的组合提供了强大的协同效果，并使来自所述三类的抗生素的MIC和MBC降低(多达100倍)。如图15所示，评价了替考拉宁，万古霉素，利福平和庆大霉素。这些中，协同效果为(从高到低)利福平[100倍]，庆大霉素[15-30倍]替考拉宁[10倍]和万古霉素[2倍]。因此，PLNC8αβ与利福平的组合显示出最高的效果。

在表4，5和6中示出了PLNC8αβ与选自庆大霉素，利福平，环丙沙星，替考拉宁，左氧氟沙星和美罗培南组成的组的抗生素一起的协同效果。

因此，在一个实施方案中，抗生素选自由抑制细菌细胞壁合成的抗生素，抑制核酸合成的抗生素和抑制蛋白合成的抗生素组成的组。

在一个进一步的实施方案中，抗生素选自由庆大霉素，利福平，环丙沙星，替考拉宁，左氧氟沙星，美罗培南和万古霉素组成的组。

在一个进一步的实施方案中，抗生素选自由庆大霉素，利福平，环丙沙星，替考拉宁，左氧氟沙星和美罗培南组成的组。

在一个进一步的实施方案中，抗生素选自由利福平，庆大霉素，替考拉宁和万古霉素组成的组。

在一个进一步的实施方案中，抗生素选自由利福平，庆大霉素，和替考拉宁组成的组。

细菌生物膜也可试图通过与抗微生物剂的反应来对抗抗生素。相似地，感染通常与由细菌和机体免疫系统两者引起的高蛋白水解活性有关联，这意味着抗微生物肽或蛋白质可能失活。

在本发明中，据假设通过蛋白水解活性的失活通常靶向于特定的序列基序。假设改变对这些靶标攻击的敏感性的细菌素修饰可以增加寿命，并因此增加细菌素的效果。然而，这种修饰有改变肽的分子结构的风险，这可能影响肽功能。

在如果整个肽进行修饰时可以提供结构上稳定的结构的假设下，将肽的所有L-氨基酸用D-氨基酸替换(除了甘氨酸以外所有的α氨基酸能够以两种对映体中的任何一种存在)。也有假设这可能影响所述肽的蛋白水解裂解并因此增加功效。在脂质体系统(类似于细菌)和表皮葡萄球菌两者上试验了PLNC8αβ的L-和D-变体的效果。在破坏脂质体和抑制/杀死表皮葡萄球菌中，PLNC8αβ的D-变体几乎与L-变体一样有效(图4)。对于PLNC8αβ的L-和D-变体，表皮葡萄球菌质膜的微扰(perturbation)分别同样地快速(2min)(图5)。图15显示，在L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ的存在下，当用利福平或替考拉宁治疗表皮葡萄球菌时协同效果得以维持(图15)。

为了分析与PLNC8αβ的L-变体相比，具有D-氨基酸的PLNC8αβ对蛋白水解的裂解是否更稳定和敏感性更低；将D-PLNC8α，D-PLNC8β，L-PLNC8α和L-PLNC8β暴露于胰蛋白酶，并用MALDI-TOF质谱法分析蛋白水解片段的存在(图6)。虽然胰蛋白酶生成了L-PLNC8的α和β肽两者的若干片段，但没有观察到D-PLNC8的α和β肽的明显的片段化。因此，D-变体比L-变体更耐受胰蛋白酶介导的降解。

此外，为了弄清PLNC8αβ(L-和D-变体)是否发挥细胞毒性作用，研究了从人全血分离的红细胞的裂解。然而，没有观察到溶血活性(图7)。因此，在一个实施方案中，在第一肽和/或第二肽中至少90％的氨基酸为D-氨基酸残基。

在图25中，显示了(A)L-PLNC8αβ和(B)D-PLNC8αβ在有或没有脂质体下的CD测量。细菌素在溶液中通常是非结构化的，但由于膜分区(partitioning)，当结合至细菌细胞膜时通常采用更有序的二级结构。然而，结果表明L-和D-PLNC8αβ两者在脂质体中具有有序的二级结构。

D-变体的优点为稳定性提高，和对蛋白水解的裂解的敏感性更低。这使得D-变体肽的寿命更长，从而延长了抗菌效果。

可以引入非天然或修饰的氨基酸，使能够方便偶联化学，包括点击化学(Clickchemistry)方法。细菌素也能够用或N-或C-末端叠氮基来修饰，使其能够与例如环辛炔共轭聚合物发生无铜点击反应(copper-free click reaction)。使用生物可降解的聚合物如透明质酸(HA)，释放速率将会依赖于生物高聚物骨架的水解速率，并可以通过使用不同聚合物来某些程度上进行调整。有趣地，透明质酸酶是由金黄色葡萄球菌表达的，作为毒力因子而降解细胞之间的多糖并因此实现感染的传播。因此，如果生物可降解聚合物为HA，在金黄色葡萄球菌的存在下，肽的释放速率将增加。

PLNC8αβ为双肽细菌素，因此为了调查PLNC8α链和PLNC8β链在细菌素的抑制和杀菌的作用中各自的作用，研究了肽之间不同摩尔比对表皮葡萄球菌的影响。发现1:1的摩尔比在抑制并杀死表皮葡萄球菌中最有效(图2)。然而，PLNC8α链和PLNC8β链的在1:1～1:7之间的比也显示了良好的效果。

因此，在一个实施方案中，第一肽和第二肽以在5:1～1:20，优选1:1～1:7之间，最优选1:1的摩尔比存在。

组合物可包含在10nM～50μM之间的第一肽和/或第二肽。如图15所示，在抗生素的存在下，在微摩尔范围内的浓度有效地减少表皮葡萄球菌。

因此在一个实施方案中，药物组合物包括在10nM～50μM之间的第一肽和/或第二肽。

如图15所示，当在L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ的存在下治疗表皮葡萄球菌时，利福平的MIC和MBC降低超过100倍，导致有效量已经在0.0019μg/ml。

