KR20200123128A - 병원성 박테리아 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 병원성 박테리아에 관한 것이며, 특히 신규한 항생제 조성물을 이용하여 박테리아 감염을 치료, 예방 또는 개선하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 바실러스(Bacillus) 및 클로스트리듐(Clostridia) 종, 예를 들어 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 미코박테륨(Mycobacterium) 종의 감염을 치료하는데 특히 유용하다. 본 발명은 이러한 제제를 포함하는 약학적 조성물까지 확대된다. 본 발명은 또한 C. 디피실리(C. difficile)와 같은 다른 박테리아에 대한 항균 활성을 나타내는 호기성 바실러스 종을 식별하는 방법, 및 이들 호기성 바실러스 종으로부터 활성 항균 조성물을 단리하는 방법까지 확대된다.

Description

병원성 박테리아
본 발명은 병원성 박테리아에 관한 것이며, 특히 신규한 항생제 제제를 이용한 박테리아 감염의 치료, 예방 또는 개선에 관한 것이다. 본 발명은 바실러스(Bacillus) 및 클로스트리듐(Clostridia) 종, 예를 들어 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 미코박테륨(Mycobacterium) 종의 감염을 치료하는데 특히 유용하다. 본 발명은 이러한 제제를 포함하는 약학적 조성물까지 확대된다. 본 발명은 또한 C. 디피실리(C. difficile)와 같은 다른 박테리아에 대한 항균 활성을 나타내는 호기성 바실러스 종을 식별하는 방법, 및 이들 호기성 바실러스 종으로부터 활성 항균 조성물을 단리하는 방법까지 확대된다.
C. 디피실리 감염(CDI)은 주로 노인과 젊은이에게 영향을 미치는 병원내 감염이다. 그러나 연구에 따르면 항생제 사용 이력이 없는 젊은이와 건강한 개인의 CDI 비율이 증가하고 있다 (1). 역사적으로, 클린다마이신 내성은 인간과 동물에서의 CDI 발병에 있어 가장 큰 기여 요인 중 하나였다 (2). 개발 도상국에서 항생제가 더 많이 사용됨에도 불구하고, 미국 및 영국과 같은 선진국에서의 CDI 비율이 더 높다. 아마도, 과독성 균주의 분포 및 식이 요법과 위생의 차이가 CDI 비율의 차이에 기여할 것이다.
대변 미생물총 이식(FMT)이 재발성 CDI의 치료에 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 단일 치료는 사례의 85-90%를 해결하는 반면, 2회의 치료는 최대 100%까지 해결하는 것이 확실하게 입증되었다 (3-6). FMT의 과학적 근거는, 장내 세균 불균형을 갖는 환자가 건강한 미생물총을 상실하였거나 미생물총이 정상적인 기능을 유지할 수 없다는 두 가지 가정을 기반으로 한다. 전통적인 FMT 기술은 건강한 공여자로부터의 대변 제제에 함유된 안정적이고 생존 가능하며 다양한 미생물 군집을 전달하는 것을 목표로 한다. 치료 활성제(들)는 박테리아, 대변수의 성분(예를 들어, 바이러스체), 또는 잠재적으로, 공여자 인간 세포의 산물을 포함할 수 있다 (7).
FMT의 잠재적인 장기 안전성 문제로 인해 (8, 9), 공여자 대변에서 유래한 박테리아의 정의된 혼합물의 사용(예를 들어 세균 요법)으로 전환이 이루어졌다. 마우스를 이용한 정액 연구에서, 감염된 마우스의 CDI를 억제한 건강한 동물의 대변에서 장내 박테리아 칵테일을 단리하였다 (10). 흥미롭게도, 치료된 동물의 장내 미생물총은 증가된 박테리아 다양성을 갖는 건강한 동물의 장내 미생물총 쪽으로 이동하는 것으로 나타났다. 그 6종은, 대부분 장에 기생하는 미생물총 문 4개 중 3개를 대표하는 완전 및 조건적 혐기성 종을 포함하였다(스타필로코커스 와르네리(Staphylococcus warneri), 엔테로코커스 히래(Enterococcus hirae), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 아네로스티페스 신종(Anaerostipes sp. Nov.), 의간균류 신종(Bacteroidetes sp. Nov), 및 엔테로하브두스 신종(Enterorhabdus sp.nov.)). 이 연구에서, 고압 멸균된 대변, 대변 여과액 및 개별 균주는 감염을 억제하지 못하여, 이들 박테리아가 경쟁에 의해 C. 디피실리 집단을 대체하였다는 결론을 이끌어내었다. 그러나, FMT는, 항생제를 함께 사용하지 않고 1차 CDI 치료제로서 사용되는 경우 효과적인 것으로는 아직 입증되지 않았다.
대변 박테리아의 정의된 또는 혼합된 집단을 사용한 다른 연구들과 함께 (11, 12), 전술된 연구는, CDI를 억제하기 위한 메커니즘으로서의 경쟁적인 배제를 시사하며 활성제가 박테리아 분획으로부터 나온다는 것을 시사한다. 따라서, 상기 활성은 상기 박테리아로부터 유래한 하나 이상의 성분으로부터 발생할 수 있다. 예를 들어, 이식된 박테리아 또는 박테리아 게놈(프로파지)에 통합된 박테리오파지에 의해 생성된 항균 화합물 또는 대사 산물은 이후, 환자에게 전달된 후 활성화되고 방출된다. FMT를 사용하면 박테리아와 함께 대변수가 환자에게 전달되며 이 분획 자체는 박테리아 잔해, 단백질, 항균 화합물, 대사 산물 및 올리고뉴클레오티드/DNA가 풍부하다. 대변 여과액만을 사용한 경우, 멸균 여과액의 비공장 전달 후 만성 재발성 감염을 나타내는 5명의 환자에서 CDI의 증상이 사라졌다 (7). 전달 후 6개월 동안 증상이 제거되었으며, 이는 멸균 대변수가 재발성 CDI를 제거할 수 있음을 입증하였다. 대변수에 존재하는 활성제는 포착하기 어려웠으며 단백질 후보는 식별되지 않았다. 두 가지 설명이 제안되었는데, 첫째는, 유리한 박테리아의 성장을 촉진하기 위해 (패턴 인식 수용체를 통해) 숙주 면역계를 자극할 수 있는 박테리아 세포벽 또는 DNA의 단편이다. 둘째는, 직접 또는 간접적으로 C. 디피실리의 성장을 억제하는, 온순 박테리오파지의 유도 또는 박테리오파지 비리온의 전달을 통한 것이다.
인간 미생물총은 100-1000개 정도의 박테리아 종을 함유하며 개체 간에 상당한 다양성을 가지고 있다 (13, 14). 이 집단은 엄밀하게 혐기성인 미생물에 의해 지배되므로 중요한 질문은 이들이 개체 간에 어떻게 전이되는지에 대한 것이었다. 이는, 인간 위장관에서 발견된 속의 약 60%가 총 장내 미생물총의 30%를 나타내는 포자 형성 박테리아라는 놀라운 발견에 의해 부분적으로 설명될 수 있다 (15). 이 연구에서는, 인간 대변으로부터 단리된 포자 형성 박테리아를 혐기적으로 배양한 다음 16S rRNA의 분석을 사용하여 식별하였다. 분명히, 포자(내생포자)는 숙주 외부에서 무기한으로 생존할 수 있는 능력이 있으므로 다른 인간에게 전달하기에 매우 적합하다.
본 발명은 선행 기술과 관련된 문제를 극복하기 위한 본 발명자들의 연구로부터 유래한 것이다.
포자 형성 박테리아에는 두 가지 유형, 즉 호기성 및 혐기성 종이 존재한다. 위장관은 무산소인 것으로 간주되기 때문에, 혐기성 박테리아가 우세하며 따라서 호기성 대응물보다 더 중요할 것으로 오랫동안 가정되어 왔다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은, 호기성 포자 형성 박테리아가 인간 및 동물의 위장관에 존재하고 이들이 환경으로부터 획득되며 따라서 소위 '외래(allochthonous)' 집단을 형성한다는 것을 인식하였다. 포자 형성자의 호기성 군집은 대부분 바실러스 종이다. 이들 호기성 포자 형성자는 박테리아 검출을 위한 마이크로바이옴-기반 방법을 사용할 때 대부분 눈에 띄지 않는데, 이는, 이들은 종종 포자로서 존재하고 따라서 추출 방법에 대해 내성이기 때문이다. 대신에, 이들은 배양-기반 방법을 사용할 때 가장 잘 검출된다. 따라서, 본 발명자들은, 실제로 C. 디피실리 감염(CDI)과 관련하여 중요한 것은 혐기성 코호트가 아닌 호기성 코호트임을 입증하였다.
특정 항생제는 호기성 바실러스(및 다른 박테리아)를 사멸시키는 것으로 알려져 있으며, 실시예에 기술된 바와 같이, 항생제인 클린다마이신이 특히 CDI와 관련되어 있기 때문에 사용된다. 따라서 클린다마이신의 사용은 CD 포자가 발아 및 성장할 수 있는 기회, 즉 틈새를 제공한다. 본 발명자들은 일부 바실러스 종이, 생물계면활성제 및/또는 항균 활성을 나타내며 놀랍게도 C. 디피실리뿐만 아니라 의학적 또는 수의학적 중요성을 갖는 다른 박테리아(예를 들어, 새우와 같은 동물을 감염시키는 것들)도 용해시킬 수 있는 신규한 항균 조성물(AmyCideTM 또는 AmyCidinTM)을 대량으로 생성함을 입증하였다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, 박테리아 감염의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 및/또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 파괴된 세포 균질액이 제공된다.
유리하게는, 본 발명자들은 이들 박테리아가 예방적으로 및 치료적으로 사용될 수 있음을 입증하였다. 놀랍게도 및 바람직하게는, 박테리아 감염을 효과적으로 퇴치하기 위해 (혐기성, 자생(autochthonous) 박테리아 대신에) 외래 박테리아의 사용이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 박테리아 감염을 퇴치하기 위해 B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 바실러스 서브틸리스의 살아있는 포자가 사용되는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 죽은 포자가 사용되는 것이 바람직하다. 또 다른 구현예에서, 상기 박테리아 감염을 퇴치하기 위해 B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 죽은 세포가 사용된다. 당업자는, 박테리아 포자 또는 세포가 사멸되거나 생존 불가능하게 될 수 있는 몇 가지 방법, 예를 들어 조사(예를 들어, 감마 방사선) 또는 가열(예를 들어, 저온 살균)이 존재함을 이해할 것이다. 상기 죽은 세포는 파손된 또는 파괴된 세포, 즉 예를 들어 초음파 처리 또는 효소, 예를 들어 리소자임에 의해 기계적으로 또는 물리적으로 파괴된 세포를 포함할 수 있다. 이 구현예에서, 상기 파괴된 세포의 외피 및 엑소폴리사카라이드(EPS) 등은 항균 활성을 나타낼 것이다. 따라서, 추가적인 구현예에서, B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 파괴된 세포 균질액이 사용되는 것이 바람직하다. 그러나, 가장 바람직한 구현예에서, 상기 감염을 퇴치하기 위해 B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 살아있는 영양세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질이 사용된다. 실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 상등액 추출물(영양세포 또는 포자를 포함하지 않음, 즉 무세포(cell-free) 샘플임)이 놀랍게도 항균 활성을 나타내는 것을 입증하였다. 따라서, 다른 바람직한 구현예에서, 상기 박테리아 감염을 퇴치하기 위해, 상기 살아있는 영양세포에 의해 생성된 세포외 물질 또는 파괴된 세포 균질액을 포함하는 무세포 샘플(예를 들어, 상등액)이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 사용되는 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주는 SG18, SG57, SG137, SG136, SG185, SG277 및 SG297로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주는 SG277 또는 SG297이다.
바람직하게는, 상기 B. 서브틸리스 균주는 SG17, SG83 및 SG140로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 B. 서브틸리스 균주는 SG140이다.
일 구현예에서, B. 아밀로리쿼파시엔스의 하나 이상의 균주, 또는 상기 세포에 의해 생성된 세포외 물질 또는 파괴된 세포 균질액이 사용된다. 다시 말해서, SG18, SG57, SG137, SG136, SG185, SG277 및 SG297로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주가 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 구현예에서, SG18, SG57, SG137, SG136, SG185, SG277 및 SG297로 구성된 군으로부터 선택된 하나 초과의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주가 사용될 수 있다. 예를 들어, SG277과 SG297이 동시에 사용될 수 있거나, 또는 SG18과 SG57이 동시에 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, B. 서브틸리스의 하나 이상의 균주, 또는 상기 세포에 의해 생성된 세포외 물질 또는 파괴된 세포 균질액이 사용된다. 다시 말해서, SG17, SG83 및 SG140로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 B. 서브틸리스 균주가 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 구현예에서, SG17, SG83 및 SG140로 구성된 군으로부터 선택된 하나 초과의 B. 서브틸리스 균주가 사용될 수 있다. 예를 들어, SG17과 SG83이 동시에 사용될 수 있거나, 또는 SG17과 SG140이 동시에 사용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, B. 아밀로리쿼파시엔스의 하나 이상의 균주가, B. 서브틸리스의 하나 이상의 균주, 또는 상응하는 세포에 의해 생성된 세포외 물질 또는 이로부터 유래한 파괴된 세포 균질액과 조합하여, 사용될 수 있다. 예를 들어, B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 SG277은 B. 서브틸리스 균주 SG17과 함께 사용될 수 있거나, 또는 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 SG297은 B. 서브틸리스 균주 SG140과 함께 사용될 수 있다.
본 발명자들은 다양한 B. 아밀로리쿼파시엔스 및 B. 서브틸리스 균주의 조합을 포함하는 신규한 항균 제제를 제조하였다.
따라서, 제2 양태에서, 하나 이상의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 및/또는 하나 이상의 B. 서브틸리스 균주의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 파괴된 세포 균질액; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클을 포함하는 항균 제제가 제공된다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주는 SG18, SG57, SG137, SG136, SG185, SG277 및 SG297로 구성된 군으로부터 선택된다. SG277 및 SG297이 가장 바람직한 균주이다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 B. 서브틸리스 균주는 SG17, SG183, 및 SG140로 구성된 군으로부터 선택된다. SG140이 가장 바람직한 균주이다.
바람직하게는, 제2 양태의 항균 제제는, 적어도 하나의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 적어도 하나의 B. 서브틸리스 균주의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 이로부터 유래한 파괴된 세포 균질액을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항균 제제는, 복수의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 복수의 B. 서브틸리스 균주의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 이로부터 유래한 파괴된 세포 균질액을 포함한다.
바람직하게는, 제1 또는 제2 양태에 따른, 살아있는 포자, 죽은 포자, 또는 살아있는 영양세포, 또는 죽은 세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 이로부터 유래한 파괴된 세포 균질액은 항균 조성물을 구성한다. 본 발명자들은 상기 놀라운 항균 활성을 담당하는 것은 이 항균 조성물인 것으로 생각한다.
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 (i) 서팩틴(Surfactin) 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 (ii) 이투린(Iturin) 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체를 포함한다.
본 발명자들은, 놀랍게도 리포펩티드와 항생제 사이의 상승작용 효과를 입증하였다. 본 발명자들은 리포펩티드가 미셀(micelle)의 형성을 촉진한다고 생각한다. 이 공정은 유리하게 항생제를 집중시키고, 안정화시키고, C. 디피실리와 같은 박테리아의 사멸을 가능하게 한다. 본 발명자들의 데이터는, 이것이 많은 바실러스(B. 아밀로리쿼파시엔스, B. 서브틸리스 등)의 보편적인 전략임을 입증하며, 그 기본 메커니즘은 미셀을 형성하고 항생제를 집중시키는 메커니즘이며, 장내 병원체를 포함한 병원체의 사멸을 촉진하는 것은 이 상승 작용인 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명의 제3 양태에서, (i) 항생제 및 (ii) 서팩틴 패밀리의 구성원; 이투린 패밀리의 구성원; 및 펜기신(Fengycin) 패밀리의 구성원 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리포펩티드를 포함하는 항생제 조성물이 제공된다.
당업자는 항생제라는 용어가 항균 화합물에 관련된 것이라는 것을 이해할 것이다.
제4 양태에서, 치료에 사용하기 위한, 제3 양태에 따른 항생제 화합물이 제공된다.
제5 양태에서, 박테리아 감염의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, 제3 양태에 따른 항생제 화합물이 제공된다.
본 발명의 제6 양태에서, 박테리아 감염을 치료, 예방 또는 개선하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 하기 중 하나를 투여하는 단계를 포함한다:
(i) B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 파괴된 세포 균질액; 또는
(ii) (i) 항생제 및 (ii) 서팩틴 패밀리의 구성원; 이투린 패밀리의 구성원; 및 펜기신 패밀리의 구성원 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리포펩티드를 포함하는 항생제 조성물.
본 발명의 제7 양태에서, 제3 양태에 따른 항생제 조성물의 식품 또는 식이 보충제로서의 용도가 제공된다.
본 발명의 제8 양태에서, 제3 양태에 따른 항생제 조성물을 포함하는 식이 보충제 또는 식품이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은, 예를 들어 B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 살아있는 포자 또는 살아있는 영양세포와 조합하여 전달되는 경우, 생균제(probiotic)일 수 있다. 상기 식품은 음료일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 식품은 "의료 식품"일 수 있다. 당업자는 "의료 식품"이라는 용어가 이와 관련된 제출된 건강정보(health claim)를 갖는 식품을 지칭한다는 것을 이해할 것이다.
본원에서, "항생제 조성물"이라는 용어는, 제1 양태에 따른, 살아있는 포자, 죽은 포자, 또는 살아있는 영양세포 또는 죽은 세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질 중 임의의 것, 또는 파괴된 세포 균질액, 또는 제2 양태의 제제, 또는 제3 양태의 조성물, 및 본원에 기술된 용도 또는 방법 중 임의의 것에 의해 나타나는 항균 활성을 담당한다. 본 발명의 임의의 양태에서에 따라 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 박테리아 감염은 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아 감염일 수 있다(표 7 참조).
바람직하게는, 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 박테리아 감염은 그람 양성 박테리아 감염이다. 퇴치될 수 있는 그람 양성 박테리아의 예는, 클로스트리듐 종, 바실러스 종, 리스테리아 종(Listeria spp.), 미코박테륨 종, 락토바실러스, 스타필로코커스 종, 연쇄상구균 종(Streptococcus spp.), 및 엔테로코커스 종(Enterococcus spp)을 포함한 후벽군(Firmicutes) 문의 것들을 포함한다. 상기 박테리아는 바실러스 종, 바람직하게는 B. 안트라시스(B. anthracis) 또는 B. 세레우스(B. cereus) 또는 B. 푸밀러스(B. pumilis) 또는 B. 클라우시(B. clausii) 또는 B. 메가테리움(B. megaterium) 또는 B. 퍼무스(B. firmus) 또는 B. 아퀴마리스(B. aquimaris)일 수 있다. 상기 박테리아는 스타필로코커스 종, 바람직하게는 S. 아우레우스 또는 S. 에피더미스(S. epidermis)일 수 있다. 상기 박테리아는 리스테리아 종, 바람직하게는 L. 모노키토게네스(L. monocytogenes)일 수 있다. 상기 박테리아는 엔테로코커스 종, 바람직하게는 E. 페칼리스(E. faecalis)일 수 있다. 상기 박테리아는 M. 스메그마티스(M. smegmatis)일 수 있다. 상기 박테리아는 M. 튜버큘로시스(M. tuberculosis)일 수 있다. 상기 박테리아는 락토바실러스, 바람직하게는 L. 뮤코새(L. mucosae) 또는 L. 퍼멘툼(L. fermentum)또는 L. 람노서스(L. rhamnosus)일 수 있다.
바람직하게는, 상기 박테리아는 클로스트리듐 종 또는 스타필로코커스 종이며, 바람직하게는 C. 디피실리 또는 S. 아우레우스이다.
그러나, 가장 바람직하게는, 상기 박테리아는 클로스트리듐 종이며, 가장 바람직하게는 C. 디피실리이다.
본 발명자들은, 놀랍게도 클로로테타인(Chlorotetaine)이 C. 디피실리에 대해 항균 활성을 갖는다는 것을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 또한 C. 디피실리 감염을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한, 클로로테타인 또는 이의 유도체 또는 유사체까지 확대된다. 본 발명은 또한 C. 디피실리 감염을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한, 클로로테타인 또는 이의 유도체 또는 유사체를 포함하는 약학적 조성물까지 확대된다.
따라서, 다른 양태에서, C. 디피실리 감염을 치료, 예방 또는 개선하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 클로로테타인 또는 이의 유도체 또는 유사체를 투여하거나 또는 투여한 단계를 포함한다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 조성물이 미코박테륨 종에 대해 활성을 가짐을 증명하였다. 따라서, 바람직하게는, 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 박테리아 감염은 미코박테륨 종 감염이다.