因此，在一个实施方案中，药物组合物包括抗生素的量在0.002μg/ml～50μg/ml之间，例如至少0.01μg/ml～5μg/ml，例如至少0.1μg/ml～1μg/ml，例如至少0.8μg/ml。

因此，在一个实施方案中，药物组合物包括抗生素的量为至少0.78μg/ml的万古霉素，对于替考拉宁至少0.097μg/ml，对于利福平至少0.0019，和对于庆大霉素至少0.0097。

传统上，人们可能认为抗生素治疗是口服施用。这样的治疗可能导致不期望的副作用，例如影响或甚至破坏保护性菌群，或刺激抗生素耐药性的发展。这种治疗也可能导致肠道细菌组成的变化，从而可导致由真菌和其他传染性生物体的重复感染。

PLNC8αβ与抗生素一起可有利地以溶液，霜，凝胶形式或以固定化形式(如下在下文涂层中进一步描述的)局部施用。

制剂可进一步包括溶剂和/或多种赋形剂，例如以稳定所述肽和阻止聚集，例如增溶剂，表面活性剂，填充剂(如碳水化合物)，增稠剂(如聚合物)以增加溶液黏度，防腐剂，载体，盐或糖以稳定蛋白质和获得生理学张力和渗透压，和/或缓冲剂以控制pH。

因此，在一个实施方案中，组合物被配制为溶液，霜，凝胶，或软膏，或以固定化形式配制为在装置上的涂层。

在其它实施方案中，药物组合物用于细菌感染的治疗或预防。

在一个实施方案中，组合物在感染部位局部地施用，例如局部给药。

为了能够治疗局部感染，例如慢性伤口，PLNC8αβ可以与支持材料连接或联合。为了试验这一点，PLNC8αβ被装载在由明胶和甘油组成的制剂(凝胶)中。在凝胶中PLNC8αβ迅速裂解表皮葡萄球菌，含有PLNC8αβ的凝胶完全抑制在琼脂平板上细菌的生长(图13)。在长期储存在4℃至少180天后，在凝胶中PLNC8αβ的活性是稳定的。

因此，在一个实施方案中，组合物被配制为凝胶，其中，所述凝胶还包括明胶和甘油。

将组合物配制为凝胶的作用是提供局部的，长期的抗菌作用。

结果表明，PLNC8αβ针对许多病原体有效，所述病原体负责造成通常难以治疗的严重医院和社区获得性感染(图1-3，11，14，17-18，26-27和表4-6)。此外，PLNC8αβ与广泛范围的抗生素具有协同效果，并能够增强它们的效果2-130倍(图15-16，22，26-27和表2-7)。这些结果暗示，由抗生素耐药性细菌引起的严重感染可以通过应用PLNC8αβ与低浓度的抗生素的联合疗法而被有效治疗。

在一个实施方案中，细菌感染由葡萄球菌属(包括MRSA，MRSE)，链球菌属(例如变形链球菌，星群链球菌，咽峡炎链球菌)，屎肠球菌(包括VRE)，肺炎克雷伯氏菌，鲍氏不动杆菌，铜绿假单胞菌，肠杆菌属和/或大肠杆菌引起。

在一个实施方案中，细菌感染是由葡萄球菌属，链球菌属例如变形链球菌，星群链球菌，咽峡炎链球菌引起的。

在一个实施方案中，细菌感染由葡萄球菌属和/或链球菌属引起。

细菌感染可以由革兰氏阴性细菌引起。

细菌感染可以由革兰氏阳性细菌引起。

细菌感染可以由大肠杆菌引起。

细菌感染可以由肠球菌属引起。

细菌感染可以由铜绿假单胞菌引起。

细菌感染可以由牙龈红棕色单胞菌引起。

这样的细菌是医院获得性感染(HAI)的常见原因。在细菌的生物类别之间，最已知的传染患者的为ESKAPE病原体(屎肠球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯氏菌，鲍氏不动杆菌，铜绿假单胞菌和肠杆菌属)，包括MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和VRE(耐万古霉素肠球菌)，链球菌属和大肠杆菌。因此，本发明的一个优点为可以治疗由对常规抗生素为耐药性的细菌引起的感染。

细菌感染和炎症有时与植入物有关，由细菌在植入物区域的粘附和定殖引起。治疗可包括除去死组织，抗生素，和改善卫生。预防措施包括抛光植入物表面以最小化细菌粘附，这是耗时和昂贵的过程。因此，植入物用抗菌材料涂层或处理可以最小化这些发生率并避免在植入物上产生高度抛光表面的高成本。

因此，包含本发明的第一肽和第二肽(即PLNC8αβ)与抗生素的涂层可以用于向植入物的涂层赋予细菌抗性。

相似地，这样的涂层可以用于应当阻止细菌在表面上定殖的任何医疗装置，或医疗装置的一部分。

医疗装置可也为包含本发明的第一肽和第二肽(即PLNC8αβ)和抗生素的急救带。这将有助于在伤口或感染部位上的局部施用。细菌素和抗生素可或经由柔性接头系接在聚合物支架上，或物理地截留在生物聚合物基质中，其杀菌的性质将会保持，或甚至由于其高局部浓度而得到改善。

在一个实施方案中，组合物以固定化形式配制为在装置上的涂层，其中，装置选自由伤口敷料，整形外科植入物，牙科的植入物，泌尿道导管和泌尿道支架组成的组。

在一个实施方案中，药物组合物用于涂覆装置的至少一部分来限制细菌在装置表面上定殖。

在一个进一步的实施方案中，装置为医疗装置，如假体或伤口敷料。

在一个进一步的实施方案中，细菌为葡萄球菌属(包括MRSA，MRSE)，链球菌属(例如变形链球菌，星群链球菌，咽峡炎链球菌)，屎肠球菌(包括VRE)，肺炎克雷伯氏菌，鲍氏不动杆菌，铜绿假单胞菌，肠杆菌属和/或大肠杆菌。

在一个进一步的实施方案中，细菌为葡萄球菌属和/或链球菌属，如变形链球菌，星群链球菌，咽峡炎链球菌。

结论

因此，表明了以下组合对不同病原体具有快速和直接的效果，而对周围的人细胞没有表达任何毒性效果：全长α与经截短的或全长β与抗生素一起，或全长β与经截短的或全长α与抗生素一起，或经截短的α和经截短的长度β的组合。而且，发现这组合使抗生素的效果和敏感性增强2-130倍。通过D-氨基酸取代PLNC8α/β的L-氨基酸不改变细菌素的抗细菌效果。然而，PLNC8α/β的D-形式针对蛋白水解的裂解更稳定，因此适应于在体内的治疗性用途。

数据表明，以下组合的使用非常适用于感染的治疗：全长α与经截短的或全长β与抗生素一起，或全长β与经截短的或全长α与抗生素一起，或经截短的α和经截短的长度β的组合。这组合可以以凝胶(软膏、乳膏)的可溶性形式，也可以以固定化形式(例如在伤口敷料，整形外科植入物，牙科的植入物，泌尿道导管和支架上)局部地施用，并以无细胞毒副作用的方式起抗菌作用。

这样的组合提供如下优点：它们起效非常快(秒-分钟)；有效和非常强力(纳-微摩尔剂量)；具有广泛的抗细菌谱针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者；促进和/或增强不同抗生素的吸收，活性和功效；使得能够使用更低剂量的抗生素，这减少耐药性的发展；使能够治疗由多样的病原体(包括多重耐药菌，如MRSA)在悬浮或生物膜中引起的复杂感染；对正常菌群影响低或没有影响；细胞毒性作用低或没有；简单和稳定；生产便宜。

这意味着根据本发明的PLNC8αβ和抗生素组合在许多方面优于目前市场上的各种产品，如传统的抗生素，防腐剂和其他更不特异的抗菌物质。

如今对例如由细菌生物膜引起的慢性感染没有抵消和治疗的方法。用抗生素治疗生物膜效果很差并昂贵，而且也存在根除保护性正常菌群和发展抗生素耐药性的风险。本文已显示PLNC8αβ与抗生素协同地发挥作用并能够有效攻击在悬浮或生物膜中的不同的病原体。因此它构成了对棘手感染和相关疾病的更特异的，强力的和直接的抗菌治疗，因此与现有的治疗形式相比，导致更少的人痛苦和更大的健康经济效果。

可以以任何合适的形式或形式的任何组合来实施本发明。尽管上面已经参考一个或多个特定实施方案描述了本发明，但是本发明并不旨在限于这里阐述的特定形式。相反，本发明仅受所附权利要求的限制，并且，在这些所附权利要求的范围内，除了上述具体的实施方案之外，其他的实施方案同样是可能的，例如不同于上述的实施方案的那些。

在权利要求中，术语"包括/包含"不排除其他元素或步骤的存在。此外，尽管被单独列出了，但是可以实施多个装置，元素或方法步骤。另外，尽管各个特征可以被包括在不同的权利要求中，但是可以将这些特征有利地组合，并且包含在不同的权利要求中并不意味着特征的组合是不可行和/或不利的。另外，单数引用不排除多个。术语“一”，“一个”，“第一”，“第二”等不排除多个。

实验性部分

细菌培养条件

金黄色葡萄球菌CCUG 35601(MRSA，Culture Collection，哥德堡大学)和金黄色葡萄球菌ATCC 29213(MSSA，ATCC，Manassas，VA)。表皮葡萄球菌ATCC 12228(ATCC，Manassas，VA)，RP62A，N15和10个已经表征的临床分离的表皮葡萄球菌。分离的大肠杆菌，屎肠球菌(包括VRE)，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯氏菌，肠杆菌属和鲍氏不动杆菌从厄勒布鲁大学医院获得。分离的变形链球菌，星群链球菌和咽峡炎链球菌从马尔默大学(

University)获得。细菌在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上生长，并补充有5％去纤维蛋白的马血，在37℃温育过夜。单个菌落接种到5ml的LB肉汤，并在摇床上(300rpm)在37℃温育过夜。通过活菌计数测定细菌浓度，并将其调整为大约10⁹CFU/ml的相关。

肽合成

除非另有说明，所有的化学物质均购自Sigma Aldrich，且未经进一步纯化而使用。PLNC8α(H2N-DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF-COOH)，PLNC8β(H2N SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH-COOH)，乱序的-PLNC8α(H2N-TWLKYGHGDAKLWSWSKPLNLTFRYQYVK-COOH)，乱序的-PLNC8β(H2N-LKLWNTYGTFSRFYTSKSEVKIAHGIKSIHVPYK-COOH)，和经截短的形式的PLNC8α和PLNC8β是使用常规Fmoc化学，在Quartet自动化多肽合成仪(ProteinTechnologies，Inc)上以100μmol量级合成的。肽的伸长使用四倍过量的氨基酸(Irisbiotech gmbh)和激活剂(TBTU，Iris biothech gmbh)和使用8倍过量的碱(DIPEA)进行。通过用哌啶(20％在DMF中，v/v)处理来完成Fmoc的去除。使用TFA，三异丙基硅烷和水的混合物(95:2.5:2.5，v/v/v)将所有的肽从它们的固体载体切割2h后，过滤，浓缩并在冷的二乙醚中沉淀两次。粗肽是在连接到半制备型HPLC系统(Dionex)的C-18反相柱(Kromatek HiQ-Sil C18HS)上使用含有0.1％TFA的乙腈(10-46％)水溶液梯度纯化的。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，通过MALDI-ToF MS(Applied biosystems)证实了所有肽的质量同一性(Mass identity)。