바람직하게는, 상기 미코박테륨 종은 미코박테륨 튜버큘로시스 또는 M. 레프래(M. leprae)이고, 가장 바람직하게는 M. 튜버큘로시스이다.
퇴치될 수 있는 그람 음성 박테리아의 예는 엔테로박테리아세아에(Enterobaceriaceae), 예를 들어, 살모넬라 종(Salmonella spp.) 및 에스케리치아 종(Escherichia spp.) 및 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 및 비브리오 종(Vibrio spp.)을 포함한다. 상기 박테리아는 엔테로박터 종, 바람직하게는 E. 애로진스(E. aerogenes)일 수 있다. 상기 박테리아는 에스케리치아 종, 바람직하게는 E. 콜라이(E. coli)일 수 있다. 상기 박테리아는 살모넬라 종, 바람직하게는 S. 티피무륨(S. typhimurium)일 수 있다. 상기 박테리아는 슈도모나스 종, 바람직하게는 P. 에루지노사(P. aeruginosa)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 박테리아는 비브리오 종, 바람직하게는 V. 파라헤몰리티쿠스(V. parahaemolyticus) 또는 V. 하베이(V. harveyi)이다.
본 발명자들은 그람 양성 박테리아에 대해 관찰된 항균 활성이 살균성(bacteriocidal)이고 일부 경우에서는 용균성(bacteriolytic)인 반면, 그람 음성 박테리아에 대하여 관찰된 활성은 정균성(bacteriostatic)이라는 것을 깨달았다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 바실러스 균주에 의해 생성된 항생제 조성물은 살균 또는 용균 특성을 나타낸다.
상기 리포펩티드가 이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체인 경우, 이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체는 이투린 A, 이투린 AL, 이투린 C, 미코수브틸린(Mycosubtilin), 바실로마이신 D(Bacillomycin D), 바실로마이신 F, 바실로마이신 L, 바실로마이신 LC 및 바실로펩틴(Bacillopeptin)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체의 일반식은 하기 화학식 I(여기서 R1 내지 R5는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 R1은 Asn 또는 Asp이고, R2는 Pro, Gln 또는 Ser이고, R3은 Glu, Pro 또는 Gln이고, R4는 Ser 또는 Asn이고 R5는 Thr, Ser 또는 Asn임)에 제시된 바와 같을 수 있다:
Figure pct00001
이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체는 이투린 A [서열번호 1], 이투린 AL [서열번호 2], 이투린 C [서열번호 3], 미코수브틸린 [서열번호 4] 또는 바실로마이신 D [서열번호 5], 바실로마이신 F [서열번호 6], 바실로마이신 L [서열번호 7], 바실로마이신 LC [서열번호 8], 바실로펩틴 A, 바실로펩틴 B 또는 바실로펩틴 C [서열번호 17]일 수 있으며, 이들의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00002
바실로펩틴 A, B 및 C: 시클로 [D-Asn-Ser-Glu-D-Ser-Thr-βAA-Asn-D-Tyr]
[서열번호 17]
(여기서 바실로펩틴 A, B 및 C 각각에 대한 βAA는 하기 화학식 XIII의 R 하에 제시됨):
Figure pct00003
바람직하게는, 이투린 패밀리의 구성원은 이투린 A 또는 이의 활성 유도체이다. 이투린 A가 리포펩티드인 것이 이해될 것이다. 상기 이투린 A 또는 이의 활성 유도체는 C14, C15 또는 C16 이소형(isoform)일 수 있다. 따라서 이투린 A의 활성 유도체는 C14, C15 또는 C16 이소형 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 이투린 A 또는 이의 활성 유도체는 C15 이투린 이소형이다.
일 구현예에서, 이투린 A는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다:
L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-Gln-L-Pro-D-Asn-L-Ser
(여기서 n-C14, i-C15, ai-C15임)
[서열번호 1]
서팩틴 패밀리의 구성원은 시클릭 리포펩티드인 것이 이해될 것이다. 상기 리포펩티드가 서팩틴 패밀리의 구성원인 일 구현예에서, 서팩틴 패밀리의 구성원에 대한 일반식은 하기 화학식 II(여기서 R1 내지 R4는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 R1은 글루타민 또는 글루탐산이고, R2는 류신 또는 발린이고, R3은 발린, 류신 또는 알라닌이고, R4는 류신 또는 발린임)에 제시될 수 있다.
Figure pct00004
서팩틴 패밀리의 구성원은 에스페린(Esperin) [서열번호 9], 리케나이신(Lichenysin) [서열번호 10], 푸밀라시딘(Pumilacidin) [서열번호 11] 및 서팩틴 [서열번호 12]으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00005
(여기서 XL1은 Gln 또는 Glu이고; XL2는 Leu 또는 Ile이고; XL4 및 XL7은 Val 또는 Ile이고
XP7은 Val 또는 Ile이며
XS2는 Val, Leu 또는 Ile이고; XS4는 Ala, Val, Leu 또는 Ile이고; XS7은 Val Leu 또는 Ile임).
바람직하게는, 서팩틴 패밀리의 구성원은 서팩틴 또는 이의 활성 유도체이다. 일 구현예에서, 서팩틴은 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다:
L-Glu-L-XS2-D-Leu-L-XS4-L-ASP-D-Leu-L-XS7
[서열번호 12]
따라서 서팩틴의 활성 유도체는 C12, C13, C14, C15, C16, 또는 C17 이소형 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서팩틴은 C16 이소형이다. 상기 서팩틴 또는 이의 활성 유도체는 C12, C13, C14, C15, C16, 또는 C17 이소형일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 서팩틴 또는 이의 활성 유도체는 C15 이소형이다.
일 구현예에서, 서팩틴은 화학식 III에 제시된 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00006
실시예에 기술된 바와 같이, 이투린 및 서팩틴 패밀리의 구성원들은 서로 상승적으로 작용하여 놀라운 항균 활성을 생성한다. 따라서, 바람직하게는, 상기 조성물은 이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체, 및 서팩틴 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체를 포함한다. 바람직하게는, 이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체, 및 서팩틴 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체는 1:10 내지 10:1, 보다 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 보다 바람직하게는 1:3 내지 3:1, 보다 바람직하게는 1:2 내지 2:1의 비율로, 가장 바람직하게는 약 1:1의 비율로 사용된다.
제3 양태의 항생제 조성물, 또는 제1 양태의, B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 살아있는 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 파괴된 세포 균질액에 의해 나타나는 항균 활성에 기여하는 것, 또는 제2 양태의 제제는 이투린 A의 C15 이소형 및 서팩틴의 C15 이소형을 포함한다.
실시예 및 상기에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 생물계면활성제(리포펩티드) 및 항생제를 포함하는 조성물의 놀라운 상승작용 효과를 입증하였다. 본 발명자들은 또한 상기 항생제 조성물에서의 다른 생물계면활성제, 예를 들어 당지질의 존재가 특히 유리할 수 있다고 생각한다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 제3 양태의 항생제 조성물은 당지질을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 당지질은 람노리피드(Rhamnolipid) 또는 이의 활성 유도체, 및/또는 소포로리피드(Sophorolipid) 또는 이의 활성 유도체이다.
바람직하게는, 상기 당지질은 람노리피드이다. 상기 람노리피드는 모노- 또는 디-람노리피드일 수 있다.
바람직하게는, 상기 람노리피드는 C8, C8:2, C10, C12, C12:2, C14 또는 C14:2 이소형으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 람노리피드는 C12 이소형이다.
일 구현예에서, 상기 람노리피드는 화학식 VIII에 제시된 바와 같은 일반식을 갖는다:
Figure pct00007
(여기서 R1 R2 및 n1은 각각의 이소형에 대해 하기 표에 제시된 바와 같음):
Figure pct00008
일 구현예에서, 상기 소포로리피드는 화학식 IX에 제시된 바와 같은 일반식을 갖는다:
Figure pct00009
상기 및 실시예에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 리포펩티드 및 당지질의 조합을 포함하는 조성물이 용균성임을 입증하였다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도, 항생제 인자와 조합하여 사용되는 경우 본 발명의 조성물이 상승작용 효과를 생성하여, 박테리아 세포의 성장 및 증식을 단순히 정지시킴으로써 작용하는 보통 정균성인 인자, 예를 들어 폴리케타이드(polyketide)는 본 발명의 항생제 조성물이 존재하는 경우 살균 활성을 나타낸다. 당업자는, 살균성이라는 용어는, 존재하는 모든 박테리아를 사멸시킬 수 있고 가장 바람직한 조성물을 지칭한다는 것을 이해할 것이다.
임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 바람직하게는 당지질과 조합된 리포펩티드가, 항생제와 같은 다른 분자를 혼입하거나 흡수할 수 있는 혼합된 미셀을 생성하여 상승작용성 항균 효과를 갖는다고 생각한다. 개별적으로 정균성 또는 용균성인 조성물들이 조합되어 사용되는 경우 개선된 살균 특성을 갖는다.
바람직하게는, 상기 항생제는 클로로테타인 또는 폴리케타이드, 바실리신(Bacilysin), 포슬락토마이신(Phoslactomycin) 또는 이의 활성 유도체이다.
바람직하게는, 상기 항생제는 클로로테타인 또는 폴리케타이드이다. 가장 바람직하게는, 상기 항생제는 클로로테타인이다.
일 구현예에서, 상기 항생제는 클로로테타인이 아니다.
당업자는 클로로테타인(Chlorotetaine)이라는 용어가 클로로테타인(Chlorotetain)으로 지칭될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일 구현예에서, 클로로테타인은 화학식 XII에 제시된 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00010
따라서, 바람직한 구현예에서, 제3 양태의 항생제 조성물은 리포펩티드 및 클로로테타인을 포함한다.
바람직하게는, 제3 양태의 항생제 조성물은 서팩틴 패밀리의 구성원 및 클로로테타인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 항생제는 폴리케타이드이다. 상기 폴리케타이드는 아미코우마신(Amicoumacin), 디피시딘(Difficidin), 옥시디피시딘(Oxydifficidin) 및 살리니피론 A(Salinipyrone A)또는 이들 폴리케타이드 중 어느 하나의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리케타이드는 디피시딘, 옥시디피시딘, 및 아미코우마신으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 아미코우마신은 아미코우마신 A, B 또는 C일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 아미코우마신은 화학식 X에 제시된 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00011
바람직하게는, 상기 폴리케타이드는 디피시딘 또는 옥시디피시딘이다.
일 구현예에서, 상기 디피시딘 또는 옥시디피시딘은 화학식 XI에 제시된 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00012
따라서, 바람직한 구현예에서, 제3 양태의 항생제 조성물은 서팩틴 패밀리의 구성원; 및 디피시딘 또는 옥시디피시딘을 포함한다.
다른 구현예에서, 제3 양태의 항생제 조성물은 서팩틴 패밀리의 구성원; 및 디피시딘 또는 옥시디피시딘을 포함한다.
상기 항생제 조성물은 펜기신 패밀리의 구성원을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 펜기신 패밀리의 구성원의 일반식은 하기 화학식 IV(여기서 R1 내지 R3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 R1은 L 또는 D Tyr이고, R2는 Ala 또는 Val이고 R3은 L 또는 D Tyr임)에 제시된 바와 같을 수 있다:
Figure pct00013
펜기신 패밀리의 구성원은 펜기신 A [서열번호 13], 펜기신 B [서열번호 14], 플리파스타틴 A [서열번호 15] 및 플리파스타틴 B [서열번호 16]로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00014
바람직하게는, 펜기신 패밀리의 구성원은 펜기신 A 또는 이의 활성 유도체이다. 상기 펜기신 A 또는 이의 활성 유도체는 C15, C16, C17 또는 C18 이소형일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 펜기신 A는 C15 펜기신 A 이소형이다. 상기 펜기신 A 또는 이의 활성 유도체는 아세틸화될 수 있다.
일 구현예에서, 펜기신 A는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다:
L-Glu-D-Om-D-Tyr-D-aThr-L-Glu-D-Ala-L-Pro-L-Gln-L-Try-L-IIe
[서열번호 13]
바람직하게는, 펜기신 패밀리의 구성원은 펜기신 B 또는 이의 활성 유도체이다. 상기 펜기신 B 또는 이의 활성 유도체는 C13, C14, C15 또는 C16 이소형일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 펜기신 B는 C15 펜기신 B 이소형이다. 상기 펜기신 B 또는 이의 활성 유도체는 아세틸화될 수 있다.
일 구현예에서, 펜기신 B는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다:
L-Glu-D-Om-D-Tyr-D-aThr-L-Glu-D-Val-L-Pro-L-Gln-L-Tyr-L-IIe
[서열번호 14]
바람직하게는, 본 발명에 따른 항생제 조성물은 미코수브틸린; 모자벤신 A(Mojavensin A); 및 쿠르스타킨(Kurstakin), 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 추가적인 리포펩티드를 포함한다.
상기 미코수브틸린 또는 이의 활성 유도체는 C17 이소형일 수 있다. 일 구현예에서, 미코수브틸린은 화학식 V에 제시된 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00015
상기 모자벤신 A 또는 이의 활성 유도체는 C16 이소형일 수 있다. 일 구현예에서, 모자벤신 A는 화학식 VI에 제시된 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00016
상기 쿠르스타킨 또는 이의 활성 유도체는 C13 이소형일 수 있다. 바람직하게는, 상기 쿠르스타킨은 C15 쿠르스타킨 이소형이다. 일 구현예에서, 쿠르스타킨은 화학식 VII에 제시된 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00017
바람직하게는, 상기 리포펩티드는 펜기신 A이고, 바람직한 구현예에서, 상기 항생제 조성물은 리포펩티드인 이투린 A, 서팩틴 및 펜기신 A를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은, 리포펩티드인 이투린 A 및 서팩틴, 및 펜기신 A; 펜기신 B; 미코수브틸린; 모자벤신 A; 및 쿠르스타킨, 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2개의 추가적인 리포펩티드를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은, 리포펩티드인 이투린 A 및 서팩틴, 및 펜기신 A; 펜기신 B; 미코수브틸린; 모자벤신 A; 및 쿠르스타킨, 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개의 추가적인 리포펩티드를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은, 리포펩티드인 이투린 A 및 서팩틴, 및 펜기신 A; 펜기신 B; 미코수브틸린; 모자벤신 A; 및 쿠르스타킨, 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 4개의 추가적인 리포펩티드를 포함한다.
그러나 가장 바람직한 구현예에서, 상기 항생제 조성물은 리포펩티드인 이투린 A, 서팩틴, 펜기신 A, 펜기신 B, 미코수브틸린, 모자벤신 A 및 쿠르스타킨, 또는 이의 활성 유도체를 포함한다. 실시예에 기술된 바와 같이, 이들 화합물 사이에는 놀라운 상승작용이 존재한다. 실제로, 총 15개의 리포펩티드가 지금까지 식별되었고 그 항균 활성은 부분들의 합보다 크다.
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa 또는 60 kDa보다 큰 분자량을 갖는 복합체를 형성한다. 보다 바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 또는 100 kDa보다 큰 분자량을 갖는 복합체를 형성한다.
본 발명자들은 놀랍게도 상기 항균 활성이 수용성이라는 것을 발견하였. 대부분의 리포펩티드(예를 들어 서팩틴)는 수용성이 아니지만, 본 발명자들은, 계면활성제(예를 들어, 서팩틴, 이투린 및/또는 펜기신 등)와 당지질(예를 들어, 람노리피드)의 조합이 상기 항균 활성을 수용성으로 만들며, 보다 구체적으로, 상기 리포펩티드를 수용성으로 만든다고 가정한다. 본 발명자들은, 본 활성 항생제 조성물의 이러한 고분자량 복합체는, 조합되는 경우, 개별 단량체의 것보다 높으며, 따라서 미셀이 바람직하게 형성됨을 나타냄을 입증하였다(도 20 참조). 유리하게는, 이들 미셀은 세포 용해를 촉진시키도록 작용한다.
따라서, 바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 미셀을 형성한다. 상기 미셀의 평균 직경은 1 nm 내지 500 nm, 1 nm 내지 300 nm, 1 nm 내지 200 nm, 1 nm 내지 160 nm, 1 nm 내지 100 nm, 1 nm 내지 50 nm, 1 nm 내지 15 nm, 2 nm 내지 500 nm, 2 nm 내지 300 nm, 2 nm 내지 200 nm, 2 nm 내지 160 nm, 2 nm 내지 100 nm, 2 nm 내지 50 nm, 2 nm 내지 15 nm, 3 nm 내지 500 nm, 3 nm 내지 300 nm, 3 nm 내지 200 nm, 3 nm 내지 160 nm, 3 nm 내지 100 nm, 3 nm 내지 50 nm, 3 nm 내지 15 nm, 5 nm 내지 500 nm, 5 nm 내지 300 nm, 5 nm 내지 200 nm, 5 nm 내지 160 nm, 5 nm 내지 100 nm, 5 nm 내지 50 nm, 또는 5 nm 내지 15 nm, 10 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 300 nm, 10 nm 내지 200 nm, 10 nm 내지 160 nm, 10 nm 내지 100 nm, 10 nm 내지 50 nm, 또는 10 nm 내지 15 nm일 수 있다. 바람직하게는, 상기 미셀의 평균 직경은 3 nm 내지 160 nm, 가장 바람직하게는 3 nm 내지 15 nm이다.
유리하게는, 이들 미셀은 나노 구조로 응집되고, 보다 안정적이고 내분해성이며, 향상된 용해도를 갖고 단량체 형태보다 더 높은 항균 활성을 지니는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 이들 미셀이 영양세포 점액을 둘러싸는 방대한 엑소폴리사카라이드(EPS) 내에 안정화되거나 포획된다고 생각한다. 본원에 기술된 '활성' 균주는 다량의 생물막 및 생성된 점액 콜로니를 생성하며, 이 두 속성은 모두 다량의 세포외 다당류의 생성을 요구한다.
본원에 기술된 항균 조성물의 항균 활성은 상기 조성물을 생성하는 바실러스 균주의 세포 외피와 관련이 있는 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 상기 B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 세포 표면에 부착하여 박테리아, 바람직하게는 C. 디피실리를 사멸시킨다. 바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 상기 B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스 세포벽, 세포벽 외피 또는 이들의 점액과 결합되거나 이에 연결된다. 예를 들어, 상기 항생제 조성물은 외막 소포에 부착될 수 있다. 예를 들어, 그람 양성 박테리아를 퇴치하는 경우, 세포 외피는 리포테이코산이 풍부한 펩티도글리칸의 두꺼운 층이다. 그람 양성 박테리아는 풍부한 점액을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 이들은 최외층과 결합된 엑소폴리사카라이드(EPS)를 가지는 것으로 가정할 수 있으며, 폴리글루탐산의 가능성도 있다. 따라서, 임의의 가설에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 외층의 EPS는 활성 항균 분자가 내재된 "접착제" 역할을 한다고 생각한다. 또한, 본 발명자들은, 이 EPS 물질이 세포벽으로부터 해리될 수 있다고 가정하며, 이는 무세포 물질(즉, 상등액)의 활성이 검출되는 이유를 설명할 수 있다. 또한, 일부 바실러스 종은 상기 펩티도글리칸 위에 놓인 S-층을 형성할 수 있으며, 이는 본질적으로 결정질인 자기조립층이다. 따라서, 본 발명자들은 이들 균주가 S-층을 갖는다고 생각하는데, 이는 일부 바실러스 균주, 예를 들어, 문헌 [Sidhu & Olsen, Microbiology, 143: 1039-1052]에 기술된 바와 같은 B. 스파이리쿠스(B. sphaericus), B. 브레비스(B. brevis), B. 서브틸리스가 이들을 갖기 때문이다.
따라서, 바람직하게는 본 발명의 항생제 조성물은 엑소폴리사카라이드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 적합한 엑소폴리사카라이드는 단당류를 포함할 수 있으며, 이는 갈락토스, 프럭토스 또는 글루코스일 수 있다. 상기 엑소폴리사카라이드는 또한 아라비노스를 포함할 수 있다. 이들 단량체 각각은 시험된 샘플에서 검출가능하였다.
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 실질적으로 비단백질성이다(그러나 리포펩티드가 존재함을 이해할 것이다).
바람직하게는, 상기 항생제 조성물은 감마-폴리글루탐산을 포함한다. 본 발명자들은 바람직한 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주인 SG277 및 SG297의 게놈 서열이 모두 감마-폴리글루탐산의 생합성에 관여하는 유전자를 가지고 있음을 확인하였다.
따라서 종합하면, 본 발명의 항생제 조성물은 바람직하게는 세포 표면 점액으로부터 유래한 엑소폴리사카라이드 및 γ-PGA의 조합을 갖는 고분자량 및 비단백질성 복합체를 포함한다.