为了研究PLNC8α和PLNC8β的D-形式的效果和稳定性，在肽合成期间用D-形式的氨基酸取代L-形式的氨基酸。D-PLNC8α，D-PLNC8β，L-PLNC8α和L-PLNC8β对蛋白水解裂解的敏感性是如下分析的：通过将肽暴露于胰蛋白酶16h，然后用MALDI-TOF质谱法测定蛋白水解的片段的存在。

脂质体制备

脂质体通过干膜形成，水合和最后通过聚碳酸酯膜挤出而形成单分散的大型单层囊泡而制备。将脂质1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(POPS)和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(POPC)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，USA)以摩尔比1:99，5:95和10:90混合并同时溶解于氯仿。通过利用氮气流将氯仿蒸发并过夜冻干而形成干脂膜。所述膜用10mM磷酸缓冲液(PB)pH 7或10mM磷酸缓冲液盐水(PBS)pH 7进行水合，并将所述溶液涡旋1min并放在摇床上1h，然后通过孔径100nm的聚碳酸酯膜挤出21次。对于荧光泄漏分析，脂质膜用含有自猝灭浓度(50mM)的5(6)-羧基荧光素(CF)(Sigma Aldrich)的缓冲液(PBS)水合并如以上所述制备脂质体。未封装的CF的除去是使用PD-25柱(GEHealthcare，Uppsala，瑞典)通过凝胶过滤进行的，并用PBS对具有封装的CF的脂质体进行洗脱。

荧光泄漏分析

使用荧光读板仪(Infinite 200，Tecan，Austria)记录了归因于添加了细菌素的脂质体的封装的荧光团CF泄漏，其中λ_ex＝485nm，λ_em＝520nm。CF以自猝灭浓度被封装，而CF释放导致荧光信号的提高。脂质体在PBS中被稀释至25μM(总脂质浓度)，接着单独和组合地添加0，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1和2μM的PLNC8α和β的L-形式或D-形式，以及单独和与PLNC8β组合添加经截短的形式的PLNC8α，以及单独和与PLNC8α组合添加PLNC8β的经截短的形式。为了估计从每一样品的最大释放，在所有测量结束进行了0.5％Triton X-100的最后添加，并在温育15min后估计CF的总量(100％释放)。CF释放表示为每个时间间隔(每分钟进行测量)的百分比释放。百分比CF释放按100×(F–F₀)/(F_T–F₀)计算，其中F₀为在肽添加前CF的初始荧光强度，F为在时间点t的CF的荧光强度，F_T为在添加Triton X-100后的最大荧光。结果示于图4中。

PLNC8αβ的抗微生物活性

肉汤微稀释方法用于确定最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。使用了所述肽的两倍连续稀释，终浓度范围为0.097-50μM。抗生素的终浓度：万古霉素和替考拉宁范围为0.097-50μg/ml，而利福平范围为0.0019-1μg/ml以及庆大霉素0.0097-5μg/ml。细菌素-抗生素组合的效果通过在所有的孔中使用相同浓度系列的抗生素，与恒定浓度的PLNC8αβ(3.1μM)一起而完成。目测和光谱法地(620nm)测定了MIC，作为细菌生长完全被抑制的第一浓度。将导致细菌生长完全抑制的所有浓度培养(10μl)在血琼脂平板上，并将在琼脂上没有观察到生长的最低浓度表示为MBC。所有试验重复至少三次。

显微镜检查

荧光染料Sytox@绿只能穿过受损的膜并当与核酸结合时发出荧光，荧光染料Sytox@绿用于研究PLNC8αβ对表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌(MSSA，MRSA)和链球菌属的抗微生物活性。细菌被洗涤和重悬在Krebs-Ringer葡萄糖缓冲液(KRG)(120mM NaCl，4.9mMKCl，1.2mM MgSO₄，1.7mM KH₂PO₄，8.3mM Na₂HPO₄，和10mM葡萄糖，pH 7.3)中，并在PLNC8αβ的不同组合的存在或不存在下在96孔微孔板中温育2min。用Olympus BX41在40x的放大倍数中捕获图像。

使用电子显微镜来可视化由PLNC8αβ引起的细菌的损伤。简而言之，将细菌造粒并用Krebs-Ringer葡萄糖缓冲液(KRG)(120mM NaCl，4.9mM KCl，1.2mM MgSO₄，1.7mM KH₂PO₄，8.3mM Na₂HPO₄，和10mM葡萄糖，pH 7.3)洗涤。然后将细菌用不同浓度的PLNC8αβ以1:1的比处理5min，接着在pH 7.3的0.1M磷酸缓冲液中的2.5％戊二醛中固定。对用于SEM的样本实施临界点干燥，所述样本使用了溅射镀膜机而包覆了金。将用于TEM的样本在0.1M磷酸缓冲液中洗涤，后固定在0.1M磷酸缓冲液中的2％四氧化锇中2小时并包埋在LX-112(Ladd,Burlington,Vermont,USA)中。通过Leica ultracut UCT/Leica EM UC 6(Leica，Wien，Austria)切割了超薄切片(大约50-60nm)。切片与乙酸铀酰然后柠檬酸铅进行对比，接着在Hitachi HT 7700(Tokyo，日本)中检验。数字图像是通过使用Veleta相机(奥林巴斯软成像解决方案，GmbH，Münster德国)拍摄的。可以在图12中见到三个独立试验的代表性的图像。

圆二色性(CD)光谱法

细菌素在溶液中通常是非结构化的，但由于膜分区，当结合至细菌细胞膜时，通常采取更有序的二级结构。圆二色性光谱法测量在室温，使用1mm比色皿在Chirascan(Applied Photophysics，英国)上进行。对每一样品记录195-280nm的波长扫描3次，取平均值，并使用PB缓冲液(pH 7.4，10mM)进行基线校正。在所有的样品中每一种肽的浓度为30μM，在PB缓冲液中制备。在用脂质体的试验中，最终的脂质浓度为660μM(0.5mg/ml)。为了补偿使用的不同总肽浓度，平均数据被转换为平均残基椭圆率(MRE)。

蛋白水解的降解

使L-和D-两种形式的全长PLNC8αβ(100μM)进行胰蛋白酶(0.125mg/ml，～5μM)在碳酸氢铵缓冲液(50mM，pH 8.5)中，在37℃处理16小时。样品溶液通过添加2.5％TFA而酸化，并在脱水器中在室温干燥。样品被重悬在含有0.1％TFA的MQ水中，使用ZipTip-C18柱(Millipore)脱盐，并利用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为碱使用MALDI-ToF MS(UltraflexXtreme，Bruker Daltonics)分析。

溶血

通过从健康志愿者收集血液在肝素化的真空管中，调查了肽的溶血活性。血液在600×g离心5min，并将红细胞沉淀在PBS中洗涤三次。细胞然后被悬浮在PBS中并添加到96孔板(15％红细胞悬浮液/孔)，所述板含有两倍连续稀释的所述肽。板在37℃温育1h，接着在900×g离心5min，并在540nm测量上清液。溶血活性(％)通过从所有的值减去阴性对照并针对阳性对照(0.5％Triton X-100)归一化而计算，阳性对照被设为100％。所有实验一式两份，重复三遍。

聚集和ATP释放

聚集和ATP的细胞外释放用于研究PLNC8αβ对细菌的效果。ATP使用荧光素/荧光素酶生物发光分析(Sigma，St.Louis，Mo，USA)在细菌悬浮液(2.5×10⁸CFU/ml)中记录。细菌被暴露于不同浓度的PLNC8αβ中，并在Chronolog lumi-aggregometer(Chrono-Log，Haverton，PA，USA)中记录30min的透光率和生物发光的实时变化。基于响应于已知浓度的ATP而记录的生物发光信号来计算ATP的水平。

细菌生物膜

将表皮葡萄球菌RP62A接种在5ml的LB肉汤中，并于37℃在摇床上温育过夜。细菌培养物以1:100稀释到新鲜培养基中，在96孔微孔板中每孔添加100μl的细菌悬浮液并于37℃静置温育20h。通过将板子浸入装有蒸馏水的容器中洗涤孔3次，以除去未附着的细胞。将新鲜LB培养基添加到每一孔(100μl)中，接着添加具有不同浓度的所述肽。将板静置温育1h。将孔中脱落的材料转入新的微孔板，用于在620nm的吸光度测量。余留的附着生物膜用0.1％结晶紫染色15min，然后如上所述在蒸馏水中将板洗涤4次，并允许其在室温干燥2h。使结晶紫在30％乙酸中溶解15min，并在550nm定量吸光度。所有实验一式三份，重复三遍。

细胞培养条件

人角质细胞(HaCaT)培养在补充有10％FBS(FBS，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)的Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM，Fisher Scientific，New York，USA)中，在95％空气、5％CO2和37℃的稳定环境中培养。在传代1-20代使用细胞。

将HaCaT细胞以2x 10⁵细胞每孔的种子数在24孔板中培养过夜。细胞用PLNC8αβ(6.25，12.5和25μM)或MSSA(MOI:0.1，1和10)单独处理24h。在PLNC8αβ的存在或不存在下，通过感染人角质细胞24h，或感染细胞1h接着添加不同浓度的PLNC8αβ6h来进行共刺激。此外，将在有或没有PLNC8αβ下的角质细胞的感染使用IncuCyte活细胞分析系统实时地监控72小时。通过测量绿色荧光蛋白(GFP)的荧光而定量了细菌负荷，并通过测量染色死细胞核的荧光染料Draq7来确定细胞生存力。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

对从被暴露于MSSA和PLNC8αβ的人角质细胞取到的上清液进行ELISA。根据制造商的说明对CXCL8水平(人IL-8ELISA MAX Deluxe，Nordic Biosite，瑞典)和IL-6水平(人IL-6ELISA MAX Deluxe，Nordic Biosite，瑞典)进行定量。

逆转录定量PCR(RT-qPCR)

使用RT-qPCR来确定选定数量的基因的基因表达水平。简而言之，根据制造商的说明使用GeneJET^TM RNA纯化试剂盒(Fermentas，瑞典)提取了RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(Biorad，瑞典)进行逆转录(100ng RNA/样品)。用于SYBR绿(

SYBR绿/ROXqPCR Master混合物，Fermentas，瑞典)的热循环条件由以下步骤组成：在95℃变性步骤10min，接着进行了95℃ 15s和60℃ 60s的40个循环。使用7900HT实时PCR仪(AppliedBiosystems)分析了基因表达。获得的Ct值针对gapdh进行归一化。通过使用ΔΔCt方法确定了基因表达的相对定量。通过使用算式2^ΔΔCt生成了倍数变化。

猪伤口模型

在猪背上造成测量为1.5×1.5cm的全厚度伤口，并用无菌伤口腔室(S2Medical,

)覆盖。在如下条件的每个条件下造成了三个伤口：对照(PBS)，PLNC8αβ，MSSA，MSSA/PLNC8αβ，MSSA/庆大霉素和MSSA/庆大霉素/PLNC8αβ。伤口或不经处理(无菌PBS)，或用PLNC8αβ(50μM)处理或用MSSA(10⁸CFU/ml)感染。猪被送回栏内，在从麻醉恢复期间进行监控。在三天后，伤口用无菌PBS洗涤并开始处理(庆大霉素100μg/ml，PLNC8αβ50μM，或庆大霉素和PLNC8αβ两者的组合，两者分别为10μg/ml和50μM)。此步骤每隔一天重复一次，持续7天(共计对感染的伤口治疗进行了四次给药)。