본 발명에 따른 항생제 조성물 및 제제는, 박테리아 감염, 가장 바람직하게는 클로스트리듐 종, 예를 들어 C. 디피실리를 치료, 개선 또는 예방하기 위해, 단일 요법(즉, (i) B. 아밀로리쿼파시엔스 및/또는 B. 서브틸리스의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 영양세포, 또는 상기 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 파괴된 세포 균질액, 또는 (ii) 본 발명의 항생제 조성물의 단독 사용)에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 조성물 및 제제는 박테리아 감염, 예를 들어, 클로스트리듐 종 또는 바실러스 종의 치료, 개선 또는 예방을 위한 공지된 요법의 보조제로서, 또는 이와 조합하여, 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 작용제는 클로스트리듐 종 감염을 치료하기 위한 공지된 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. C. 디피실리에 사용되는 항생제는 클린다마이신, 반코마이신 및 메트로디나졸을 포함한다. C. 디피실리에 사용되는 생균제는 락토바실러스 종, 사카로미세스 종(Saccharomyces spp.) 및 비피도박테리아 종(Bifidobacteria spp.)을 포함한다.
본 발명에 따른 항생제 조성물 및 제제는, 특히 조성물이 사용되는 방식에 따라 다수의 상이한 형태를 갖는, 조성물로 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물은 산제, 정제, 캡슐제, 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 에어로졸, 스프레이, 미셀 용액, 경피 패치, 리포솜 현탁액 또는 치료를 필요로 하는 사람이나 동물에게 투여될 수 있는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 약제의 비히클은 투여 대상에서 내성이 양호한 것이어야 함이 이해될 것이다.
본 발명의 항생제 조성물 및 제제는 다수의 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여가 필요할 수 있으며, 이 경우, 상기 작용제는 예를 들어 정제, 캡슐제 또는 액체의 형태로 경구 섭취될 수 있는 조성물 내에 함유될 수 있고, 이는 식품 또는 음료 내에 존재하는 조성물의 전달을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항생제 조성물 및 제제는 흡입에 의해(예를 들어, 비강내) 투여될 수 있다. 조성물은 또한 국소용으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 크림이나 연고는 피부에 적용될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 설하 투여에 의해 전달될 수 있다.
본 발명에 따른 항생제 조성물 및 제제는 또한 서방형 또는 지연-방출형 장치 내에 혼입될 수 있다. 이러한 장치는 예를 들어 피부 위 또는 아래에 삽입될 수 있으며, 상기 약제는 수 주 또는 수개월에 걸쳐 방출될 수 있다. 상기 장치는 치료 부위에 적어도 인접하게 배치될 수 있다. 이러한 장치는, 본 발명에 따라 사용되는 작용제를 사용한 장기 치료가 요구되고 보통 빈번한 투여(예를 들어, 적어도 매일 투여)가 필요한 경우 특히 유리할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항생제 조성물 및 제제는, 혈류 내로의 주사에 의해 또는 치료를 필요로 하는 부위 내로 직접, 대상에게 투여될 수 있다. 주사는 정맥내(볼루스(bolus) 또는 주입(infusion)) 또는 피하(볼루스 또는 주입), 또는 피내(볼루스 또는 주입)일 수 있다.
필요한 항생제 조성물 및 제제의 양은 이의 생물학적 활성 및 생체 이용률에 의해 결정되며, 이는 투여 방식, 상기 항생제 조성물 및 제제의 투여 방식, 물리화학적 특성, 및 이들이 단일 요법으로서 사용되는지 병용 요법에서 사용되는지에 따라 결정된다는 점이 이해될 것이다. 투여 빈도는 또한, 치료되는 대상 내에서의 상기 항생제 조성물 및 제제의 반감기에 의해 영향을 받는다. 최적 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 사용되는 특정 항생제 조성물 및 제제, 약학적 조성물의 강도, 투여 방식 및 박테리아 감염의 진행에 따라 변화한다. 치료되는 특정 대상에 따른 추가 인자, 예를 들어 대상의 연령, 체중, 성별, 식이 요법 및 투여시간에 따라 투여량을 조정할 필요가 있다.
일반적으로, 어떤 항생제 조성물 또는 제제가 사용되는지에 따라, 0.001 μg/체중 kg 내지 10 mg/체중 kg의 1일 투여량의 본 발명에 따른 항생제 조성물 또는 제제가 박테리아 감염을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 1일 투여량은 0.01 μg/체중 kg 내지 1 mg/체중 kg, 보다 바람직하게는 0.1 μg/체중 kg 및 100 μg/체중 kg, 가장 바람직하게는 약 0.1 μg/체중 kg 내지 10 μg/체중 kg이다.
상기 항생제 조성물 또는 제제는 상기 박테리아 감염의 발병 이전에, 그 동안에 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 1일 투여량은 단일 투여(예를 들어, 매일 1회 주사 또는 경구 투여량)로 제공될 수 있다. 대안적으로, 상기 항생제 조성물 또는 제제는 하루 동안 2회 이상 투여할 필요가 있을 수 있다. 예로서, 상기 항생제 조성물 또는 제제는 0.07 μg 내지 700 mg의 투여량(즉, 체중 70 kg을 가정함)이 하루에 2회(또는 치료되는 박테리아 감염의 중증도에 따라 2회 초과) 투여될 수 있다. 치료를 받고 있는 환자는 기상 시에 제1 투여량을 복용한 다음, 저녁에(2회 투여 섭생법인 경우) 또는 이후 3시간 또는 4시간 간격으로 제2 투여량을 복용할 수 있다. 대안적으로, 서방형 장치를 사용하여, 반복되는 투여량을 투여할 필요 없이 최적 투여량의 본 발명에 따른 항생제 조성물 또는 제제를 환자에게 제공할 수 있다.
환자가 입원하여 항생제를 복용하는 경우 CDI에 걸리는 경향이 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 항생제 조성물 또는 제제는 병원 입원 전에(예를 들어, 처방전 없이 살 수 있는 약으로), 병원에 입원해 있는 동안, 및 퇴원 후 수 일 또는 수 주 동안 투여되는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 항생제 조성물 또는 제제는 상기 박테리아 감염의 재발을 예방하기 위해 사용될 수 있다.
약제 산업에서 통상적으로 사용되는 절차와 같은 공지된 절차(예를 들어, 생체내 실험, 임상 시험 등)를 사용하여, 본 발명에 따른 항생제 조성물의 특정 제형 및 정확한 치료 섭생법(예를 들어, 상기 항생제 조성물 또는 제제의 1일 투여량 및 투여 빈도)을 형성할 수 있다.
제9 양태에서, 본 발명은 또한 제2 양태에 따른 제제를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 약학적 유효량의, 하나 이상의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 및/또는 하나 이상의 B. 서브틸리스 균주의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 세포에 의해 생성된 세포외 물질, 또는 파괴된 세포 균질액을 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체와 조합하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 사용되는 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주는 SG18, SG57, SG137, SG136, SG185, SG277 및 SG297로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주는 SG277 또는 SG297이다. 바람직하게는, 상기 B. 서브틸리스 균주는 SG17, SG83 및 SG140로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 제제는 (i) 항생제 및 (ii) 서팩틴 패밀리의 구성원; 이투린 패밀리의 구성원; 및 펜기신 패밀리의 구성원 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제제는 당지질을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 제제는 서팩틴 패밀리의 구성원 및 클로로테타인을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 제제는 서팩틴 패밀리의 구성원; 람노리피드 및/또는 소포로리피드; 및 클로로테타인을 포함한다.
바람직하게는, 상기 제제는, 항생제; 이투린(바람직하게는 이투린 A); 서팩틴; 및 펜기신 A; 펜기신 B; 미코수브틸린; 모자벤신 A; 및 쿠르스타킨, 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 리포펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제제는, 항생제; 이투린 A; 서팩틴; 및 펜기신 A; 펜기신 B; 미코수브틸린; 모자벤신 A; 및 쿠르스타킨, 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체를 포함한다.
"대상"은 척추동물, 포유동물, 또는 가축일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약제는 임의의 포유동물, 예를 들어 가축(예를 들어, 말), 애완 동물을 치료하는데 사용되거나, 또는 다른 수의학적 응용 분야에 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 대상은 인간이다.
하나 이상의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 및/또는 하나 이상의 B. 서브틸리스 균주의 살아있는 또는 죽은 포자, 또는 살아있는 또는 죽은 영양세포, 또는 상기 세포에 의해 생성된 세포외 물질의 "치료적 유효량"은, 대상에게 투여되는 경우, 상기 감염을 치료하거나 목적하는 효과를 생성하는데 필요한 약물의 양인 임의의 양이다.
예를 들어, 상기 치료적 유효량은 약 0.001 μg 내지 약 1 mg, 바람직하게는 약 0.01 μg 내지 약 100 μg이다. 작용제의 양은 약 0.1 μg 내지 약 10 μg, 가장 바람직하게는 약 0.5 μg 내지 약 5 μg의 양인 것이 바람직하다.
본원에서, "약학적으로 허용가능한 비히클"은 약학적 조성물의 제형화에 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 공지된 화합물의 조합이다.
일 구현예에서, 상기 약학적으로 허용가능한 비히클은 고체일 수 있으며, 상기 조성물은 산제 또는 정제의 형태일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 고체 비히클은 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁화제, 염료, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 비활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅제 또는 정제-붕해제로도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 상기 비히클은 또한 캡슐화 물질일 수 있다. 산제에서, 상기 비히클은 본 발명에 따른 미분된 활성제와 혼합된 미분된 고체이다. 정제에서, 상기 활성제는 필요한 압축 특성을 갖는 비히클과 적합한 비율로 혼합되고 목적하는 형태 및 크기로 압축될 수 있다. 상기 산제 및 정제는 바람직하게는 최대 99%의 활성제를 함유한다. 적합한 고체 비히클은 예를 들어 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 약학적 비히클은 겔일 수 있으며, 상기 조성물은 크림 등의 형태일 수 있다.
그러나, 상기 약학적 비히클은 액체일 수 있고, 상기 약학적 조성물은 용액 형태이다. 액체 비히클은 용액, 현탁액, 유화액, 시럽, 엘릭서(elixir) 및 가압된 조성물을 제조하는데 사용된다. 본 발명에 따른 활성제는 물, 유기 용매, 또는 둘의 혼합물 또는 약학적으로 허용가능한 오일 또는 지방과 같은 약학적으로 허용가능한 액체 비히클에 용해 또는 현탁될 수 있다. 상기 액체 담체는 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁화제, 증점제, 색료, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압 조절제와 같은 다른 적합한 약학적 첨가제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예는 물(상기와 같은 첨가제, 예를 들어 셀룰로스 유도체, 바람직하게는 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨 용액을 부분적으로 함유함), 알코올(1가 알코올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리콜을 포함함) 및 이들의 유도체, 및 오일(예를 들어, 분별 코코넛 오일 및 아라키스 오일)을 포함한다. 비경구 투여의 경우, 상기 비히클은 또한 유성 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액체 비히클은 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에서 유용하다. 가압된 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용가능한 추진제일 수 있다.
멸균 용액 또는 현탁액인 약학적 액체 조성물은, 예를 들어, 근육내, 척추강내, 경막외, 복강내, 정맥내 및 특히 피하 주사에 의해 사용될 수 있다. 상기 작용제는 멸균수, 식염수, 또는 다른 적절한 멸균 주사가능한 매질을 이용하여 투여시에 용해 또는 현탁화될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 제조될 수 있다.
본 발명의 작용제 및 조성물은 다른 용질 또는 현탁화제(예를 들어, 용액을 등장성으로 만들기에 충분한 식염수 또는 글루코스), 담즙산염, 아카시아, 젤라틴, 솔비탄 모노올레에이트, 폴리솔베이트 80(에틸렌 옥사이드와 공중합된 솔비톨의 올레에이트 에스테르 및 이의 무수물) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 작용제는 또한 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물은 고체 형태, 예를 들어, 환제, 캡슐제, 과립제, 정제 및 산제 및 액체 형태, 예를 들어, 용액, 시럽, 엘릭서 및 현탁액을 포함한다. 비경구 투여에 유용한 형태는 멸균 용액, 유화액 및 현탁액을 포함한다.
본 발명의 작용제 및 조성물은 예를 들어 서방형 필름, 웨이퍼 또는 캐플릿(caplet) 형태로 설하 투여될 수 있다.
현재까지, 과학계는 호기성 미생물보다는 혐기성 미생물에 중점을 두어 항균 활성을 식별하고 있다. 계면활성제 분자는 임계 미셀 농도(CMC)보다 높은 농도에서 미셀을 형성하는 것으로 알려져 있다. 또한, 혐기성 미생물로부터 항균 생물계면활성제를 정제 및 농축하기 위해, 산 침전 및 한외여과가 현재 사용되고 있으며, 여기서 CMC보다 더 높은 농도로 계면활성제가 정제될 수 있다. 실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 항균 활성의 식별을 위해 다른 병원체(인간 또는 동물)에 사용될 수 있는 새로운 방법을 개발하였다. 본 발명자들은 황산 암모늄을 사용하여 항균 복합체를 함유하는 고분자량 분획을 침전시킴으로써 항균 활성을 나타내는 호기성 박테리아를 식별하는 것이 가능하다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은, 예를 들어 한외여과를 사용하는 선행 기술의 방법은 고분자량의 항균 화합물을 단리할 수 없다고 생각한다.
따라서, 본 발명의 제10 양태에서, 항균 활성을 나타내는 호기성 바실러스 종을 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은,
(i) 호기성 포자 형성 박테리아를 단리하는 단계;
(ii) 단리된 호기성 포자 형성 박테리아를 배양 배지에서 호기적으로 배양하는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 배양 배지로부터의 호기성 박테리아를 계대배양하는 단계; 및
(iv) 항균 활성을 나타내는 호기성 바실러스 종을 식별하기 위해 단계 (iii)의 계대배양 배지를 사용하여 박테리아 세포 성장의 억제에 대한 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 단계 (i)은 대변, 가장 바람직하게는 균질화된 대변으로부터 호기성 포자 형성 박테리아를 단리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이는 한천 플레이트 상에 도말하고 약 30-42℃에서 약 1-4일 동안 배양함으로써 달성될 수 있다.
바람직하게는, 단계 (ii)는 단리된 박테리아의 콜로니를 (바람직하게는 풍부한 액체 배지 내에서) 약 6-24시간 동안 (예를 들어, 약 30-42℃에서, 바람직하게는 진탕하면서) 호기적으로 배양하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 단계 (iii)은 단계 (ii)의 배양물을 (바람직하게는 풍부한 액체 배지 내에서) 약 12-36시간 동안 (바람직하게는, 약 30-42℃에서, 바람직하게는 진탕하면서) 호기적으로 계대배양하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은 단계 (iv)를 수행하기 전에 단계 (iii)의 배양물로부터 상등액을 수득하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 이 단계는 원심 분리에 의해 성장 배지로부터 세포를 제거하여 상등액을 수득하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 원심 분리는 적어도 8000xg에서 적어도 10분 동안 수행될 수 있다. 상기 상등액은, 예를 들어 적합한 필터 막, 예를 들어 0.45 μm 막을 통해 멸균 여과될 수 있다.
단계 (iv)는 단계 (iii)의 계대배양 배지가 박테리아 세포 성장을 억제하는지 여부를 측정하는데 유용한 임의의 공지된 분석을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 박테리아 세포 성장의 억제에 대해 분석하는 단계 후에, 상기 방법은 항균 조성물을 포함하는 고분자량 분획을 침전시키기 위해 상기 배양물을 처리하는 최종 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 이 최종 단계는 미처리 배양물 또는 상등액을 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 에탄올, 또는 에탄올-물 조합과 접촉시켜 항균 조성물을 포함하는 고분자량 분획을 침전시키는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 바람직한 구현예에서, 이 최종 단계는 미처리 배양물 또는 상등액을 AmSO4와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 5 내지 50%(v/v), 보다 바람직하게는 10 내지 30%(v/v), 보다 바람직하게는 15 내지 25%(v/v), 가장 바람직하게는 18 내지 23%(v/v)의 최종 농도의 AmSO4가 사용된다.
본 발명자들은 상기 항균 조성물을 침전시키는 것 자체가 본 발명의 중요한 양태이며, 항균 활성의 단리를 가능하게 한다고 생각한다.
따라서, 본 발명의 제10 양태에서, 항균 활성을 나타내는 호기성 바실러스 종으로부터 항균 조성물을 단리하는 방법이 제공되며, 상기 방법은,
(i) 성장 배지에서 바실러스 종 세포를 호기적으로 배양하는 단계;
(ii) 항균 조성물을 포함하는 고분자량 분획을 침전시키기 위해 단계 (i)의 배양물을 처리하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 제10 양태의 방법은 적합한 세균학적 분석을 사용하여, 단계 (ii)에서 침전된 고분자량 분획에 대해 박테리아에 대한 항균 활성을 시험하는 단계를 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 제10 양태의 방법은 제10 양태의 방법 후에 수행된다(즉, 유용한 항균 균주가 식별된 후 활성 항균 화합물의 단리).
바람직하게는, 제10 및 제11 양태의 방법은 인간 및 동물에서 소화관 병원체에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐 종, C. 디피실리, E. 콜라이, 살모넬라 종, 캄필로박터 종 등으로부터 항균 활성을 식별 및 단리하기 위해 사용된다.
바람직하게는, 제10 양태의 방법의 단계 (i)은 적합한 성장 배지, 예를 들어 BHIB 브로스(broth)에서 호기성 바실러스 종 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 약 37℃에서 밤새 배양된다.
일 구현예에서, 단계 (ii)는 미처리 배양물 또는 상등액을 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 에탄올, 또는 에탄올-물 조합과 접촉시켜 항균 조성물을 포함하는 고분자량 분획을 침전시키는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 바람직한 구현예에서, 단계 (ii)는 미처리 배양물 또는 상등액을 AmSO4와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 5 내지 50%(v/v), 보다 바람직하게는 10 내지 30%(v/v), 보다 바람직하게는 15 내지 25%(v/v), 가장 바람직하게는 18 내지 23%(v/v)의 최종 농도의 AmSO4가 사용된다.
제10 및 제11 양태의 방법에서 침전되는 고분자량 분획은 적어도 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 또는 60 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 침전되는 고분자량 분획은 적어도 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 또는 100 kDa의 분자량을 갖는다. 보다 바람직하게는, 침전되는 고분자량 분획은 적어도 150 kDa, 200 kDa, 150 kDa, 또는 300 kDa의 분자량을 갖는다.
제10 및 제11 양태의 방법은 바람직하게는 하기를 포함한다:
- 바람직하게는 원심 분리에 의해, 상기 항균 조성물의 침전물을 수득하는 단계.
예를 들어, 상기 원심 분리는 적어도 8000xg에서 적어도 15분 동안 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 하기를 포함한다:
- 바람직하게는 적합한 완충제, 예를 들어 PBS에, 상기 항균 조성물의 침전물을 재현탁시키는 단계.
바람직하게는, 상기 방법은 하기를 포함한다:
- 예를 들어 투석을 사용하여, 과량의 황산 암모늄, PEG, 에탄올 또는 에탄올-물 조합을 제거하고, 바람직하게는 적합한 완충제, 예를 들어 PBS에, 상기 항균 조성물을 재현탁시키는 단계.
바람직하게는, 상기 방법은 하기를 포함한다:
- 크로마토그래피, 바람직하게는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 더욱 바람직하게는 변성 조건 하에서 상기 항균 조성물을 분별하는 단계.
본원에 기술된 모든 특징(임의의 첨부된 청구범위, 요약서 및 도면 포함) 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는, 이러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고는, 상기 양태들 중 임의의 것과 임의의 조합으로 조합될 수 있다.
본 발명을 더 잘 이해하고, 이의 구현예가 어떻게 실시될 수 있는지를 도시하기 위해, 이제 예로서 첨부된 도면을 참조할 것이다.
도 1a는 마우스 그룹에 클린다마이신 및 마우스 위장관로부터 단리된 바실러스의 현탁액을 투여하고, C. 디피실리 균주 630의 포자로 공격한 다음, 마우스를 희생시키고 맹장 샘플을 채취하는 방법을 도시하며; 도 1b는 맹장 샘플에서 측정된 독소 A의 수준을 나타내는 그래프이며; 도 1c는 맹장 샘플에서 측정된 C. 디피실리 CFU의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 2a는 통상적인 케이지(CC) 또는 독립적으로 환기되는 케이지(IVC)에 수용된 마우스로부터 채취한 대변 샘플에서 식별된 호기성 박테리아의 총 수를 나타내는 그래프이며; 도 2b는 동일한 대변 샘플에서 식별된 내열성, 호기성 포자 수를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 B. 서브틸리스(SG17, SG83, SG140) 및 B. 아밀로리쿼파시엔스 분리주(SG18, SG57, SG137, SG136, SG185, SG246, SG277, SG297)의 인간 분리주의 하룻밤 배양물로부터의 무세포 상등액이 여과 멸균되고, C. 디피실리 균주 630에 대한 억제 활성 수준을 정량화하기 위한 미량희석 분석(microdilution assay)에 사용되었음을 나타낸다. y-축은 C. 디피실리의 성장을 억제하는데 필요한 세포외 물질의 최대 희석을 나타낸다. SG378은 활성이 없고 음성 대조군으로 작용하는 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주이고; 도 3b는 공동-배양 분석을 나타낸다. CD630의 기하급수적으로 성장하는 배양물(OD600 약 0.5)에 SG277의 무세포 멸균 여과액을 첨가하였다. 첨가 시간을 화살표로 표시하였다. 성장이 계속되었고 OD600 및 생균 수(CFU/g)가 측정되었다. 기호: ○ 미처리 CD630 CFU; ● CD630 + SG277 여과액; □ CD630 OD600; 및 ■ CD630 + SG277 여과액 OD600.