LDH细胞毒性分析

通过使用LDH细胞毒性分析来测量细胞外乳酸脱氢酶(LDH)活性，从而确定HaCaT细胞的细胞毒性。所述步骤使用Thermo Scientific^TMPierce^TMLDH细胞毒性分析试剂盒，根据制造商的说明书进行。该方法依赖于这样一个事实，如果细胞膜受损，则胞质酶LDH被释放到周围的细胞培养基中。细胞外的LDH发生酶促反应，与分析化学物质结合，最终形成红色甲臜化合物，所述甲臜化合物可以在490nm在光谱仪中被测量。细胞毒性作用相对于未经处理的细胞进行了计算，所述未经处理的细胞被设为0。

统计分析

所有的数据采用了GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software，La Jolla，CA，USA)进行分析。不同处理之间的比较使用了利用Bonferroni′s事后检验的单因素方差分析。参考P值为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

伦理声明

这项工作涉及从人类感染中分离的临床细菌。没有储存来自患者的组织材料或其他生物学材料，只有继代培养的细菌分离物。瑞典法律不要求对人体细菌分离株的工作的伦理批准。有关这些分离株的所有信息均已匿名化。动物实验是在动物实验伦理委员会的严格监管下进行的，并获得了所有适当的伦理许可。

结果

研究了PLNC8αβ对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的不同菌株的效果(表1)。PLNC8αβ显著抑制了所有细菌菌株的生长和存活(图1)。

表1

而且，PLNC8αβ透化并杀死链球菌属(图17)，铜绿假单胞菌。大肠杆菌和屎肠球菌(表4-6)。

为了调查PLNC8α和PLNC8β分别在细菌素的抑制和杀菌作用中的作用，研究了肽之间不同摩尔比对表皮葡萄球菌的影响。发现PLNC8α与PLNC8β1:1的摩尔比在抑制并杀死表皮葡萄球菌上最有效(图2)。然而，发现在1:1和1:7之间的比值也有效。

因为大多数细菌生长并且是复杂生物膜的一部分，相比当它们以浮游生物的状态存在时，在生物膜中它们通常针对抗生素处理更具有耐药性，试验了PLNC8αβ对由表皮葡萄球菌组成的生物膜的效果。发现PLNC8αβ有效地破坏生物膜并杀死细菌(图3)。PLNC8的α和β肽尽管为更高浓度，也通过本身对生物膜发挥了破坏的效果。

对PLNC8αβ的抗菌活性而言，在体内可能受由来自细菌和人细胞两者的蛋白酶所发挥的蛋白水解活性的限制。为了避开用PLNC8αβ的蛋白水解裂解的问题，将通常出现在肽如PLNC8αβ中的L-形式的氨基酸取代为D-形式的氨基酸。在脂质体系统(类似于细菌)和表皮葡萄球菌两者上试验了PLNC8αβ的L-和D-变体的效果。发现在破坏脂质体和抑制和/或杀死表皮葡萄球菌中，PLNC8αβ的D-变体与L-变体一样有效(图4)。此外，对于PLNC8αβ的L-和D-变体而言，表皮葡萄球菌的质膜的微扰(perturbation)同样地快速(2min)(图5)。

为了分析与PLNC8αβ的L-变体相比，具有D-氨基酸的PLNC8αβ对蛋白水解裂解是否更稳定和敏感性更低；将D-PLNC8α，D-PLNC8β，L-PLNC8α和L-PLNC8β暴露于胰蛋白酶，并用MALDI-TOF质谱法分析蛋白水解片段的存在(图6)。虽然胰蛋白酶生成了L-PLNC8的α和β肽两者的若干片段，但没有观察到D-PLNC8的α和β肽的明显的片段化。

为了弄清PLNC8αβ(L-和D-变体)是否发挥细胞毒性作用，研究了从人全血分离的红细胞的裂解。然而，没有观察到溶血活性(图7)。

PLNC8αβ的经截短的形式表达了与天然细菌素相似的抗菌活性，或甚至更有效。分别以6-7个氨基酸的序列构建了PLNC8α和PLNC8β的经截短的肽，对应于形成α螺旋需要的氨基酸数(图8)。在脂质体系统(类似于细菌)和表皮葡萄球菌两者上试验了经截短的PLNC8α和PLNC8β的效果。用β-肽1-34(全长)，7-34，1-20和7-20获得了脂质体膜的破坏，所述破坏通过(6)-羧基荧光素(CF)的释放显示(图9)。当与PLNC8α组合时，用其他经截短的肽也获得了效果，尽管是以更高的浓度。

有趣地，表皮葡萄球菌的生长分别由序列β1-20和β7-20最有效地抑制，这些经截短的肽与全长天然PLNC8β(1-34)相比更有效(图9)。

肽β-序列β7-13和β14-20对PLNC8β的效果至关重要，当与β1-6组合时更有效。因此，肽β1-20在抑制表皮葡萄球菌中最有效。

α-肽的经截短的形式1-22和全长α-肽(1-29)破坏了脂质体的膜(图10)，这是通过羧基荧光素的释放揭示的。然而，α-肽的不同的经截短形式对表皮葡萄球菌没有显著影响。与β-肽联合时，α1-22发挥抑制和杀菌效果(图10)。

为了能够治疗局部感染例如慢性伤口，将PLNC8αβ与支持材料一起使用。PLNC8αβ被装载在由明胶和甘油组成的制剂(凝胶)中。在凝胶中PLNC8αβ迅速裂解表皮葡萄球菌，含有PLNC8αβ的凝胶完全抑制在琼脂平板上细菌的生长(图13)。在长期储存在4℃至少180天后，在凝胶中PLNC8αβ的活性是稳定的。

异质性糖肽中间体表皮葡萄球菌(hGISE)在假体关节感染(PJIs)中是常见的。糖肽治疗，如用万古霉素和替考拉宁治疗在PJI的许多病例中不足够。发明人发现，PLNC8αβ有效抑制从PJI分离的表皮葡萄球菌的不同菌株，包括表皮葡萄球菌(hGISE)(图14)。在抑制表皮葡萄球菌154菌株中，PLNC8αβ的D-形式几乎与L-形式一样有效(图15)。

采用联合疗法既可以预防抗生素耐药性发展又可以缩短治疗时间。还显示了L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ与属于不同种类的不同抗生素(细胞壁合成抑制剂万古霉素和替考拉宁，核酸合成抑制剂利福平和蛋白合成抑制剂庆大霉素)组合在表皮葡萄球菌治疗中的效果。

L-PLNC8αβ和D-PLNC8αβ两者使替考拉宁针对表皮葡萄球菌的MIC和MBC下降超过10倍(图15)。PLNC8αβ和利福平的组合甚至更有效。当在L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ的存在下治疗表皮葡萄球菌时，利福平的MIC和MBC降低超过100倍(图15)。此外，L-PLNC8αβ和D-PLNC8αβ将庆大霉素针对表皮葡萄球菌的MIC和MBC降低超过30倍。然而，L-PLNC8αβ或D-PLNC8αβ将万古霉素的MIC和MBC降低2倍(图15)。

经截短的α-肽1-22与全长β-肽的组合将替考拉宁针对表皮葡萄球菌的MIC和MBC下降超过10倍(图15)，即与利用PLNC8αβ相同的效果(图14)。α1-22和β1-20将替考拉宁的MIC和MBC降低了约4倍，然而，全长α-肽和β1-20没有效果(图16)。如下表8所示，全长和经截短的PLNC8β和PLNC8α显著地放大了替考拉宁和利福平针对表皮葡萄球菌的抑制和杀菌效果。

表8.替考拉宁和利福平针对表皮葡萄球菌

经截短的α-肽1-22与全长β-肽的组合将利福平针对表皮葡萄球菌的MIC下降了大约4倍。而α1-22和β1-20，分别全长α-肽和β1-20，具有2倍的效果(图16)。

PLNC8αβ迅速和显著地透化并杀死不同种的链球菌(变形链球菌，星群链球菌和咽峡炎链球菌)。与变形链球菌相比，星群链球菌和咽峡炎链球菌对PLNC8αβ更易感(图17)。

PLNC8αβ剂量依赖性和迅速地裂解并杀死金黄色葡萄球菌，独立于它们对抗生素的耐药性(MSSA和MRSA)(图18)。

PLNC8αβ在体外促进人角质细胞的伤口愈合。测定使用划痕分析。虽然金黄色葡萄球菌提高了IL-6和CXCL8，但这些炎症介质没有被PLNC8αβ(图19)改变。

PLNC8αβ拮抗人角质细胞的金黄色葡萄球菌介导的细胞毒性和炎症反应，并促进细胞生存力。IL-6和CXCL8的分泌被所述肽显著降低，这点通过il-6和cxcl8的基因表达分析证实。细胞内信号事件涉及c-jun和c-fos，暗示了转录因子AP-1通过MAPK发挥作用(图20)。

在用金黄色葡萄球菌感染后，PLNC8αβ促进在体外的人角质细胞的伤口愈合，并降低细菌诱导的IL-6和CXCL8的分泌(图21)。

在猪伤口愈合模型中示出了PLNC8αβ抑制感染并促进在体内的伤口愈合。肽为单独的或与庆大霉素的组合拮抗感染并促进伤口愈合(图22)。，

PLNC8αβ有效地裂解表皮葡萄球菌，这通过ATP的剂量依赖性释放被证实。(图23)

L-形式和D-形式的PLNC8β和PLNC8αβ(1:1)两者而非PLNC8α在2min后引起了脂质体的完全裂解(图24)。

CD光谱表明L-和D-PLNC8αβ两者在脂质体中具有有序的二级结构(图25)。

由金黄色葡萄球菌(MOI:1)感染角质细胞的IncuCyte活细胞分析显示，PLNC8αβ阻止细菌生长并保护细胞长达32h。无肽的细菌生长在8-9h后达到最大水平，在整个实验期间(72h)，PLNC8αβ/庆大霉素的组合有效地消除了金黄色葡萄球菌并预防了感染和随后的细胞死亡(图26)。

由金黄色葡萄球菌(MOI:0.1)感染角质细胞的IncuCyte活细胞分析显示，PLNC8αβ阻止细菌生长并保护细胞长达42h。无肽的细菌生长在10h后达到最大水平。在整个实验期间(72h)，PLNC8αβ/庆大霉素的组合有效地消除了金黄色葡萄球菌并预防了感染和随后的细胞死亡。(图27)。

PLNC8αβ单独并没有影响大肠杆菌的生长，然而所述肽的亚MIC浓度显著提高了不同抗生素的效果(表4)。

PLNC8αβ单独针对屎肠球菌既抑制又杀菌，并且亚MIC浓度的添加显著提高了不同抗生素的效果(表5)。

PLNC8αβ单独并没有影响铜绿假单胞菌的生长，然而，所述肽的亚MIC浓度提高了不同抗生素的效果(表6)。

参考文献

1)Khalaf,H.,Nakka S.,Sandén,C.,

A.,Scherbak,N.,Hultenby,K.,Aili,D.,Bengtsson,T.(2016)Antibacterial effects of Lactobacillus and bacteriocinPLNC8αβon the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis,BMC Microbiology,18:88.