도 4a는 상이한 온도/저장 조건에서의 동결 건조된 형태의 AmyCideTM(AmyCidinTM)의 안정성을 도시하며; 도 4b는 SG277이 BHIB 배지에서 어떻게 성장했는지를 나타내는 그래프이며; 도 4c는, 시간별 시점에 채취된 SG277의 샘플(도 4b로부터의 것)에 대해, 미량희석 분석을 사용하여 측정된 CD630에 대한 활성이 어떻게 변화했는지를 나타내는 그래프이다. 상기 분석에서, 증가된 억제 활성은 더 높은 희석률과 관련이 있다. 정지기에서의 활성의 종합은 항생제로서의 활성을 정의한다.
도 5a는 CD630 론(lawn)을 갖는 한천 플레이트를 도시하며; 도 5b는 CD630 용해된 론을 갖는 플레이트를 도시한다.
도 6a는 도 1a에 도시된 스케줄을 사용하여 상이한 예방적 치료제들로 5회 투여된(i.g.) 마우스(n = 10)의 그룹에서 채취한 맹장 샘플에서 발견된 C. 디피실리 CFU를 나타내는 그래프이며; 도 6b는 맹장 샘플에서의 독소 A 수준을 보여주는 그래프이며; 도 6c는 맹장 샘플에서의 독소 B 수준을 보여주는 그래프이다. 치료제는 하기와 같았다: 세포 상등액에 현탁된 SG277 하룻밤 배양물(277-SUP); PBS에 현탁된 SG277 하룻밤 배양물(277-PBS); 밤새 성장된 SG277의 멸균 무세포 상등액(SUP); SG277의 정제된 포자(SPORES); 이들의 멸균 무세포 상등액에 현탁된 SG378의 하룻밤 배양물(378); 그리고 동물들은 PBS 완충제(나이브(naive))를 투여받았다.
도 7a는 CD630의 102개의 포자를 사용한 공격(방법) 이전 및 이후에 상이한 예방적 치료제를 투여받은(i.g.) 햄스터(n = 6)의 그룹의 생존 곡선을 도시한다. 치료제는 하기와 같았다: 277-SUP, 277-PBS, SUP, SPORES, 378, 및 나이브. 치료(i.g.) 후 3일째에 CD630 공격이 수행되었고, 이후, 증상에 대해 동물을 모니터링하였다. 증상을 보이는 동물은 희생되었으며; 도 7b는 맹장 샘플에서의 CD630 CFU의 수준을 보여주는 그래프이며; 도 7b는 맹장 샘플에서 CD630 CFU의 수준을 보여주는 그래프이며; 도 7c는 맹장 샘플에서의 독소 A 및 B의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 8a는 20%, 70% 컷(cut), 또는 20%에 이어서 70%(2X)를 사용한 AmSO4 침전을 나타낸다. 12% SDS-PAGE에서 침전물을 수행하고 쿠마시 염색하였다. 염료 프론트(dye front) 가까이에서 백색 고스트 밴드(Ghost Band(GB))가 관찰되었다. 웰 확산 분석(well diffusion assay)을 사용하였을 때, 단지 20% 컷만이 C. 디피실리에 대한 활성 및 생물계면활성제 활성을 가졌고; 도 8b는 쿠마시 블루(Coomassie Blue(CB)), 알시안 블루(Alcian blue(AB)), 오일 레드(Oil Red(OR))로 염색된 AmSO4 침전물 및 염색되지 않은(US) 침전물을 도시하며; 고스트 밴드는 화살표로 표시되었다. 도 8c는 물에 용해되고 Superdex 200 겔 여과 컬럼을 통과한 AmSO4(20%) 침전물의 단백질 농도 및 활성(1/희석률)을 보여주는 그래프이며; 도 8d는 3개의 밴드(B1, B2 및 B3)가 관찰된 SG277 멸균 여과액 분획의 PEG 침전의 CsCl 구배 원심 분리를 도시한다.
도 9a는 CsCl 구배를 통한 원심 분리 후 활성 분획(도 8d의 B2)의 응집체의 전자 현미경 이미지이며; 도 9b는 크기 배제 크로마토그래피 후 응집체의 전자 현미경 이미지이고, 사이즈 마커(size marker)는 100 nm이다.
도 10a는 SG277 생물계면활성제의 RP-HPLC 크로마토그램이다. AmSO4 침전 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 후에, RP-HPLC에 의해 샘플을 분석하였다. 각각의 분획을 MALDI-TOF에 의해 분석하여 이투린 A(분획 1 내지 5), 서팩틴(분획 10 내지 15) 및 펜기신 A 및 B(분획 7 내지 9) 및 미코수브틸린(분획 6)의 상이한 이소형을 나타내는 활성 성분(들)을 식별하였으며; 도 10b는 미량희석 분석을 사용하였을 때의 C. 디피실리에 대한 활성을 도시한다. SEC 분획은 RP-HPLC 분석 전의 미정제 SEC 물질의 활성(1/128)이다. 개별 분획의 합 = 양의 피크의 수학적 총합(1/125). 조합된 양의 피크 = +ve 활성을 갖는 분획을 조합하고 증발시키고 시험하였으며 1/320의 활성을 나타냈다. 조합된 모든 피크 = 분획 1내지 15를 조합하여 증발시키고 항-CD 활성에 대해 시험하였다(1/640). 결합된 음의 피크 = 모든 음의 분획을 조합하여 항-CD 활성에 대해 시험하였다(1/10).
도 11은 B. 서브틸리스 SG17 대 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG277에서의 생물계면활성제 AmyCideTM의 RP-HPLC 비교이다.
도 12는 SG277의 AmSO4 침전된 무세포 상등액으로부터의 SEC 분획이 처리되는 방법, 및 생성된 샘플의 활성을 도시한다.
도 13a는 SG277의 AmSO4 침전된 무세포 상등액으로부터의 SEC 분획에 대한 부피 크기 분포(DLS 분석에 의함)를 도시하며; 도 13b는 도 10a의 분획 3(C15 이투린 A)에 대한 부피 크기 분포(DLS 분석에 의함)를 도시하며; 도 13c는 도 10a의 분획 13(C15 서팩틴)에 대한 부피 크기 분포(DLS 분석에 의함)를 도시한다;
도 14는 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG277 대 SG297의 RP-HPLC 프로파일의 비교이다.
도 15는 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG277 대 B. 서브틸리스 SG83 및 SG140의 RP-HPLC 프로파일의 비교이다.
도 16은 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG277 대 B. 리체니포르미스 SG130의 RP-HPLC 프로파일의 비교이다.
도 17은 미정제 SEC 물질의 SEC-HPLC 분획 1 내지 4를 도시한다.
도 18은 SEC-HPLC 분석으로부터의 개별 분획의 RP-HPLC 컬럼 프로파일을 나타내고, 도 18a는 SEC-HPLC 분획 1이 서팩틴임을 나타내며, 이는 이의 크로마토그래피 프로파일이 SG277의 RP-HPLC 프로파일에 존재하는 서팩틴 피크와 일치하기 때문이며, 도 18b는 SEC-HPLC 분획 2가 이투린과 펜기신의 혼합물임을 나타내며, 이는 이의 크로마토그래피 프로파일이 SG277의 RP-HPLC 프로파일에 존재하는 이투린 및 펜기신 피크와 일치하기 때문이며, 도 18c는 SEC-HPLC 분획 3에 대해 220 nm에서 흡수를 나타내지 않음(단백질 성분이 존재하지 않는 경우 그러할 가능성이 있음)을 도시한다.
도 19는 SEC-HPLC 분획 3의 상세한 분석을 도시한다. SEC-HPLC 분석의 분획 3(도 17로부터의 것)을 RP-HPLC로 분별하고 생성된 분획에 대해 항-CD630 활성을 검사하였다(행 = SEC3). 동시에, SG277로부터의 SEC 미정제 물질을 RP-HPLC로 검사하고, 분획을 항-CD 활성에 대해 검사하였다(행 = SG277). 활성을 갖는 분획은 +로 표지하였다.
도 20은 SEC 물질의 2개의 독립적인 샘플에 대한 Cryo-EM 분석을 도시한다.
도 21a는 SEC 분획의 동적 광산란(DLS) 분석을 도시하고, 도 21b는 C14 서팩틴(RP-HPLC로부터의 분획 13)의 동적 광산란을 도시한다.
도 22a는 시험 물질(샘플)의 첨가 이전 및 이후의 OD600 측정값을 도시하고, 도 22b는 시험 물질 첨가 이전 및 이후의 CFU 판독값을 도시한다.
도 23은 이투린(I), 펜기신(F) 및 서팩틴(S) 또는 조합물(I+F+S)의 RP-HPLC 분획에서의 입자 크기의 DLS 평가를 도시한다.
도 24는 내부 단백질 마커(BSA 및 리소자임)를 사용한 AmSO4 침전물의 SEC 분석을 도시한다.
도 25는 SEC-HPLC 분획 1 내지 3 단독 또는 조합의 CD630에 대한 활성을 도시한다.
도 26은 RP-HPLC 분별로부터의 분획, 및 이투린, 펜기신 및 서팩틴의 상업적인 샘플의 단독 또는 조합의 항-CD 활성에 대한 비교를 도시한다.
도 27은 마이크로플레이트 분석을 사용하여 단백질 농도 및 (A280 nm) 및 항-CD630 활성을 측정함으로써 수행된, PBS 또는 PBS + 0.1% SDS를 사용한 SEC에 의한 AmSO4 침전물의 분석을 도시한다.
도 28은 약물 민감성 M. 튜버큘로시스 H37Rv에 대한 화합물의 MIC를 결정하는 REMA 플레이트를 도시한다. 레사주린(청색)에서 레소루핀(분홍색)으로의 전환은 미코박테리아 성장을 나타낸다. 성장이 없음을 나타내는 제1 청색 웰이 MIC를 결정한다.
도 29는 S. 아우레우스에 대한 화합물의 활성을 도시한다. 다양한 B. 아밀로리쿼파시엔스 또는 B. 서브틸리스 균주의 멸균 여과액을 S. 아우레우스의 기하급수적으로 성장하는 배양물에 첨가하였다. 광학 밀도 판독에 의해 세포 성장을 모니터링하였다.
도 30은 V. 하베이 SG527 OD600 판독값에 대한 화합물의 활성을 도시한다. 화살표는 SG277의 상등액이 첨가된 시간을 나타낸다. 개방 원 = 상등액 없음, 채워진 원 = + SG277.
도 31은 V. 파라헤몰리티쿠스 SG529에 대한 화합물의 활성인 OD600 판독값을 도시한다.
화살표는 SG277의 상등액이 첨가된 시간을 나타낸다.
개방 원 = 상등액 없음, 채워진 원 = + SG277.
도 32는 동결 건조된 형태의 AmyCideTM를 사용하여 수행된 마우스에서의 연구를 위한 투여 섭생법을 도시한다.
도 33은 24시간째에 마우스의 맹장에서의 C. 디피실리 독소 A의 수준을 도시한다. 치료제는 다음과 같았다: 밤새 성장된 SG277의 멸균 무세포 상등액(SUP); SG277 포자 및 영양세포(SP+VC); 동결 건조된 SG277 포자 및 영양세포(SP+VC); 미정제 크기 배제 분획(SUPSEC); PBS 완충제(나이브).
도 34는 24시간째에 마우스의 맹장에서의 C. 디피실리 독소 B의 수준을 도시한다.
도 35는 24시간째에 마우스의 맹장에서의 C. 디피실리 포자 수(CFU/g)를 도시한다.
도 36은 'SEC-HPLC 분획 3'의 질량 분석 프로파일을 도시한다. m/z 값과 함께 피크의 정체성을 도시하였다.
물질 및 방법
일반적인 방법
글리세롤 스톡으로서 C. 디피실리 균주를 저장하고 BHIS 한천 또는 배지(0.1%(w/v) 시스테인 및 5 mg ml-1 효모 추출물로 보충된 뇌 심장 주입 배지(76))에서 관례대로 번식시켰다. C. 디피실리의 모든 배양은 혐기성 챔버(80% N2, 10% H2, 10% CO2; Don Whitley, UK)에서 수행되었다.
균주
클로스트리듐 균주
C. 디피실리 감염(CDI)의 발병 동안 거짓막대장염 환자에서 C. 디피실리 630(에리스로마이신 내성)을 단리하였다 (77). 고독성 균주 R20291 및 고독소 생성 균주 VPI 10463을 비롯한 C. 디피실리의 다른 균주들이 실험실 스톡이었다.
바실러스 균주
2018년 2월 15일에 NCIMB(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA)에 하기 균주들을 기탁하였다.
기탁 번호: NCIMB 42971, 본원에서 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG277로 지칭됨
기탁 번호: NCIMB 42972, 본원에서 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG297로 지칭됨
기탁 번호: NCIMB 42973, 본원에서 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG185로 지칭됨
기탁 번호: NCIMB 42974, 본원에서 B. 서브틸리스 SG140으로 지칭됨
C. 디피실리 의 성장과 포자의 제조
C. 디피실리의 포자는, 이전에 기술된 바와 같이 (36), 혐기성 배양기(Don Whitley, UK)를 사용하여 SMC 한천 플레이트 상에서 성장시켜 제조하였다. 37℃에서 7일 동안 성장시킨 후 포자를 수확하고, 다른 곳에서 기술된 바와 같이 (85), 20% 내지 50% 히스토덴즈(Histodenz) 구배(Sigma)를 통한 원심 분리를 사용하여 포자 펠렛을 추가로 정제하였다. 포자 CFU는 열처리(60℃, 20분) 및 BHISS 한천 플레이트(0.1%(w/v) L-시스테인, 5 mg/ml 효모 추출물 및 포자 발아제 나트륨 타우로콜레이트(0.1% w/v)를 함유하는 뇌 심장 주입 한천) 상에 도말하여 측정하였다.
마우스와 햄스터에서의 장내 포자 형성자의 특성화
케이지 당 4마리의 그룹에 수용된 C57BL/6 마우스(6주령, 암컷)에 클린다마이신(30 mg/kg)을 투여하였다. 클린다마이신 치료 24시간 이전 및 이후에 새로 배설된 대변을 수집한 후, PBS에서 균질화하고, 열처리(68℃, 1h) 및 연속 희석하고, DSM(Difco 포자 형성 배지; (-86)), 또는 인간 소화관 미생물총의 배양에 사용되는 배지 (87)인, 나트륨 타우로콜레이트(1 g/L) 및 L-시스테인(1 g/L)이 보충된 BHI 한천에 도말하였다. 37℃에서 2일 동안 호기적 또는 혐기적으로 플레이트를 배양하였다. 500개의 콜로니를 무작위로 골라 다시 스트리킹(restreak)하였다. 콜로니에서의 포자의 존재를 현미경으로 점검하고, 동일한 조건에서 밤새 계대배양(1/100)하기 전에 필요에 따라 호기성 또는 혐기성 조건을 사용하여 액체 배양물(2 ml)에서 37℃에서 12시간 동안 각 콜로니를 성장시켰다. 이어서, 원심 분리를 사용하고 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 무세포 상등액을 수득하였다. 미량희석 분석을 사용하여 CD630에 대한 활성을 측정하였다(하기 참조). 오일 변위 분석(oil displacement assay) (88)을 사용하여 생물계면활성제 활성을 측정하였다. gyrA 시퀀싱은 바실러스에 대해 이전에 기술된 프로토콜과 프라이머를 사용하였다 (40). 항생제 최소 억제 농도(MIC)는 CLIS(임상 검사 표준 연구소(Clinical and Laboratory Standards Institute))에 의해 규정된 미량희석 방법 (89)을 사용하여 생성되었다.
항- C. 디피실리 활성의 시험관내 분석
a) 한천 확산 분석.
호기성 바실러스 균주는 LB 배지에서 37℃에서 16-18시간 동안 성장시킨 반면, 혐기성 포자 형성자는 혐기성 챔버에서 밤새 BHI + 시스테인 + 나트륨 타우로콜레이트에서 성장시켰다. 샘플을 원심 분리(마이크로퓨즈(microfuge), 8,000 rpm, 10분)하고, 상등액을 여과 멸균(0.45 μm 시린지 필터)하고, 사용할 때까지 얼음 위에 저장하였다. TGY 한천 플레이트를 사전-환원시키고 하룻밤 C. 디피실리 배양물(약 100μl)을 도말한 후 30분 동안 건조시킨 후, 플레이트 당 4-6개의 웰을 절단하였다. TGY 배지는 리터 당 트립신 대두 브로스(30 g), 글루코스(20 g), 효모 추출물(10 g), L-시스테인(1 g), 레사주린(1 mg) 및 한천(15 g)이다. 사용하기 전에 혐기성 챔버에서 4시간 동안 플레이트를 환원시켰다. 감자 보오라(potato borer)를 사용하여 TGY 한천 플레이트에서 5 mm 직경의 웰을 절단하였다. 50 μl의 바실러스 상등액을 표지된 웰에 적용하고, 혐기성 챔버에서 37℃에서 48시간 동안 플레이트를 배양하고, 억제 영역을 측정하였으며(직경), 전형적으로 9-20 mm였다.
b) 미량희석 분석
표지자 배양: 관련 C. 디피실리 균주의 단일 콜로니를 10 ml의 BHIS에 접종하고 혐기성 챔버에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 하룻밤 배양물을 BHIS로 1:100으로 계대 배양하고(전형적으로 10 ml BHIS로 0.1 ml), 37℃에서 6시간 동안 배양하며, 이후 배양물은 사용할 준비가 된다.
플레이트 설정: 180 μl의 멸균 BHIS를 96-웰 U-바닥 마이크로플레이트(Sigma CLS3799)의 제1 행에 피펫팅하고 각 후속 행에 100 μl를 피펫팅하였다.20 μl의 시험할 시료(멸균 여과됨, 0.45 μm)를 제1 행에 피펫팅하고(1:10 희석률). 마이크로플레이트 상의 마지막 행까지(1:1280 희석률) 2배 연속 희석으로 연속 희석한다. 하나의 연속 희석의 경우, '배지 단독(media only)' 대조군도 제1 열의 단일 웰로 피펫팅된다. 각각의 웰에 10 μl의 6시간 C. 디피실리 '표지자 배양물'을 피펫팅하고 플레이트를 혐기성 챔버에서 37℃에서 밤새 배양한다. 밤새 성장시킨 후, 회전 플레이트 진탕기에서 200 rpm에서 2분 동안 마이크로플레이트 내용물을 교반하고, 이후 마이크로플레이트 플레이트 리더를 사용하여 OD600을 판독하였다. 양성 억제 활성은 OD600이 CD630 대조군의 50% 미만인 것으로 정의되었다.
c) 공동-배양 분석
혐기성 조건 하에서 37℃에서 밤새 BHIS 배지에서 C. 디피실리 균주를 성장시켰다. 다음날 5 ml BHIS에 0.5 ml의 하룻밤 배양물을 접종하고 광학 밀도가 약 0.2-0.3 A600 nm에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 이 시점에서, 성장하는 CD 배양물에 1 ml의 새로 제조된(멸균 여과됨, 0.45 μm) 상등액을 멸균적으로 첨가하고 성장을 재개하였다.
예방 치료제의 제조: 25 ml BHIB에서 밤새(18h, 37℃) SG277(또는 SG297 또는 SG378)을 성장시키고, 원심 분리 후 펠렛을 2 ml의 상등액에 현탁시켰다. 상등액을 사용하기 위해, 분취량을 여과 멸균하였다(0.45 μm). 포자의 경우, SG277을 37℃에서 72시간 동안 DSM(Difco 포자 형성 배지; (85)) 한천에서 성장시켰다. 세포 스크레이퍼(scraper)를 사용하여 플레이트로부터 포자 작물을 수확하고, 멸균수로 3회 세척한 다음, 열처리하여 잔류 영양세포를 사멸시켰다. 포자를 물에 현탁시켜 2.5 X 1010 포자/ml의 농도를 획득하였다.
마우스 콜로니화 실험: 동물(C57BL/6, 암컷, 6-7주령)에게 클린다마이신((클린다마이신-2-포스페이트, Sigma; 30 mg/kg)을 i.g. 투여하고, 24시간 후, 102개의 CD630의 포자로 공격하였다. 도 1a에 도시된 스케줄을 사용하여 CD630으로 공격하기 이전 및 이후에 예방적 치료제를 동물 그룹에 투여하였다(0.2 ml, i.g.). 콜로니화의 분석(CFU 및 독소)을 위해 감염 후 24시간째에 맹장을 제거하였다.