2)Bengtsson,T.,Zhang,B.,

R.,Wiman,E.,Aili,D.,Khalaf,H.(2017).Dual action bacteriocin PLNC8αβthrough inhibition of Porphyomonas gingivalisinfection and promotion of cell proliferation.Pathogens and Disease,2017 Jun12.Doi:10.1093/femspd/ftx064

Claims

1.药物组合物，包含第一肽和第二肽，其中，所述第一肽为细菌素PLNC8αβ的肽，

其中，细菌素PLNC8αβ的肽为肽A或肽B，

肽A与DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF SEQ ID NO 1具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)，

或

肽B与SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ ID NO 2具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)，

其中，

当所述第一肽为肽A时，所述第二肽B’具有14～34个氨基酸并包含与YTLGIKILWSAYKHSEQ ID NO 3具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽，

当所述第一肽为肽B时，所述第二肽A’具有15～29个氨基酸并包含与DLTTKLWSSWGYYLGSEQ ID NO 4具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)的肽，

其中，所述药物组合物进一步包括至少一种抗生素。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽B’与选自下组的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)：

SVPTSVYTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 5

VPTSVYTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 6

PTSVYTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 7

TSVYTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 8

SVYTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 9

VYTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 10

YTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 3

YTLGIKILWSAYKHR SEQ ID NO 11

YTLGIKILWSAYKHRK SEQ ID NO 12

YTLGIKILWSAYKHRKT SEQ ID NO 13,

YTLGIKILWSAYKHRKTI SEQ ID NO 14,

YTLGIKILWSAYKHRKTIE SEQ ID NO 15

YTLGIKILWSAYKHRKTIEK SEQ ID NO 16

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKS SEQ ID NO 17

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKSF SEQ ID NO 18

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFN SEQ ID NO 19

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNK SEQ ID NO 20

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKG SEQ ID NO 21

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGF SEQ ID NO 22

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFY SEQ ID NO 23

YTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ ID NO 24

SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ ID NO 2。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽A’与选自下组的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性(％SI)：

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF SEQ ID NO 1

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQ SEQ ID NO 25

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYV SEQ ID NO 26

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPY SEQ ID NO 27

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHP SEQ ID NO 28

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKH SEQ ID NO 29

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLK SEQ ID NO 30

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNL SEQ ID NO 31

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWN SEQ ID NO 32

DLTTKLWSSWGYYLGKKARW SEQ ID NO 33

DLTTKLWSSWGYYLGKKAR SEQ ID NO 34

DLTTKLWSSWGYYLGKKA SEQ ID NO 35

DLTTKLWSSWGYYLGKK SEQ ID NO 36

DLTTKLWSSWGYYLGK SEQ ID NO 37

DLTTKLWSSWGYYLG SEQ ID NO 4。

4.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述第一肽为

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF SEQ ID NO 1，

且所述第二肽选自

SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ ID NO 2

SVPTSVYTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 5

YTLGIKILWSAYKH SEQ ID NO 3。

5.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，

所述第一肽为

SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ ID NO 2，

且所述第二肽为

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNL SEQ ID NO 31。

6.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗生素选自由抑制细菌细胞壁合成的抗生素，抑制核酸合成的抗生素和抑制蛋白合成的抗生素组成的组。

7.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗生素选自由庆大霉素，利福平，环丙沙星，替考拉宁，左氧氟沙星，美罗培南和万古霉素组成的组。

8.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，在所述第一肽和/或所述第二肽中至少90％的氨基酸为D-氨基酸残基。

9.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述第一肽和所述第二肽以5:1～1:20，优选1:1～1:7，最优选1:1的摩尔比存在。

10.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包括在100nM～50μM之间的第一肽和/或第二肽。

11.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包括抗生素的量在0.002μg/ml～50μg/ml，例如至少0.01μg/ml～5μg/ml，例如至少0.1μg/ml～1μg/ml之间，例如至少0.8μg/ml。

12.根据上述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制为溶液，霜，凝胶，或软膏，或以固定化形式配制为在装置上的涂层。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制为凝胶，其中，所述凝胶还包括明胶和甘油。

14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述组合物以固定化形式配制为在装置上的涂层，其中，所述装置选自由伤口敷料，整形外科植入物，牙科的植入物，泌尿道导管和泌尿道支架组成的组。

15.药物组合物，其用于细菌感染的治疗或预防，其中，所述药物组合物为权利要求12～14中任一项所述的药物组合物。

16.根据权利要求15所述的用途的药物组合物，其中，所述细菌感染是由葡萄球菌属(Staphylococcus spp)(包括MRSA，MRSE)，链球菌属(Streptococcus spp)(例如变形链球菌(S.mutans)，星群链球菌(S.constellatus)，咽峡炎链球菌(S.anginosus))，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(包括VRE)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，肠杆菌属(Enterobacter spp)和/或大肠杆菌(Escherichia coli)引起的。

17.根据权利要求15所述的用途的药物组合物，其中，所述细菌感染是由葡萄球菌属和/或链球菌属，例如变形链球菌，星群链球菌，咽峡炎链球菌引起的。

18.根据权利要求15～17中任一项所述的用途的药物组合物，其中，所述组合物在感染部位局部地施用，例如局部给药。

19.根据权利要求1～17中任一项所述的药物组合物在涂覆装置的至少一部分以限制细菌在装置表面上定殖中的用途。

20.根据权利要求19所述的药物组合物的用途，其中，所述装置为医疗装置，例如假体或伤口敷料。

21.根据权利要求19或20所述的药物组合物的用途，其中，所述细菌为葡萄球菌属(包括MRSA，MRSE)，链球菌属(例如变形链球菌，星群链球菌，咽峡炎链球菌)，屎肠球菌(包括VRE)，肺炎克雷伯氏菌，鲍氏不动杆菌，铜绿假单胞菌，肠杆菌属和/或大肠杆菌。

22.根据权利要求19～20中任一项所述的药物组合物的用途，其中，所述细菌为葡萄球菌属和/或链球菌属，例如变形链球菌，星群链球菌，咽峡炎链球菌。