햄스터: 골든 시리안 햄스터(암컷)은 16-18주령이었다(Harlan UK Ltd.). 햄스터 공격의 경우, 동물 그룹(n = 6)에 클린다마이신(30 mg/체중 kg)을 투여하고(i.g.), 이어서 3일 후, 102개의 CD630의 포자로 공격하였다. CD630 공격 이전 및 이후에, 전술된 치료제를 동물에 투여하였다(i.g.; 2 ml/투여량). 치료 섭생법은 CD630 공격 이전에 6회 투여하고(-48h, -36h, -24h, -12h, -4h 및 -1h), 이어서, 공격 후 12일 동안 1일 3회였다. 질병 진행 증상에 대해 동물을 모니터링하고 임상 종점에 도달하자마자 도태시켰다. CDI의 증상은 중증/임상 종점(웨트 테일(wet tail) >2cm, 높은 무기력), 경증(웨트 테일 <2cm) 또는 건강함으로 채점되었다. 맹장을 제거하고 CD630 CFU 및 독소 A 및 B에 대해 분석하였다.
콜로니화의 연관성 측정
대변 및/또는 맹장에서의 박테리아 CFU 및 독소의 존재는 콜로니화의 측정값을 제공한다. CFU의 측정을 위해, 공격 후 2 일째에 대변을 수집하고, 70% 에탄올에서 균질화하고, 밤새 배양하고, 멸균수에 연속 희석하고, ChromID 플레이트(BioMerieux)에 도말하였다. 계수 이전에 2일 동안 혐기적으로(37℃) 플레이트를 배양하였다. 추출 완충제(2%(v/v) 태아 송아지 혈청, 페니실린-스트렙토마이신(Sigma P4333; 10 ml/L) 및 피어스(Pierce) 프로테아제 억제제 정제(Thermo 88265)를 함유하는 PBS) 중 1/5(w/v) 희석된 대변(공격 후 24시간째에 수집) 또는 맹장 샘플(죽은 동물로부터의 것)로부터 독소 A 및 B를 회수하였다. 목재 스틱을 사용하여 추출 완충제에서 샘플을 균질화하고 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 원심 분리(14,000 g, 5분) 후 상등액을 수확하고, 여과하고(0.2 μm), 즉시 사용하였다. 공격 후 24시간째에 대변을 수집하였다. 토끼 항-독소 A 및 독소 B('사내(in house)' 시약)를 사용하여 ELISA 플레이트를 코팅하고(1/6,000), 실온에서 밤새 방치하였다. 이후, 2% BSA로 37℃에서 1시간 동안 플레이트를 블로킹(block)시켰다. 대변 추출 샘플을 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 음성 대조군(사전-면역 대변 추출물)과 함께 반복 샘플(Replicate sample)을 사용하였다. 톡소이드 A 및 B의 연속 희석물을 기준으로 사용하였다. 검출 항체는 30℃에서 1시간 동안 배양된 마우스 항-독소 A 및 항-독소 B(사내 시약; 1/1000)였다. HRP-접합된 항-마우스 IgG(Dako; 1/2000)를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. TMB 기질을 사용하여 반응을 전개시키고 450 nm에서의 2M H2SO4 및 OD 판독에 의해 정지시켰다.
통계 분석
이분산에 대한 웰치 t-검정(Welch's t-test for unequal variance)을 사용하여 통계 분석을 계산하고 유의성을 측정하였다(p <0.05). 모든 통계 분석은 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
PEG 침전 및 CsCl 원심 분리
37℃에서 단일 콜로니 BHIB 중의 1L의 배양물을 밤새 성장시키고, 8,000xg에서 10분 동안 원심 분리한 후에 상등액을 수집하였다. 이어서, 상등액을 0.45 μm 막을 통해 멸균 여과하였다. 멸균 상등액에 포화 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 용액(Sigma, 81260)을 8%의 최종 농도로 첨가하고 4℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 용액을 원심 분리하고(4℃에서 30분 동안 10,000xg), 10 ml의 SM 완충제(리터 당; NaCl 5.8 g, MgSO4.7H2O 2 g, 50 ml 1M 트리스-HCl pH 7.5)에 펠렛을 현탁시켰다. 이어서, 4 ml의 1.3g/cm3 CsCl, 4 ml의 1.4g/cm3 CsCl 및 4 ml의 1.5g/cm3 CsCl로 이 순서로 구성된 CsCl 구배 위에, 4 ml의 여과액을 적층하였다. SW32 로터(150,000xg, 18h, 4℃)를 사용하여 Optima XPN-90 초원심 분리기(Beckman Coulter)에서 이 구배를 원심 분리하였다. 원심 분리 후에, 피펫을 사용하여 밴드를 조심스럽게 제거하였다.
활성 분자의 추출 및 정제
37℃에서 BHIB 브로스에서 밤새 세포를 배양한 후에, 8000xg에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액으로부터 박테리아 세포를 제거하고, 0.45 μm 막을 통해 상등액을 멸균 여과하였다. 이어서, 포화 AmSO4 용액(6 ml)을 사용하여 4℃에서 4시간 동안 황산 암모늄(AmSO4)으로 멸균 상등액(24 ml)을 침전시켜, 20%의 최종 농도를 획득하였다. 15분 동안 8000xg에서 원심 분리한 후에, 상등액을 제거하고 침전물을 5 ml PBS에 재현탁시켰다. 과량의 AmSO4를 제거하기 위해, 여과물을 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석 후에, 생성된 여과액에 PBS 중의 1 ml의 0.5%(w/v) SDS를 첨가하고, 2.5 ml를 Superdex 200 컬럼(L × I.D. 30 cm × 10 mm)에 적용하고, 러닝 완충제(running buffer)로서 PBS/0.1% SDS를 사용하여 변성 조건 하에서 크기 배제 크로마토그래피로 분별하였다. 미량희석 분석을 사용하여 CD630에 대한 활성에 대해 분획을 시험하고, 양성 분획을 4℃에서 밤새 투석하여, 남아있는 SDS를 제거하였다. 활성을 나타내는 분획을 125 μm 30 cm x 3.9 mm의 uBondapack Phenyl(Waters)에 적재하고, 600 펌프 및 ABI Kratos 757 흡광도 검출기를 갖는 Waters 600E 시스템 제어기를 사용하여 RP-HPLC로 분리하였다. 이동상 성분은 (A) 60%(v/v) 메탄올 중의 0.5% 아세트산 및 (B) 95%(v/v) 메탄올 중의 0.5%(v/v) 아세트산이었다. 완충제 A에 분획을 주입하고, 0%부터 100%로(60분) 전개되는 용매 B의 선형 구배로 0.5 ml/분의 유속으로 생성물을 용리시켰다. 220 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 용리 패턴을 모니터링하고, EZ-2 Genevac 원심 분리 증발기를 사용하여, 생성된 분획을 농축한 다음, 미량희석 분석을 사용하여 CD630에 대한 활성을 시험하거나, 질량 분석을 사용한 식별을 수행하였다. MALDI-TOF 분석을 위해, RP-HPLC 분획을 α-시아노-4-히드록시신남산 매트릭스 용액(Agilent)과 사전 혼합하고, 이를 TFA(0.01%(w/v) 최종 농도)로 산성화하고, 384 연마된 스테인레스 스틸 MALDI 플레이트(Bruker) 상에 스폿팅하였다. Bruker autoflex III 스마트빔 질량 분석기를 사용하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다. 기기는 적어도 30 ppm의 질량 정확도로 보정되었다.
AmSO4 침전을 위해, 멸균 여과액에 AmSO4(113g/L)를 첨가하여 20% w/v 용액을 수득하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 용액을 원심 분리하고, 펠렛을 PBS에 30x(30 ml의 초기 배양물 = 1 ml AmSO4 ppt)의 농도로 현탁시켰다. 과량의 AmSO4를 제거하기 위해 AmSO4 ppt를 PBS에서 밤새(4℃) 투석하였다. AmSO4 ppt의 활성 = 1/5120. 활성 종을 추가로 정제하기 위해, AmSO4 침전물을 PBS + 0.1% SDS(w/v)에서 Superdex 200 컬럼(10,000 Da - 600,000 Da)을 사용하여 분리하였다. 이는 고분자량 종의 미정제 분리를 가능하게 하였다. 원치 않는 단백질을 변성/선형화하기 위해 SDS를 추가하여 보다 순수하게 분리하였다.
미코박테리아에 대한 화합물의 MIC 시험
레사주린 마이크로타이터 분석(REMA)을 사용하여 화합물의 최소 억제 농도(MIC)를 측정하였다. SG277의 여과 멸균된 상등액을 황산 암모늄(20%)으로 침전시키고 SEC(크기 배제 크로마토그래피)를 실시하였다. M. 튜버큘로시스에 대한 활성에 대해 SEC 분획 1 내지 20을 검사하였다.
간략하게 설명하면, 96-웰 U-바닥 플레이트에서 MB7H9/ADC(BD Biosciences) 배지로 각 화합물의 연속 희석물을 제조하였다. 미코박테륨 튜버큘로시스 H37Rv 및 다약제 내성 미코박테륨 튜버큘로시스(페루(Peru) 분리주)(MDR-TB)를 로그 상으로 성장시키고(OD600=1.0), 모든 웰에 104개의 세포를 첨가하였다. 그 후, 5% CO2에서 37℃에서 10 일 동안 플레이트를 배양하였다. 음성(배지 단독) 대조군 이외에도 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063 μg/ml의 농도 범위의 1차 TB 약물인 이소니아지드(INH) 및 리팜피신(RIF)의 표준화된 연속 희석물을 사용하여 플레이트를 내부적으로 제어하였다. MIC는 완전한 성장 억제를 나타내는 제1 희석으로 결정되었다. 이는 관찰된 색 변화를 기록함으로써 시각적으로 측정되었다.
스타필로코커스 아우레우스 에 대한 활성에 대한 시험관내 시험
37℃(250 ml Bellco 플라스크)에서 BHIB(뇌 심장 주입 브로스)에서 각 균주의 하룻밤(18h) 배양물을 성장시킴으로써, 바실러스 균주에 의해 생성된 세포외 물질의 멸균 여과액을 제조하였다. 배양물을 원심 분리하고(9000xg, 20분), 상등액을 여과 멸균시켰다(0.45 μm). 여과액은 사용할 때까지 얼음 위에 저장하고, 5시간 내에 사용하였다.
37℃에서(250 ml 플라스크에서) 25 ml LB 배지에서 성장시킴으로써 단일 콜로니로부터 새로 S. 아우레우스 배양물을 제조하였다. 배양물이 약 1.0의 OD600에 도달하였을 때, 건조 LB 한천 플레이트(배양물 당 2-4개의 플레이트) 상에 200 μl의 각 배양물을 도말하였다. 접종물이 건조된 후에, 멸균 감자 보오라(또는 유사한 것)를 사용하여 플레이트에 5 mm 원형 웰을 절개하였다(플레이트 당 4-5개의 홀). 100 μl의 멸균 세포외 여과액을 웰에 첨가하고, 이어서 플레이트를 37℃에서 2일 동안 배양하고(플레이트 상향, 뒤집히지 않음), 1일 또는 2일 후에 억제 영역을 판독하였다(억제 영역의 직경 또는 반경). 각 플레이트는 대조군(멸균 PBS 또는 물) 및 각 시험 균주에 대해 사용된 복제물을 가질 것이다.
스타필로코커스 아우레우스 에 대한 활성에 대한 생체내 시험
같은 날, S. 아우레우스 균주를 사용하여 LB 배지를 접종하였다. 성장의 중간-로그 상(mid-log phase)(약 0.2-0.8 OD600)까지 37℃에서 배양물을 성장시켰다. 이어서 배양물을 분할하고 하나의 플라스크에 멸균 세포외 여과액(1/10 희석)을 첨가하였다. 37℃에서 성장을 유지시켰고 OD600 판독값을 매시간 측정하였다(도 29).
비브리오 하베이 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스 에 대한 활성 시험
균주
SG527 V. 하베이 16.6
SG528 V. 하베이 27.4
SG529 V. 파라헤몰리티쿠스
SG530 V. 파라헤몰리티쿠스
28℃에서 LB + 2% NaCl에서 밤새 V. 하베이 SG527을 성장시켰다. 다음날, 1/500 희석물을 새로운 LB + 2% NaCl로 계대배양하고 200 rpm의 진탕 수조에서 28℃에서 배양하였다. 광학 밀도(600 nm) 및 생균 수를 매시간 측정하였다. OD가 0.6에 도달하면, 배양물을 두 부분으로 나누고 SG277의 여과 멸균 배양물 상등액을 첨가하여 1/10의 최종 농도를 획득한 후 OD 측정을 수행하였다.
28℃에서 LB + 2% NaCl에서 밤새 V. 파라헤몰리티쿠스 SG529을 성장시켰다. 다음날, 1/500 희석물을 새로운 LB + 2% NaCl로 계대배양하고 200 rpm의 진탕 수조에서 28℃에서 배양하였다. 광학 밀도(600 nm) 및 생균 수를 매시간 측정하였다. OD가 0.481에 도달하면, 배양물을 두 부분으로 나누고 SG277의 여과 멸균 배양물 상등액을 첨가하여 1/10의 최종 농도를 획득한 후 OD 측정을 수행하였다.
동결 건조 형태의 AmyCide TM 의 안정성 시험
SG277을 제조하고(BHIB에서 37℃에서 밤새 성장) 박테리아를 원심 분리하고 일부를 동결 건조시켰다. 습윤 물질 및 동결 건조된 물질의 일부를 실온, 4℃에 저장하고, 동결시키고, 마이크로플레이트 분석을 이용한 항-C. 디피실리 활성의 분석을 위해 분취량을 취하였다.
동결 건조 형태의 AmyCide TM 의 안정성 시험
마우스의 그룹(n = 8/gp)에 상이한 형태의 시험 물질을 투여하였다(경구, 위내(intra-gastric(i.g.)), 0.2 ml/투여량). 사용된 섭생법을 하기에 제시하였으며, CD630(C. 디피실리 균주 630; 100 포자)으로 공격하기 4시간 전에 물질의 1차 경구 투여가 수행된다. 동물을 IVC(독립적으로 환기되는 케이지)에 개별적으로 수용하였다. CDI의 기본 동물 모델은, CDI 증상이 발생하지 않지만 맹장 또는 대변에서의 C. 디피실리 독소와 박테리아 cfu의 존재로 인해 콜로니화가 나타나는 '콜로니화 모델'이었다 [3-5].
동물 그룹
Gp.1. SG277 SP+VC
25 ml BHIB(뇌 심장 주입 배지)에서 37℃에서 16시간 동안 SG277의 세포를 성장시켰다. 100 ml 배양물(4개의 플라스크)로부터 세포를 수확하고 2 ml의 PBS에 펠렛을 재현탁시켰다. 1회 투여량 = 0.2 ml 및 포자로 구성된 약 5 X 109개의 CFU(약 70-100%).
Gp.2. 동결 건조된 SG277 SP+VC(SG277 SP+VCLYO)
25 ml BHIB에서 37℃에서 16시간 동안 SG277의 세포를 성장시켰다. 이어서, 세포 펠렛을 동결시키고 밤새 동결 건조시켰다. 사용 당일, 2 ml의 PBS에 물질을 재현탁시켰다. 1회 투여량 = 0.2 ml 및 포자로 구성된 약 5 X 109개의 CFU(약 70-100%).
Gp.3. SG277 SUP
BHIB에서 37℃에서 밤새 SG277을 성장시켰다. 18시간 후, 원심 분리에 의해 세포를 제거하고 0.45 μm 필터를 통한 여과에 의해 상등액(SUP)을 멸균시켰다. 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다. 1회 투여량 = 0.2 ml.
Gp.4. SG277 SEC 분획(SG277 SUPSEC)
SG277 멸균 상등액을 20% 황산 암모늄으로 침전시키고, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하고, 항-CD630 활성을 갖는 분획(시험관내 미량희석 분석을 사용하여 측정함)을 수집하였다. 샘플 분취량을 -20℃에서 저장하고 사용 당일 해동시켰다. 1회 투여량 = 0.2 ml. Gp.5. 나이브
1회 투여량 = 0.2 ml의 PBS.
결과
실시예 1: 혐기성 포자 형성자 대신에 장내 호기성 포자 형성 박테리아가 C. 디피실리 를 억제한다.
실험 시작 10일 전에, 고압 멸균수, UV 처리된 음식 및 멸균 잠자리를 갖춘 독립적으로 환기되는 케이지(IVC)에 C57BL/6 마우스를 유지하였다. 매일 케이지를 교체하였다. 클린다마이신으로 치료하기 이전 및 이후에 마우스로부터 대변 샘플을 채취하였다. 위내(i.g.) 위관 영양법으로 투여되는 클린다마이신을 CDI를 유도하기에 충분한 농도(30 mg/kg)로 사용하였지만, 동물을 C. 디피실리로 공격하지는 않았다. 균질화된 대변을 열처리하여 영양세포를 사멸시키고 한천 플레이트 상에서 연속 희석물을 제조하였고, 이를 호기적 또는 혐기적으로 배양하였다. 발아된 내열성 포자로부터 결과적인 콜로니가 발생하며, 추가 분석을 위해, 호기성 또는 혐기성 플레이트로부터의 총 500개의 콜로니를 콜로니 정제하였다.
먼저, 본 발명자들은 배양된 박테리아의 무세포 상등액으로부터의 활성을 측정하는 한천-확산 분석을 사용하여 C. 디피실리 균주 630(CD630)의 성장을 억제하는 콜로니의 수를 측정하였고, 그 결과를 표 1에 제시하였다.
Figure pct00018
놀랍게도, 본 발명자들은 클린다마이신 치료 이전 또는 이후의 CD630을 억제할 수 있는 혐기성 분리주를 발견하지 못했다. 한편, 호기성의 포자 형성 분리주(n = 40)의 8%가 세포외 물질에서 항-C. 디피실리 활성을 갖고 있었지만, 클린다마이신 치료 후, 항-C. 디피실리 활성을 갖는 분리주의 백분율은 0.8%로 감소하였다(n=4). 흥미롭게도, 본 발명자들은 16S 메타게놈 시퀀싱(metagenomic sequencing)을 사용하여 마우스 대변 샘플에서 바실러스 종을 검출할 수 없었다. 이는, 최근의 쥐 연구 (39)와 일치하게도, 대변 샘플이 대부분 바실러스 포자만을 포함하고 영양세포는 포함하지 않을 수 있음을 나타내는 것일 수 있다.
다음으로, 본 발명자들은 항-C. 디피실리 활성을 갖는 호기성 분리주를 특성화하였으며, 그 결과를 표 2에 제시하였다.
Figure pct00019
16S rRNA 시퀀싱보다 유용한 정보를 주는 gyrA 시퀀싱을 사용하여 (40), 본 발명자들은 단지 3개의 바실러스 종, 즉, B. 아밀로리쿼파시엔스(n=22), B. 서브틸리스(n=10) 및 B. 리체니포르미스(n=12)이 존재함을 입증하였다. 생물계면활성제 활성에 대한 분석을 사용하여, 본 발명자들은 B. 아밀로리쿼파시엔스(n=22) 및 B. 서브틸리스(n=10) 분리주는 모두 무세포 상등액에서 생물계면활성제 활성을 가지며, 점액성이고, 클린다마이신에 민감함을 입증하였다(표 2 참조). 그러나, B. 리체니포르미스 분리주(n = 12)는 모두 클린다마이신에 내성이지만, 생물계면활성제 활성은 갖지 않았다.
본 발명자들은 또한, 표 3에 나타난 바와 같이 햄스터(골든 시리안)를 사용하여 유사한 연구를 수행하였으며, 26%의 호기성 포자 형성자가 C. 디피실리에 대해 활성을 갖는 유사한 현상을 관찰하였으며, 이는 클린다마이신 치료 이후 11%로 감소되었다.
Figure pct00020
실시예 2: C. 디피실리 에 대한 시험관내 활성을 갖는 쥐 위장관으로부터 단리된 바실러스 포자 형성자는 생체내에서 CDI를 억제한다
C. 디피실리에 대한 시험관내 활성이 생체내에서의 억제로 바뀔 수 있는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 두 그룹의 마우스(n = 4)에 표 1에 제시된 클린다마이신 이전 대변 샘플로부터 단리된 박테리아의 현탁액을 투여하였다(위내, i.g.). 그룹 1에는 C. 디피실리에 대해 활성을 나타낸 3개의 바실러스 종(B. 아밀로리쿼파시엔스, B. 서브틸리스 및 B. 리체니포르미스)의 혼합물을 투여하였고, 그룹 2에는 C. 디피실리에 대해 시험관내 활성을 나타내지 않은 3개의 바실러스 분리주(B. 아밀로리쿼파시엔스, B. 서브틸리스 및 B. 리체니포르미스 각각의 하나의 분리주)를 투여하였다. 각각의 그룹에 대해, 경구 투여량은 시험된 각각의 분리주로부터의 1 X 109개의 박테리아로 구성된 총 3 X 109개의 박테리아를 포함하였다. 제3 그룹은 PBS만 투여된 나이브 동물로 구성되었다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 마우스에 클린다마이신을 먼저 투여한 후(i.g.; 30 mg/kg), 5회 투여량의 박테리아 현탁액 또는 PBS를 제공하였다. 제2 투여량 후, 102개의 C. 디피실리 균주 630의 포자로 마우스를 공격하였다. 하루 후에, 모든 동물을 희생시키고 맹장 샘플을 채취하였다.
그룹 1의 모든 동물은, 맹장 샘플에서의 독소 A 또는 C. 디피실리 CFU의 부재로부터 나타난 바와 같이, CDI의 증거를 나타내지 않았다(각각 도 1b 및 도 1c 참조). 대조적으로, C. 디피실리에 대해 시험관내 활성을 나타내지 않는 바실러스가 투여된 동물은, C. 디피실리 콜로니화의 명백한 징후, 즉 나이브 마우스와 동등한 높은 수준의 독소 A 및 C. 디피실리 CFU를 나타냈다(각각 도 1b 및 도 1c 참조).
실시예 3: 호기성 포자 형성자의 장내 코호트는 외래 집단을 나타낸다
본 발명자들은 케이지 당 3마리의 동물을 사용하여 통상적인 케이지(CC) 또는 독립적으로 환기되는 케이지(IVC)에 마우스의 그룹을 수용하였다. IVC는 HEPA-여과를 갖추며 동물이 공중 박테리아에 노출되는 것을 방지한다. 동물에게 멸균 잠자리의 규칙적인 교체와 함께 멸균 식품과 물을 제공하였다. 호기성 배양 후 전체 및 내열성(박테리아 포자를 나타내는) CFU를 포함한 호기성 박테리아의 존재에 대해, 10일마다 대변을 검사하였다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 시간이 지남에 따라, 대변 샘플에서 식별된 호기성 박테리아의 수는 약 105-106 CFU/g로 일정하게 유지되었다. 대변의 포자 수준(103-104/g)은 인간 대변에서의 예상 농도와 거의 일치하였다 (24). 놀랍게도, IVC에 수용된 동물의 경우, 포자 수는 현저한 일시적인 감소를 보였으며, 40일 후에는 포자가 검출되지 않았다(주의, 102개의 CFU가 검출 한계임)(도 2b 참조). 호기성 포자 수의 이러한 감소는 통상적인 케이지에 수용된 마우스에서는 관찰되지 않았으며, 이는 포자 형성자의 호기성 집단이 외래성이고 환경으로부터 획득되었다는 것을 암시한다.
실시예 4: 항- C. 디피실리 활성을 갖는 B. 아밀로리쿼파시엔스 및 B. 서브틸리스 의 인간 분리주
본 발명자들은 인간 대변으로부터 단리된 바실러스 종을 이전에 특성화하였다 (19). 인간 분리주 무리로부터, 본 발명자들은 한천-확산 분석을 사용하여 C. 디피실리(CD630)에 대한 세포외 활성을 갖는 균주를 스크리닝하였다. 본 발명자들은 강력한 활성을 갖는 다수의 B. 서브틸리스 및 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주를 식별할 수 있었고, 보다 강력한 미량희석 분석을 사용하여, 세포외 억제 활성의 수준을 정량화하였다(도 3a 참조). 모든 균주는 생물계면활성제 활성을 가졌으며 클린다마이신에 민감하였다. 이들 분리주의 콜로니는 현저하게 점액성이었으며, 특히 B. 아밀로리쿼파시엔스가 그러하였다. 모든 균주는 강력하고 광범위한 생물막을 생성하였으며, 이는 일부 바실러스이지만 특히 길들여지지 않은 균주의 특징이다 (19, 41).
최고 수준의 억제 활성을 나타낸 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주 SG277 및 SG297을 추가로 연구하였다. 공동-배양 분석을 사용하여, 본 발명자들은 상이한 C. 디피실리 균주의 로그 배양물에 SG277 또는 SG297의 멸균 상등액을 첨가하였으며, 이는 C. 디피실리 배양물의 신속하고 완전한 용해를 초래하는 명확한 살균 효과를 나타냈다(CD630의 SG277-매개된 용해를 나타내는 도 3b 참조).
37℃에서 10시간 동안 BHIS에서 C. 디피실리 배양물을 성장시켰다. 180 μl의 C. 디피실리 배양물을 마이크로플레이트 웰에 첨가한 후, 20 μl의 멸균 SG277 여과액을 첨가하였다. 37℃에서 혐기적으로 18시간 동안 플레이트를 배양한 후 OD600을 판독하였다. 대조군으로서의 SG277 멸균 여과액을 또한 밤새 배양하였고, 이는 성장을 나타내지 않았다. 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 SG277 여과액이 다수의 상이한 C. 디피실리 리보타입(ribotype)에 대해 활성을 가짐을 입증하였다.
Figure pct00021
Figure pct00022
CD 균주 630에 대한 억제 활성을 측정하기 위해 미량희석 분석을 사용하여 SG277 및 SG297 상등액의 세포외 활성을 특성화하였다. 바실러스 상등액을 여과 멸균(0.45 μm)시키고 다양한 처리 조건에 노출시켰다. 처리된 샘플에 대해 억제 활성을 나타낸 최고 희석률을 표 5에 제시하였다. 모든 분석은 동일한 날에 동일한 여과액으로 수행하였다.
다양한 처리 조건은 하기와 같았다:
ㆍ열 - 선택된 온도의 오븐에서 30분 동안 여과물(0.5 ml)을 배양하였고, 분석 전에 실온으로 냉각시켰다.
ㆍ고압 멸균 - 121℃ 및 20 psi에서 20분 동안 여과액을 고압 멸균하였다.
ㆍ모의 위액(SGF) - pH를 조정하기 위해 HCl을 사용하여 pH 2, 3 및 4의 3개의 용액을 제조하였다. 상등액(0.5 ml)을 동일한 부피의 SGF(0.2% w/v NaCl, 3.5 mg/ml 펩신)와 함께 배양하고 분석 전에 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
ㆍ효소 - 분석 전에 37℃에서 1시간 동안 1 μg/ml 최종 농도의 하기 효소(모두 Sigma로부터의 것임)와 함께 상등액(0.5 ml)을 배양하였다: 리소자임(L7651), 리파제(L3126), 아밀라제(A3176). 프로테아제, 프로나제(P5147), 트립신(T8003) 및 프로테이나제 K(Thermo Scientific EO0491)의 경우, 효소의 최종 농도는 1 mg/ml였다.
ㆍ용매 - 0.5 ml의 용매를 사용하여 여과액(0.5 ml)을 1분 동안 볼텍싱(vortex)하였다.
ㆍ0.1M NaOH 또는 0.1% SDS - 여과액(0.5 ml)을 0.2%(w/v) SDS 또는 0.2M NaOH의 0.5 ml 용액과 조합하여, 0.1M NaOH 또는 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 샘플을 수득하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
ㆍ0.1% - 1.0% 글루타르알데히드 - 여과액(0.5 ml)을, 1:10의 몰비로 글리신으로 중화된 0.2%, 0.5%, 1.0% 또는 2.0% 글루타르알데히드의 용액(v/v)의 0.5 ml 용액과 조합하여, 0.1%, 0.25%, 0.5% 또는 1.0%(v/v) 글루타르알데히드를 포함하는 샘플을 수득하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
Figure pct00023
Figure pct00024
표 5에 나타난 바와 같이, SG277 및 SG297 상등액의 무세포 활성은, 유기 용매, 프로테아제, 모의 위액(SGF) 및 특히 열을 비롯한 다수의 처리에 내성이며, 특히 100℃에 대한 부분 내성을 갖는 것으로 나타났다.
또한, SG277 멸균 상등액의 안정성을 50일에 걸쳐 측정하였고, 도 4a에 도시된 바와 같이, 4℃에서 45일 저장 후 40% 안정성을 유지하였다. 도 4b 및 도 4c에 도시된 바와 같이, 성장하는 배양물에서, C. 디피실리에 대한 활성은 정지기 동안 발생하였으며, 이는 이것이 2차 대사 산물이고 따라서 항생제임을 시사한다.
SG277 세포를 반복적으로 세척한 후 CD630과 혼합하고(1:1), 반연 한천에 적용하고, 혐기적으로 밤새 배양하였을 때, 박테리아 론의 명확한 용해가 나타났다(도 5b 참조). 반대로, 도 5a는, SG277 세포가 CD630에 적용되지 않았고 풍부한 CD630 성장 론이 명백한 대조군 플레이트를 도시한다. SG277 및 실제로 여기에 기술된 모든 B. 아밀로리쿼파시엔스 및 B. 서브틸리스 분리주는 조건적 호기성 미생물이었으며, 이는 활성이 세포 외피에서 발생했을 가능성이 가장 높음을 입증한다. 마지막으로, 놀랍게도, 본 발명자들은 열처리(80℃, 30 분)에 의해 SG277 세포를 사멸시켰으며 세포가 여전히 C. 디피실리를 용해시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 무세포 상등액에 존재하는 동안의 C. 디피실리에 대한 활성이 세포 표면 상에서도 또한 존재함을 입증한다. 따라서, 본 발명자들은 상기 박테리아가, (예를 들어, 가열, 감마선 조사, 고압 멸균 등에 의해) 사멸된 형태로 사용될 수 있다고 생각한다. 결과를 표 6에 제시하였다.
Figure pct00025
표 7에 나타난 바와 같이, 다양한 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대한 활성 스펙트럼에 대해 SG277 및 SG297 멸균 여과액의 활성을 평가하였다. 한천-확산 방법을 사용하여 활성을 측정하였다. SG247은 C. 디피실리에 대해 활성을 갖지 않는 것으로 나타난 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주이고 대조군으로 사용되었다.
Figure pct00026
활성은 "+" =1-3 mm; "++" = 4-5 mm; "+++" > 5 mm로 표시되었다. b 슈도모나스 에루지노사, V. 하베이 및 V. 파라헤몰리티쿠스의 활성은 정균성이었으며, 미량희석 분석을 사용하였을 때 억제가 입증되었으며, 성장을 억제하는데 필요한 최고 희석률을 괄호 내에 표시하였다.
바실러스 안트라시스, 리스테리아 모노키토게네스 및 스타필로코커스 아우레우스를 포함한 많은 중요한 병원체인 그람 양성 박테리아에 대한 활성이 발견되었다. 다수의 예외를 제외하고, 본 발명자들은 그람 음성 박테리아에 대한 큰 활성을 관찰하지 못했다. 이들 예외는 모두 살균성 억제보다는 정균성 억제를 나타냈다. 물론 SG277과 SG297 둘 모두가 성장을 억제할 수 있는 다른 항균제를 생산하는 것도 가능하지만, 억제를 나타낸 균주가 다수의 중요한 병원체(V. 하베이, V. 파라헤몰리티쿠스 및 P. 에루지노사)를 포함하였다는 점이 주목할 가치가 있다.
결론적으로, 본 발명자들은 B. 서브틸리스 및 B. 아밀로리쿼파시엔스의 분리주가 세포 표면과 관련된 강력한 생물계면활성제를 생성할 가능성이 있음을 입증하였다. 본 발명자들은 이 생물계면활성제를 "AmyCideTM"로 지칭한다.
실시예 5: 생체내에서의 CDI의 억제
본 발명자들은 마우스 및 햄스터를 사용하고 SG277을 대표적 예로 사용하여 생물계면활성제인 AmyCideTM가 CDI를 예방할 수 있는지 여부를 측정하였다. 본 발명자들은 다수의 상이한 투여를 고려하였다. 첫째로, 멸균 무세포 상등액(SUP)의 사용, 둘째로, 포자의 현탁액(SPORES), 및 마지막으로, (i) 세척되고 PBS(277-PBS)에 현탁되거나, 또는 (ii) 상등액(277-SUP)에 현탁된 SG277 배양액의 현탁액의 사용이다. 후자의 접근법을 위해, 본 발명자들은 영양세포 및 포자의 혼합물을 함유하는 것으로 밝혀진 SG277의 하룻밤 배양물을 사용하였다. 멸균 무세포 상등액에 현탁된 SG378의 하룻밤 배양물 (378) 및 PBS 완충제(나이브)를 사용하여 대조군을 제공하였다.
마우스에서의 평가를 위해, 본 발명자들은, 콜로니화, 독소 A 및 B의 존재 및 맹장에서의 C. 디피실리 CFU를 정의하기 위해 2개의 속성이 사용되는 CDI 모델을 사용하였다 (42). 도 1a에 나타난 섭생법을 사용하여 4개의 상이한 SG277 제제를 동물에게 투여하였다. 나이브 그룹뿐만 아니라, 본 발명자들은 또한, C. 디피실리에 대한 시험관내 억제를 나타내지 않으며 음성 대조군으로서 작용하는 B. 아밀로리쿼파시엔스 SG378 세포(상등액에 현탁됨)를 투여한 그룹을 포함하였다. 결과를 도 6에 도시하였으며, 이는 277-SUP 또는 277-PBS의 5회 투여량이 맹장에서의 박테리아 CFU 및 독소 A 및 B의 부재에 의해 나타난 바와 같이 CD630의 콜로니화를 방지함을 보여준다(각각 도 6a, 6b 및 도 6c 참조). SG277로부터 유래한 무세포 상등액(SUP)의 사용은 콜로니화의 거의 완전한 정지를 달성하였으며, 1마리의 마우스가 맹장에서의 낮은 수준의 C. 디피실리 CFU 및 독소를 가졌다. 놀랍게도, SPORES는 C. 디피실리 콜로니화에 영향을 미치지 않았으며 SG378 및 나이브 그룹과 유사하였다. 전체적으로, 본 발명자들은 SG277가 CDI를 예방하는 능력을 평가하는 8개의 쥐 실험을 수행하였고, 동일한 결론을 갖는 SG297을 사용한 연구를 또한 수행하였다(표시되지 않음).
햄스터는 CDI 평가를 위한 '골드 표준(gold-standard)'으로 간주된다 (43). 본 발명자들은 이들을 사용하여, 마우스에 대한 전술된 동일한 SG277 치료제가 CDI를 예방하는 능력을 평가하였다. 방법 섹션에 설명된 바와 같이, 본 발명자들의 투여 전략은 치료제 당 6마리의 햄스터의 그룹을 사용하면서 각각의 치료제에 대한 다중 투여량을 포함하였다. CDI의 증상을 나타내는 동물을 희생시켰으며, 그룹의 생존 곡선을 도 7a에 도시하였다. 277-SUP은 CD630의 치명적인 공격에 대해 100% 보호를 제공하였다. 또한, 277-PBS는 6마리의 햄스터 중 5마리를 보호하였고, SUP는 6마리의 햄스터 중 2마리를 보호하였으며, SPORES는 6마리의 햄스터 중 1마리를 보호하였다. 나이브 동물 및 SG378 세포를 투여한 동물은 보호를 나타내지 않았다.
도 7b 및 도 7c는 각각 맹장 샘플에서의 CD630 CFU 및 독소의 수준을 도시한다.
본 발명자들은 유사한 결과를 갖는 3개의 다른 햄스터 연구를 수행하였고, 이를 마우스 데이터와 조합하였으며, 이는 277-PBS 또는 277-SUP의 현탁액이 C. 디피실리 콜로니화를 예방한다는 것을 명확히 입증하였다.
두 가지 주장이 있을 수 있다. 먼저, SPORES(즉, SG277 포자 단독의 현탁액)는 효능이 제한적이며, 이에 대해 본 발명자들은 생물계면활성제인 AmyCideTM를 분비하기에 불충분한 수의 포자가 위장관에서 발아할 수 있다고 가정해야 한다. 둘째로, 시험관내 데이터에도 불구하고, 무세포 상등액은 세포와 조합될 때만큼 효과적이지 않았다. 상기에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 AmyCideTM가 세포외피에 부분적으로 부착된 채로 유지되고, 세포벽과 결합될 때 더 효과적일 것으로 예측하며, 따라서 효능에 대한 이 기여가 중요할 가능성이 있다. 또한, 본 발명자들은 세포가 위장관에서 일시적으로 증식하여 AmyCideTM의 수준을 추가로 증가시킬 것으로 예측한다. 표시되지 않은 데이터에서, 본 발명자들은 단일 투여량으로 마우스에 투여된 SG277이, 투여 후 최대 10 일 동안 지속되는 것을 발견하였다(대변 흘림에 의해 측정됨).
실시예 6: 활성 화합물의 식별
상이한 분자량(mwt.) 컷오프의 원심 농축기를 사용하여, 본 발명자들은, 표 8에 나타난 바와 같이, SG277로부터의 여과 멸균된(0.45 μm) 상등액 내에 함유된 AmyCideTM의 대략적인 분자량을 측정하였다.
Figure pct00027
전체 활성의 약 50%가 30-100 kDa 분획에 존재하고, 나머지 약 50%는 >100 kDa 분획에 존재하였으며, 이는 AmyCideTM가 복합체로 존재하고 물리적으로 불안정할 수 있으며, 일부 활성을 유지하면서 해리될 수 있음을 시사한다.
20% 황산 암모늄(AmSO4)를 사용하여, 본 발명자들은 침전물이 생물계면활성제 활성뿐만 아니라 C. 디피실리에 대한 활성을 가짐을 발견하였다. 놀랍게도, 기능적으로 활성인 AmyCideTM 제제의 SDS-PAGE 분석은 분자량 범위 5-200 kDa에서 쿠마시 염색된 단백질 밴드를 생성하지 않았지만, 밴드와 유사한 단일의 백색 특성(GB로 표지됨)을 생성하였고, 이의 분자량은 1 kDa 정도로 추정되었다. 조합된 20%-70% 침전 후에야 단백질이 명백 해졌다. SDS가 겔로부터 용리되었을 때, 동일한 밴드(GB로 표지됨)에 상응하는 살아있는 CD630 박테리아에 대한 기능적 활성이 관찰될 수 있었다(도 8a 참조). 이 밴드는 '오일 레드 O(Oil Red O)'(지질)로 약하게 염색되었지만 알시안 블루(Alcian blue)로 명확하게 염색되었다(도 8b 참조). SDS-PAGE에 의한 낮은 겉보기 분자량은 AmSO4 침전과 일치하지 않았는데, 이는 20% AmSO4는 단지 고분자량 또는 소수성 분자만을 침전시키기 때문이다. 하기에 나타낸 바와 같이, 상기 분자량은 활성 모이어티의 것에 상응하지만, 본 발명자들은 상기 백색 밴드가 상기 복합체의 구조와 관련된 비정상적인 이동을 나타낼 수도 있다고 여긴다.
20% AmSO4 침전물의 겔 여과는 또한, 활성 성분인 'AmyCideTM'가 단백질 분획에 상응하지 않음을 확인하였다(도 8c 참조). 마지막으로, 본 발명자들은 AmyCideTM가 PEG(폴리에틸렌 글리콜)를 사용하여 침전될 수 있고 CsCl 구배를 통한 원심 분리 후, 3개의 뚜렷한 밴드가 존재하고, 이 중 밴드 B2만이 C. 디피실리에 대해 기능적 활성을 갖는다는 것을 발견하였다(도 8d 참조).
멸균 여과액에서 AmSO4 침전을 또한 수행하였다. 이 방법은 (MWCO 실험에서 입증된 바와 같이) 기능적 활성을 담당하는 고분자량 종의 침전을 가능하게 하고, 이들과 함께 공동 정제될 단백질의 양을 감소시키는 것을 가능하게 하였다. 활성 종은 고분자량 종의 미정제 분리에 의해 추가로 정제되었다. 도 27은 활성 종을 함유하는 용리된 분획으로부터의 단백질의 SDS 제거를 입증한다. 미량희석 분석을 사용하여 CD630에 대한 활성(희석률로 나타남)에 대해 분획을 시험하였고, 활성 분획을 조합하고 세척하여 과량의 SDS를 제거하였다. 도 24는 내부 마커(BSA 및 리소자임)를 사용한 유사한 분석을 도시한다. 이 분석은 이 활성이 단백질이 아닐 가능성을 보여준다.
전자 현미경 검사는, CsCl 구배 원심 분리 및 크기 배제 크로마토그래피 후 활성 분획에 존재하는 뚜렷한 응집체를 나타냈다(도 9a 및 도 9b 참조). 흥미롭게도, 이 분석은 직경이 약 20-30 nm인 구형-유사 과립의 클러스터를 나타냈다. 알시안 블루 염색은 다당류 성분을 암시하기 때문에, 이는 엑소폴리사카라이드가 풍부한 외부 세포벽과 결합된 점액에 상응할 수 있으며 이들 균주가 점액 콜로니 및 강력한 생물막을 형성하는 능력과 일치한다.
본 발명자들은 또한 SG277 및 SG297 게놈 상의 γ-PGA 생합성 유전자의 존재뿐만 아니라 AmSO4 침전물에서의 감마-폴리글루탐산(γ-PGA)의 존재를 확인하였다. 종합하면, AmyCideTM는, 세포 표면 점액으로부터 유래한 γ-PGA 및 엑소폴리사카라이드의 조합을 갖는, 고분자량 및 주로, 비단백질성의 복합체를 구성함이 틀림없다.
AmyCideTM를 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 미량희석 분석을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 활성 분획을 식별한 다음, RP-HPLC에 의해 추가로 분석하였다. 15개의 뚜렷한 분획이 RP-HPLC에 의해 수득되었고(도 10a 참조), MALDI-TOFF를 사용하여, 이들은 리포펩티드, 이투린 A, 펜기신, 서팩틴 및 미코수브틸린의 상이한 이소형으로 식별되었다(표 9 참조).
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
NMR(표시되지 않음)을 사용하여 이투린, 펜기신 및 서팩틴의 정체성을 또한 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 2개의 추가적인 리포펩티드인 모자벤신 A (44) 및 쿠르스타킨 (45)의 증거를 관찰하였다. 도 10a 및 도 10b 및 표 9에 나타난 바와 같이, 미량희석 분석을 사용하여, 본 발명자들은 8개의 분획(모든 이투린 A 및 서팩틴 이소형)이 감소된 활성에도 불구하고 항-CD630 활성을 갖는 것을 발견하였다.
SG277 멸균 여과액을 AmSO4 침전시키고 크기 배제 크로마토그래피를 수행하고, 활성 분획(5 mg)을 동결 건조한 후 물, PBS 또는 50% 메탄올에 현탁시키고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 본 발명자들은 메탄올이 상기 복합체를 해리시켜 활성을 <5 kDa의 저분자량 화합물로 이동시킬 수 있음을 입증하였으며(표 11 참조), 이는 이투린 A, 서팩틴, 펜기신 및 미코수브틸린의 공지된 분자량과 일치한다 (46, 47). 그러나, 이투린 A 및 서팩틴의 상업적인 공급원을 사용하였을 때, 본 발명자들은 이들을 단독으로 또는 조합하였을 때 CD360에 대한 어떠한 활성도 입증할 수 없었다.
Figure pct00031
흥미롭게도, 본 발명자들은 7개의 양성 RP-HPLC 분획이 조합되면 C. 디피실리에 대한 활성이 개별 분획의 누적 활성과 비교하여 거의 3배 증가한다는 것을 발견하였다. RP-HPLC 분획 1 내지 15가 재구성된 경우, 항-C. 디피실리 활성은 개별 RP-HPLC 분획의 누적 활성보다 적어도 4배 높았다(도 10b 참조). 종합하면, 이는 개별 모이어티의 강력한 상승작용 효과, 및 단독으로는 활성을 갖지 않는 분획(즉, 활성을 나타내지 않는 음성 분획)의 기여를 암시한다.
따라서, 본 발명자들은 B. 아밀로리쿼파시엔스 및 B. 서브틸리스에 의해 생성된 AmyCideTM가, 세포외피와 결합하고 이투린 A, 서팩틴, 미코수브틸린, 펜기신 A 및 B의 상이한 이소형을 포함하는 수용성 복합체라는 것을 입증하였다. 본 발명자들은, 조합되는 경우, 상기 활성 분획의 겉보기 분자량은 개별 단량체의 것보다 높음을 입증하였으며, 이는 많은 생물계면활성제의 특징인 미셀의 형성을 나타낸다 (49). 유리하게는, 이들 미셀은 나노 구조로 응집되는 것으로 나타났으며, 단량체 형태보다 안정적이고 내분해성이며, 향상된 용해도를 갖고 더 높은 항균 활성을 갖는다 (50-52). 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 AmyCideTM가, 일부 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주에서 미셀을 형성하기에 충분한 농도로 생성되는 리포펩티드를 비롯한, 상이한 인자들의 혼합물일 가능성이 가장 높을 것으로 생각한다.
혼합된 미셀이 형성될 수 있다. 미셀은 '실험실 기반' 현상으로 간주될 수 있지만, SEC 후에 수득된 구형-유사 과립 응집체의 SEM 이미지는 합성적으로 생성된 미셀과 유사하다 (53). 본 발명자들은 AmyCideTM 미셀이, 어떤 방법으로든, 영양세포 점액을 둘러싸는 방대한 엑소폴리사카라이드 내에 안정화되거나 포획될 수 있다고 생각한다. 여기에서 검사된 '활성' 균주는 다량의 생물막 및 생성된 점액 콜로니를 생성하며, 이 두 속성은 모두 다량의 세포외 다당류의 생성을 요구한다 (54).
계면활성제 분자는 임계 미셀 농도(CMC)보다 높은 농도에서 미셀을 형성한다 (49). 계면활성제가 본 발명자들의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주에 의해 충분히 높은 농도로 생산되었다면, 이는 활성이 고분자량 분획과 어떻게 관련되어 있는지를 설명할 수 있다. 생물계면활성제를 정제 및 농축하기 위해 한외여과가 사용되어 왔으며, 여기서 CMC보다 높은 농도로 계면활성제가 정제될 수 있다 (58).
도 12a에 도시된 바와 같이, SG277의 AmSO4 침전된 무세포 상등액으로부터의 SEC 분획으로 시작하여, 본 발명자들은, 측정된 활성이 5 kDa 초과의 분자량을 갖는 미셀에 대한 것임을 보장하기 위해, 30 kDa 분자량 컷오프(MWCO) 필터를 통해 샘플을 원심 분리하였다(8,000xg, 15분). 도 12b에 도시된 바와 같이, 고분자량 미셀을 함유하는 잔류물을 수집하고 MeOH를 최종 농도 50%(v/v)로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 생성된 혼합물을 5 kDa MWCO 필터를 사용하여 전술된 것과 동일한 조건 하에서 원심 분리하고, 저분자량 생물계면활성제 분자를 함유하는 여과액을 수집하고, 동일한 부피로 2개의 별개의 에펜도르프(Eppendorf)에 분취하고 진공 증발시켰다. 나머지 펠렛을 dH2O(도 12c) 또는 50% MeOH(v/v)(도 12d)에 재현탁시키고, 5 kDa 또는 30 kDa MWCO 필터를 사용하여 전술된 것과 동일한 조건에서 원심 분리하였다. 잔류물 및 여과액을 수집하였다. 모든 분획을 부피로 정규화하고, 미량희석 분석을 사용하여 CD630에 대한 활성에 대해 시험하였다.
따라서, 본 발명자들은 메탄올(50%)이 이 활성을 방해할 수 있음을 입증하였으며, 이는 활성과 5 kDa 미만의 분자량을 상관시킬 수 있게 한다. 여과액을 물에 용해시킨 경우, 활성의 mwt는 >5 kDa(및 >30 kDa)로 되돌아 갔다. 이는 항-C. 디피실리 활성의 높은 겉보기 분자량이 계면활성제 미셀의 형성에 상응함을 시사한다. 계면활성제는 이들 박테리아에 의해 충분히 높은 수준으로 생성되어, 개별 계면활성제 또는 혼합된 집단으로 구성된 미셀을 형성할 수 있게 한다.
동적 광산란(DLS)을 사용하여, 본 발명자들은 dH2O에서의 SG277 AmSO4 침전물의 SEC 분획을 검사하였으며, 이는, 미셀일 가능성이 가장 큰, 평균 크기가 3 nm(± 1 nm; 도 13a 참조)인 하나의 큰 집단과 미량의 응집체를 나타냈다. dH2O에 현탁된 RP-HPLC 분획을 검사하였을 때, 단지 분획 3(C15 이투린 A)만이 직경이 7 nm인 미셀을 가졌다(도 13b 참조). C15 서팩틴에 상응하는 분획 13의 경우, 70-1100 nm의 응집체만 관찰되었다(도 13c 참조). 이 데이터는 C15 이투린 A가 수용성이고 미셀을 형성할 수 있음을 보여준다. 상기 SEC 분획에 존재하는 미셀은 더 작지만 약 65 kDa의 구형 단백질에 해당하고, 이는 활성 SEC 분획이 30 kDa MWCO 필터를 통과하지 못하는 점과 일치한다. 상기 SEC 분획이 약 3 nm의 입자를 갖는 반면 C15 이투린 A는 7 nm 입자를 나타내는 이유는 분명하지 않지만, 다른 연구들 (59)은 크기의 차이를 기록하였으며, 임의의 특정 이론에 구속되기를 원하는 것은 아니지만, 미셀 크기가 혼합된 미셀(C15이투린 A를 함유할 수 있음)의 형성뿐만 아니라 리포펩티드의 상대 농도와 관련되어 있을 가능성이 크다.
C15 이투린 A는 미셀을 형성할 수 있고 수용성인 리포펩티드의 예이다. 본 발명자들은 C15 이투린 A가 다른 리포펩티드가 물에 가용화되도록 하며, 잠재적으로 혼합된 미셀을 형성하여, 이들이 박테리아 세포를 표적화할 수 있게 만든다고 생각한다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 물에 가용화된 C15 이투린 A를 상업적인 서팩틴(Sigma S3523; B. 서브틸리스 및 C13-C15 서팩틴의 혼합물로부터 유래함)과 혼합하였다. 상기 상업적인 서팩틴은 불수용성이었고, C. 디피실리에 대해 활성을 나타내지 않은 반면, C15 이투린 A는 마이크로플레이트 분석을 사용하였을 때 1/40의 기능적 활성을 가졌다. 본 발명자들의 가설을 입증하면서, 조합된 C15 이투린 A + C15 서팩틴은 C. 디피실리에 대해 높은 활성(1/160)을 나타냈다. 이는 본 발명자들에 의해 가정된 C. 디피실리에 대한 활성에 대한 가능한 메커니즘을 보여준다. C15 이투린 A의 존재는 C15 서팩틴 및 아마도 SG277 및 다른 바실러스 종의 세포벽 내에 또는 상에 존재하는 다른 리포펩티드 중 다수 또는 모두의 물에서의 가용화를 가능하게 한다. 활성에 대한 중요한 요구 사항은 생성되는 리포펩티드의 농도이다(이는 미셀은 임계 문턱값 초과의 수준에서만 형성될 수 있기 때문이다). (적어도 B. 아밀로리쿼파시엔스의 경우) 형성된 미셀은 혼합된 미셀일 가능성이 가장 높다(즉, 상이한 리포펩티드 종을 갖지만 모두 C15 이투린 A를 가짐).
SEC 분획에서의 수용성 미셀의 3 nm 크기가 중요한 것으로 생각되는데, 이는 이것이 미셀이 C. 디피실리의 세포 외피와 어떻게 접촉할 수 있는지를 설명할 수 있기 때문이다. 생물계면활성제로서, 상기 분자는 C. 디피실리(또는 다른 민감성 박테리아)의 인지질 이중층과 상호 작용함에 틀림없다.
B. 아밀로리쿼파시엔스 SG277과 SG297의 RP-HPLC 분획의 비교(도 14 참조)는 SG297과 다소 다른 프로파일을 나타냈으며, 이는 새로운 이투린 종을 나타낸다(스캔시 1300-1600).
SG277과 2개의 B. 서브틸리스 양성 균주(SG83 및 SG140)의 비교는 B. 서브틸리스 균주가 이투린을 생성하지 않았음을 나타내었으며(도 15), 이는 i) 이들 B. 서브틸리스 균주의(SG277 및 SG297과 비교하여) 감소된 활성이 이투린 A의 부재에 의해 설명될 수 있으며, ii) 이투린 A 이외의 리포펩티드가 가용화에 기여함을 시사하며, 이는 리포펩티드의 복잡한 화학량론적 관계가 활성에 기여함을 시사한다.
마지막으로, '양성' B. 리체니포르미스 균주(SG130)는 생물계면활성제를 생성하지 않는 것으로 나타났으며(도 16 참조), 이는 본 발명자들의 원래의 관찰과 일치한다(실시예 1 참조).
실시예 1에 보고된 원래의 마우스 실험으로 되돌아가면, 본 발명자들은 첫째로, 장내 균질물(공장, 회장, 맹장)뿐만 아니라 마우스 대변에서도 서팩틴 및 이투린이 검출가능하고, 둘째로, 3개의 마우스-바실러스 서브틸리스 균주(SG17, SG83 및 SG140)가 서팩틴을 생성함을 입증하였다. 도 11은 B. 서브틸리스 SG17의 RP-HPLC 분획을 도시한다. 흥미롭게도, (SG83 및 SG140과 같이) SG17은 이투린을 갖는 것으로 보이지 않았지만 펜기신과 서팩틴이 풍부하였다. C. 디피실리에 대한 이 균주의 활성이 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주보다 적었기 때문에(도 3a 참조), 본 발명자들은 활성이 AmyCideTM 내의 리포펩티드의 풍부함과 상관 관계가 있고, 더 강한 활성을 위해, 펜기신 및 서팩틴과 조합된 이투린이 더 큰 효과를 나타낸다고 추측한다. 또한, 나중에 언급되는 바와 같이, B. 서브틸리스 균주는, B. 아밀로리쿼파시엔스에서 보다 풍부한 (또는 보다 안정한) 특정 항생제, 특히 클로로테타인의 생성에 있어 덜 능숙한 것으로 보인다. 이는 또한, 마우스-유래 바실러스 균주가 CDI를 제어하는 능력이 항생제와 조합된 AmyCideTM 생물계면활성제 때문일 가능성이 큼을 시사한다.
실시예 7: 용균 활성 대 정균 활성
미정제 SEC 활성 분획의 구성요소 종을 추가로 검사하기 위해, SEC-HPLC 컬럼을 사용하여 분리를 수행하였다(도 17). 이 컬럼은 200-3,000 Da 범위의 분자를 분리한다. 상기 논의된 것과 동일한 변성 조건을 제공하는 등용매 완충제로서 아세토니트릴이 사용되었다. 4개의 분획을 수집하고, CD630에 대한 활성에 대해 시험하고 MS에 의해 분석하였다.
세포 성장의 로그 상(OD600 약 0.3)에서 시험 물질을 첨가함으로써 CD630의 배양물의 성장을 억제하는 능력에 대해 분획 1 내지 3을 분석하였다. 시험 물질을 dH2O에 희석하여 시험될 각각의 샘플이 동일한 활성/부피를 갖도록 정규화하였다. 120 ml의 희석된 시험 물질을 1 ml의 CD630 배양물에 첨가하고 OD600 판독을 위해 시간 당 0.2 ml를 제거하였다. 이 연구에서의 시험 물질은 표 12에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00032
시험 물질의 첨가 이전 및 이후에 광학 밀도(OD600)를 측정하였다. OD600의 감소는 용균 활성을 나타내며 OD600의 증가의 정지는 정균 또는 살균 성장을 나타낸다. 한편, CFU/ml의 감소는 용균 및/또는 살균 활성 둘 모두를 나타낸다(도 22a 및 도 22b 및 표 13).
Figure pct00033
각 분획의 기본 정체성을 하기 표 14에 제시하였다.
Figure pct00034
분획 3은 살균성이고, 분획 1(서팩틴)은 용균성이었다. SEC 미정제 분획은 부분적인 용균 활성을 나타냈다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 이것이 AmSO4 침전물로부터의 SEC 분획의 제조에 사용된 SDS가 미셀을 파괴하여 활성을 방해했을 수 있기 때문이라고 생각한다. 종합하면, 이는 AmyCideTM 복합체의 기능이 분자 조성에 의존하고 개별 성분의 농도 변화가 활성에 영향을 준다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 분획 3이 현저하게 감소하고 때때로 B. 서브틸리스 균주들에는 존재하지 않는 것을 관찰하였으며, 이는 C. 디피실리에 대한 이들의 활성 감소를 설명할 가능성이 있다.
분획 1 내지 3에 대한 추가 분석을 수행하였으며, 여기서는 SEC-HPLC 분석으로부터의 개별 분획이 RP-HPLC 컬럼에서 실행되었다(도 18a 내지 도 18c). 동시에, 본 발명자들은 비교를 위해 SG277 SEC 활성 분획(상기 도 10과 동일)을 실행하였다. 알 수 있는 바와 같이, 분획 1은 서팩틴에 해당하고, 분획 2는 이투린 및 펜기신에 해당하고, 분획 3은 흡수를 나타내지 않았으며, 이는 펩티드 성분이 없음을 나타낸다.
SEC-HPLC 분획 3을 RP-HPLC 컬럼에 적용하고 36개의 분획에 대해 항-CD630 활성을 분석하였다. 동시에, SG277의 총 미정제 SEC 분획을 RP-HPLC 상에서 실행하였고 36개의 분획을 검사하였다(도 19).
SEC-HPLC 분획 3의 분획 1 내지 5는 CD630에 대한 명확한 활성을 나타내었으며, 이들 분획의 MS 분석을 표 15에 제시하였다.
RP-HPLC에 의해 동시에 실행된 SG277의 경우, SG277 미정제 SEC의 분획 4 및 분획 30 내지 32는 활성을 나타냈다. 분획 30 내지 32는 서팩틴이고, 질량 분석을 사용하였을 때의 분획 4의 정체성을 하기 표 16에 제시하였다. 이투린 분획에서 때때로 낮은 활성이 발견되었지만 여기에 표시된 분석에서는 발견되지 않았음을 주목한다. 분획 4에서 명백하게 식별가능한 종은 항생제인 클로로테타인이었다. 이것은 AmyCideTM가 어떻게 C. 디피실리를 사멸시키는지 이해하는데 중요한 유일한 화합물이었다.
SEC-HPLC 분획 3의 분획 1 내지 9는 220 nm에서 흡수하지 않으므로 상기 활성 분획(1-9)은 단백질성이거나 리포펩티드일 가능성이 없다. 그러나 서팩틴 또한 CD를 억제함에 있어서의 성분이므로 복합체를 암시한다.
Figure pct00035
Figure pct00036
SEC 분획에 대해 Cryo-EM 분석을 수행하였고, 이는 빽빽이 채워지고 크기가 10 nm 미만인 작은 원판-유사 물체를 나타냈다. 또한 직경이 약 160 nm인 큰 원판도 가끔 나타났다. 이들 물체는 <10 nm 및 약 160 nm 크기의 미셀과 유사하였다(도 20). 이투린 A(1-3) 펜기신(7-9) 및 서팩틴(10-14)에 상응하는 개별 RP-HPLC 분획은 미셀을 나타내지 않았고, 대신에, 막대형 필라멘트/섬유를 나타냈다.
DLS 분석(동적 광산란)은 SEC 분획이 3 nm 입자를 나타냄을 증명하였으며, 이는 cyro-EM 분석과 일치하며(도 21), C14 서팩틴(RP-HPLC의 분획 13)은 큰 입자를 나타냈으며, 이는 cryo-EM 분석을 사용하였을 때의 섬유에 상응한다(표시되지 않음).
본 발명자들은 또한 DLS를 사용하여 식별된 인자들의 상승작용 효과를 평가하였다(도 23). 이 분석은 이투린, 펜기신 및 서팩틴 분획의 입자 크기를 나타냈다. 이투린, 펜기신 및 서팩틴의 조합은 입자 크기를 변화시키며, 협동성(cooperativity) 및 더 큰 복합체의 구축을 나타낸다.
유사한 연구에서, B. 서브틸리스의 리포펩티드는, 조합되는 경우, 미셀 크기의 변화를 겪는 것으로 나타났다(문헌 [Jauregi, Coutte 등, 2013]). 예를 들어, 서팩틴(5-105 nm)과 미코수브틸린(8-18 nm)을 조합하면 8 nm의 혼합된 미셀이 생성된다. 이는 본 발명자들이 관찰한 것과 유사하다.
본 발명자들은 또한 미량희석 분석을 사용하여 CD630에 대한 활성을 시험하였다(표 17).
Figure pct00037
분자량 컷오프는 분자의 크기(상기 표)가 30 kDa 초과인 것을 보여주지만, 모든 리포펩티드는 보편적으로 작은 크기(400-1.5 kDa)인 크기 범위를 나타냈다. SEC 컬럼 상에서 분리되는 경우, 상기 분자의 용리는 >20 kDa의 크기를 제시하여, 단백질 표준과 비교가 된다(도 24).
임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 이 두 가지 관찰은 이들 성분이 용액 중의 단량체이지만 서로 상호 작용하여 SEC 분리 동안 동일한 분획으로 용리되는 단일 복합체를 생성한다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, 메탄올이 SEC 용액에 첨가되는 경우, 성분들 사이의 모든 상호 작용이 붕괴되고 분자량은 단량체로서의 리포펩티드의 크기인 5 kDa 미만으로 감소한다. 용액에 메탄올을 첨가하면 용액의 소수성을 증가시키며, 상기 더 소수성인 용매와 계면활성제 분자의 소수성 테일 사이의 분자간 힘이 증가함에 따라, 미셀의 용해를 초래한다. Cheng 등(2013)은 B. 서브틸리스에서의 리포펩티드 및 당지질의 유사한 배합물의 예를 제공한다(문헌 [Cheng, Tang 등, 2013]). CsCl2 초원심 분리를 고려할 때 크기의 불일치가 또한 관찰되는데, 이는 염료 프론트와 함께 진행하는 SDS page 겔에서 나타나는 활성 밴드와 비교하여 큰 분자량을 암시한다. SDS-page는 상기 복합체를 더 작은 개별 성분으로 분리하는 것으로 보인다.
상이한 인자들의 조합에 대한 평가를 수행하였다. 단독으로 또는 도 25에 나타낸 바와 같이 조합하여 CD630에 대한 활성에 대해 SEC-HPLC로부터의 분획 1 내지 3(도 17)을 검사하였다. 모든 샘플/분획은 조합 전에 정규화되었다.
분획 1 = 서팩틴
분획 2 = 이투린 및 펜기신
분획 3 = 클로로테타인
분획 1+2+3의 첨가는 1, 2 또는 3 단독 또는 1+2, 1+3 또는 2+3보다 더 큰 활성(1/640)을 나타냈다. 이 경우 원래 SEC 분획은 1/1280이었다(총계).
RP-HPLC 분별로부터의 분획(도 26 참조)을 도면에 도시된 바와 같이 조합하였다.
이투린 (I), 펜기신 (F) 및 서팩틴 (S)의 상업적인(SIGMA) 샘플이 이 분석에 사용되었으며, 이들은, 단독 또는 조합으로, CD630에 대한 활성을 나타내지 않았다.
분획 1 내지 3 = 이투린 A
분획 7 내지 9 = 펜기신
분획 10 내지 14 = 서팩틴
RP-HPLC 분획의 경우, 이투린 및 펜기신은 저활성을 나타냈으며 서팩틴 미만(fr 10 내지 14)이었다. 개별 피크의 합은 1/320이었고 이투린(fr 1 내지 3)을 펜기신(fr 7 내지 9) 및 서팩틴(fr 10 내지 14)과 조합된 경우, 활성이 1/640으로 증가했지만 여전히 전체 SEC 분획(1/1280)보다 적었다.
종합하면 SEC-HPLC 및 RP-HPLC 분획에 대한 이 데이터는 수학적 합계보다 큰, 개별 활성 분획이 조합되는 경우의 상승작용 효과를 나타낸다.
실시예 8: 미코박테륨 튜버큘로시스 에 대한 활성
SG277로부터의 AmSO4 물질에 SEC 크로마토그래피를 수행하하고 20개의 분획에 대해 M. 튜버큘로시스에 대한 활성을 분석하였다. 약물-민감성 및 약물-내성 M. 튜버큘로시스 성장의 억제에 대해, 전술된 SEC 분획의 최소 억제 농도(MIC)를 측정하였고 상기 항생제들과 비교하였다. 미코박테리아 배양물 둘 모두에 대해 분획 1, 2, 3 15 및 16의 높은 억제 활성이 관찰되었다(표 18 및 도 28). 분획 15 및 16은 또한 시험관내 미량희석 분석을 사용하였을 때 C. 디피실리 균주 630에 대한 활성을 나타냈다.
Figure pct00038
리팜피신은 튜버큘로시스를 치료하기 위한 표준으로 간주된다. 이 데이터는 RP-HPLC 분획, 특히 분획 1 내지 3 및 15 및 16이 M. 튜버큘로시스에 대해 활성을 가짐을 보여준다.
실시예 9: 스타필로코커스 아우레우스 에 대한 활성
시험관내 활성
S. 아우레우스(DL1065)에 대한 활성을 평가하기 위해 시험관내 분석을 사용하였다. B. 아밀로리쿼파시엔스 균주는 모두, C. 디피실리에 대해 세포외 활성을 나타내고 AmyCideTM 복합체를 갖는 균주였다. SG378은 항-CD 활성을 나타내지 않은 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주였다. 결과를 표 19에 제시하였다.
Figure pct00039
생체내 활성
본 발명자들은 또한 S. 아우레우스에 대한 활성을 평가하기 위해 상기 방법 섹션에 기술된 생체내 분석을 수행하였다.
다양한 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주의 멸균 여과액을 S. 아우레우스의 기하급수적으로 성장하는 배양물에 첨가하였다. 광학 밀도 판독에 의해 세포 성장을 모니터링하였다(도 29). SEC(크기 배제 분획)을 사용하여, S. 아우레우스의 정균성 억제를 또한 관찰하였다.
S. 아우레우스에 대한 세포외 활성이 3개의 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주, 즉 SG185, SG277 및 SG297에 명확히 존재하였다.
실시예 10: V. 하베이 및 V. 파라헤몰리티쿠스 에 대한 활성
V. 하베이 및 V. 파라헤몰리티쿠스의 배양액에 SG277 및 SG297로부터의 배양물 상등액을 1/10의 최종 농도로 첨가하였다.
SG277 및 SG297 상등액 둘 모두 비브리오 균주 둘 모두(V. 하베이 및 V. 파라헤몰리티쿠스)에 대해 활성을 나타냈다(도 30 및 도 31).
실시예 11: 동결 건조된 형태의 AmyCide TM 의 안정성 및 활성 시험
다양한 온도에서 동결 건조된 SG277의 안정성을 시험하고 새로운 SG2776과 비교하였다. 도 4는 SG277이 동결 건조된 형태에서 안정하다는 것을 강조한다.
동결 건조된 박테리아(포자 및 영양세포의 혼합물)는 박테리아가 CDI를 예방하는 효능을 손상시키지 않는다. 100% 보호가 달성된다(도 32 내지 도 35). 이는 활성 물질이 동결 건조를 견뎌냄을 입증하며, 이는 또한 최종 제품으로서의 이의 사용에 대해 고무적이다.
상등액 물질의 투여는 66%의 보호를 나타낸 반면 SEC 정제된 물질은 33% 보호를 나타냈다. CD로 콜로니화된 동물의 경우에도 CD CFU 수준이 감소된다. 이는, 100% 보호를 획득하지 못하는 것이 투여량 및/또는 제형으로 인한 결과일 가능성이 가장 큼을 암시한다. 즉, 더 높은 투여량을 사용하면 100% 보호를 제공하게 된다.
고찰
소화관 미생물총의 표적화된 복원이 CDI의 치료에 효과적임이 입증되었지만, 작용 메카니즘은 규정하기 힘든 상태로 남아 있으며, 내장 미생물총의 균형 재조정, 경쟁적 배제 및 포식성 박테리오파지의 기여를 포함한다 (10-12). 본 발명자들은 이들 방법이 CDI의 제어에 대한 호기성 포자 형성자의 기여를 간과한 것으로 보임을 입증하였다. 여기에는 몇 가지 이유가 있다. 첫째로, 이들 방법은 세균 요법에 대한 후보를 식별하기 위해 서열 또는 메타게놈-기반 방법을 사용하였다. 둘째로, 이전의 방법들은 모두 혐기성 박테리아에 중점을 두고 있으며 소수 박테리아 집단이 장내 감염을 제어하는 데 주된 역할을 하지 않을 것이라고 가정하고 있다.
대조적으로, 본 발명자들의 접근법은 혐기성 박테리아 대신에 호기성 포자 형성 박테리아에 중점을 두는 것과 조합된, 기능적 활성을 갖는 박테리아를 식별하기 위한 전통적인 미생물학적 방법에 초점을 맞추었다. CDI를 모델 위장관 병원체로 사용하였을 때, 본 발명자의 연구로부터의 호기성 포자 형성자의 코호트는 대부분 바실러스 종이며, 물론 이들은 일반적으로 표준 메카게놈- 또는 서열-기반 접근법을 사용하였을 때 보통 검출 불가능할 것이다. 이들 박테리아는 외래 집단을 구성하며, 이는 본 발명자들의 호기성 포자 형성자에 대한 노출이 CDI를 제어하는데 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.
CDI의 비율은 선진국, 특히 미국 및 그 다음으로 영국에서 가장 높으며 (62, 63), 가공 식품의 증가와 환경 박테리아에 대한 노출 감소가 이들 나라에서의 비율이 이렇게 높은 데에 대한 중요한 인자가 될 수 있다고 주장할 수 있을 것이다. 위생 가설은, 전염병 감소를 달성한 선진국의 생활 양식의 변화를 알레르기성 및 자가면역성 질환의 동시 증가와 연결시키려고 시도하고 있다 (64-67). 본 발명자들은, 대략, 동일한 현상이 미국과 영국에서 관찰된 높은 CDI 비율의 기저를 이루는 기여 요인일 수 있다고 추측한다 (68, 69). 예를 들어 식이 요법과 항생제 사용 증가를 통한 환경 미생물에 대한 노출 감소는 바실러스에 대한 우리의 노출을 감소시킬 것으로 예상되며, 부분적으로, CDI 비율 증가를 설명할 수 있다. 다른 연구자들이 주목한 바와 같이, 근본 원인은 다인성일 가능성이 높지만 (70), 본 발명자들은 지금까지 환경 미생물에 대한 노출의 기여가 간과되어 왔다고 생각한다. 철저한 또는 적절한 진단의 부족이 개발 도상국에서의 CDI의 낮은 발생률을 부분적으로 설명할 수 있지만, 이들이 항생제 남용 및 과다 사용에 대한 기록이 있는 동일한 국가라는 점이 흥미롭다 (71). 또한, 현재 많은 개발 도상국에서, CDI가 개선된 생활 수준, 위생 및 영양과 병행하여 등장하고 있다는 점도 흥미롭다 (72,73). 따라서 본 발명자들은 환경 박테리아에 대한 우리의 노출이 CDI 및 다른 위장관 질환을 제어하는데 중요한 역할을 한다고 생각한다.
B. 아밀로리쿼파시엔스 및 B. 서브틸리스를 비롯한 바실러스 종이 항균제를 생산하는 능력은 널리 공지되어 있으며, 비-리보솜으로 생성된 시클릭 리포펩티드(이투린 및 서팩틴 및 펜기신)는 특히 강력한 생물계면활성제로 간주된다 (47, 74-78). 이들 중 다수는 식물 질병을 제어하기 위한 항진균제로서 상업적으로 사용된다 (79-81). 따라서, 본 발명자들은 B. 아밀로리쿼파시엔스 및 B. 서브틸리스에 의해 생성된 생물계면활성제 또는 '항생제'(본원에서 "AmyCideTM"로 지칭됨)가, 세포 외피와 결합하고 클로로테타인과 함께 리포펩티드 생물계면활성제를 포함하는 대형 복합체라는 것을 본원에서 입증하였다. 생물계면활성제의 조합은 상승 작용 효과를 가지며 고농도에서 미셀, 아마도 혼합된 미셀을 생성한다. 이들 AmyCideTM 미셀의 주요 구성은 서팩틴이지만 다른 리포펩티드(이투린 A, 서팩틴, 미코수브틸린 및 펜기신 A 및 B) 또는 당지질이 고농도로 이를 대체하여 유사한 미셀을 생성할 수 있다. 이들 미셀은 바실러스 종에 의해 생성된 항균제, 특히 클로로테타인을 조합하거나 농축시키는 독특한 능력을 또한 갖는 복합체를 형성하는 것으로 보인다. 클로로테타인이 C. 디피실리에 대해 명확하게 살균성인 반면, 상기 리포펩티드들은 그 자체로 용균성이기는 하지만, 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 리포펩티드와 클로로테타인의 복합체는, 아마도 하나 또는 두 성분 모두(리포펩티드 및/또는 클로로테타인)의 안정성을 향상시킴으로써 또는 결합성, 즉 사멸률을 증가시킴으로써 더 큰 활성을 촉진한다고 가정한다. 예를 들어, 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 생물계면활성제 미셀의 존재시 또는 복합체로서, 항생제, 즉 클로로테타인이 개선된 안정성을 갖거나 밀도가 높아져서 더 표적화된 활성을 갖는다고 생각한다. 클로로테타인은, 일반적으로 B. 서브틸리스에 의해 생산되는 항생제인 바실리신(Bacilysin)과 유사한 비-리보솜으로 합성된 디펩티드 항생제이다(문헌 [Phister 등, "Identification of bacilysin, chlorotetaine, and iturin a produced by Bacillus sp. strain CS93 isolated from pozol, a Mexican fermented maize dough", Appl Environ Microbiol 70(1): 631-634]). 본원에 기술된 B. 아밀로리쿼파시엔스 균주는 모두 바실리신을 생성하고, 이들은 동일하거나 변형된 생합성 경로를 사용할 가능성이 있다. 바실리신은 L-알라닌과 L-안티캅신으로 구성된 디펩티드이며 '트로이 목마 항생제(Trojan Horse antibiotic)'로 알려져 있다. 감수성 세포가 디펩티드 투과 효소를 사용하여 바실리신을 도입한 후, 펩티다제가 세포 내에서 안티캅신을 방출시킨다. 글루타민의 유사체인 안티캅신은 글루코사민 합성 효소를 억제할 수 있다. 글루코사민 합성 효소의 비가역적 억제는 박테리아 또는 진균 세포의 용해를 초래한다. 클로로테타인은 L-알라닌에 융합된 특이한 염소-함유 아미노산(3'-클로로-4'-옥소-2'-시클로-헥세닐) 알라닌을 갖는 디펩티드이지만, 바실리신과 유사한 작용 방식을 가질 가능성이 크다.
AmyCideTM는 특히 특이한데, 이는, 복합체를 형성하고 세포벽과 결합하는 리포펩티드 및 항생제의 혼합물을 포함하기 때문이다. 본 발명자들은 점액의 영양세포를 둘러싸는 풍부한 엑소폴리사카라이드에 의해 응집이 발생한다고 생각한다. 이 다당류 성분은 또한 B. 아밀로리쿼파시엔스의 점액에 전형적으로 존재하는 γ-PGA를 함유한다 (82).
점액 콜로니 및 엑소폴리사카라이드 생성은 다수의 바실러스 균주 (54)의 특징이며 아마도 생물막 형성을 보조할 것이다. 본 발명자들은 추가적인 역할은 생물계면활성제의 포획에 있다고 추측한다. 생물계면활성제의 응집은 또한 이들 항생제의 성능을 개선시킴이 틀림없는데, 이는, 본원에 표시된 바와 같이, 개별 모이어티로서의 이들의 활성은 크게 감소되기 때문이다. 본 발명자들은 이들 생물계면활성제의 활성은 이들이 조합되는 경우 크게 증가한다는 것을 관찰하였다. 흥미로운 질문은, C. 디피실리가 세포를 둘러싸는 보호 단백질성 S-층을 가지고 있기 때문에, AmyCideTM가 어떻게 C. 디피실리를 용해시키는 지에 대한 것이다 (60). S-층 코팅은 세포벽에 완전한 피복을 제공하지 않을 수 있거나, 또는 대안적으로, 자기조립 S-층 단백질의 어레이는 AmyCideTM에 의해 분해되거나 변성될 수 있다. S-층 단백질의 정렬된 어레이에 의해 형성된 기공은 직경이 약 30 Å이므로 (61) AmyCideTM가 이 장벽을 침투할 수 있다.
결론
결론적으로, 본 발명자들은 B. 아밀로리쿼파시엔스 및 B. 서브틸리스 균주는 C. 디피실리에 대한 놀라운 활성을 나타내며, 이는, 생물계면활성제 및 클로로테타인 및 이들이 i) 미셀을 형성하고, ii) 상승적으로 작용하고 iii) 다른 항생제를 농축시키거나 안정화시키는 능력 덕분인 것임을 증명하였다. 이들 생물계면활성제는 서팩틴, 이투린, 펜기신, 및 잠재적으로, 다른 것들의 상이한 이소형을 포함한다(도 10, 도 14 및 도 15 및 표 9 참조). 본 발명자들은, 정확한 이소형은 균주간에 다소 상이하기 때문에 중요하지 않을 수 있지만(도 14 참조), 이들의 화학량론 및 농도는 중요할 수 있고, 사용되거나 생산된 생물계면활성제가 더 많은 것은 항균 활성과 상관 관계가 있는 것으로 보임을 증명하였다(도 10b 참조). 본 발명자들은, 균질 혼합물이거나 불균질 혼합물인지 여부에 관계없이, 더 높은 농도의 생물계면활성제가 미셀의 형성을 초래하고, 아마도 세포외 물질에 존재하는 과립-유사 화합물에 상응할 수 있음을 관찰하고 놀랐다(도 9 참조). 상기 생물계면활성제는 물 및 메탄올에 가용성이다. 가장 강력한 활성을 갖는 SG297 및 SG277의 경우, 서팩틴, 이투린 및 펜기신은, 클로로테타인과 결합되었을 때, 가장 큰 활성을 갖는다. 항-CD 활성을 갖는 B. 리체니포르미스 균주는 일부 다른 분자 또는 메카니즘을 생성함이 틀림없지만, 활성은 아마도 생물계면활성제 때문이 아닐 것이다.
상기 복합체를 안정화시키는데 있어서의 세포외 다당류의 역할을 고려해야 하는데, 이는, 최고 수준의 활성은 항상 SEC 분획에 상응하며 개별 성분은 더 낮은 활성을 가지기 때문이다. C15 이투린 A는, 미셀(약 7 nm 직경)을 형성할 수 있는 수용성 리포펩티드이며, 혼합된 미셀(약 3 nm 직경)의 형성과 함께 다른 리포펩티드를 용해시키는 역할을 한다. SG297의 프로파일은 상이하지만, 본 발명자들은 동일한 개념이 적용되는 것으로 가정한다.
본 발명자들은, 이렇게 생성된 리포펩티드 및 미셀의 농도에 따라 상이한 균주가 상이한 활성을 생성한다고 가정한다. 더 낮은 활성을 갖지만 C15 이투린 A를 갖지 않는 B. 서브틸리스 균주를 설명하기 위해, 본 발명자들은, 리포펩티드의 가용화에 역할을 하는 다른 리포펩티드가 존재하지만 C15 이투린이 효과적인 것임을 제안한다.
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<220> <223> Bacillomycin LC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> D-Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> D-Ser <400> 8 Asn Xaa Xaa Ser Gln Xaa Thr 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Esperin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> D-Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> D-Leu <400> 9 Glu Leu Xaa Val Asp Xaa Leu 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lichenysin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> D-Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> D-Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Val or Ile <400> 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pumilacidin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> D-Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Beta amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> D-Tyr <400> 17 Xaa Ser Glu Xaa Thr Xaa Asn Xaa 1 5

Claims (38)

  1. (i) 항생제, 바람직하게는 클로로테타인, 및 (ii) 서팩틴 패밀리의 구성원; 이투린 패밀리의 구성원; 및 펜기신 패밀리의 구성원 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리포펩티드를 포함하는 항생제 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항생제는 클로로테타인; 폴리케타이드; 바실리신; 포슬락토마이신 또는 이의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 항생제 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 항생제는 클로로테타인인 항생제 조성물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 당지질을 추가로 포함하는 항생제 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 미셀을 형성하는 항생제 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 미셀의 평균 직경은 1 nm 내지 500 nm, 또는 1 nm 내지 300 nm, 또는 1 nm 내지 160 nm인 항생제 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 미셀의 평균 직경은 3 nm 내지 160 nm인 항생제 조성물.
  8. 청구항 4 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당지질은 람노리피드 또는 이의 활성 유도체, 및/또는 소포로리피드 또는 이의 활성 유도체인 항생제 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 당지질은 람노리피드이고 상기 람노리피드는 모노- 또는 디-람노리피드이고, 선택적으로 상기 람노리피드는 C8, C8:2,C10, C12, C12:2, C14 또는 C14:2 이소형인 항생제 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 람노리피드는 C12 이소형인 항생제 조성물.
  11. 청구항 2 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리케타이드는 아미코우마신 C; 디피시딘; 옥시디피시딘; 및 살리니피론 A, 또는 이의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 폴리케타이드는 디피시딘 또는 옥시디피시딘인 항생제 조성물.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 서팩틴 패밀리의 구성원; 람노리피드 및/또는 소포로리피드; 및 클로로테타인 또는 이의 활성 유도체를 포함하는 조성물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 서팩틴 패밀리의 구성원; 람노리피드 및/또는 소포로리피드; 및 디피시딘 또는 옥시디피시딘을 포함하는 조성물.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 디-O-아세테이트 락톤을 추가로 포함하는 항생제 조성물.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 미코수브틸린; 모자벤신 A; 및 쿠르스타킨, 또는 이들 리포펩티드 중 임의의 것의 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 추가적인 리포펩티드를 포함하는 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리포펩티드는 이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체, 및 서팩틴 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체이고, 선택적으로, 이투린 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체, 및 서팩틴 패밀리의 구성원 또는 이의 활성 유도체는 1:10 내지 10:1, 또는 1:5 내지 5:1, 또는 1:3 내지 3:1, 또는 1:2 내지 2:1의 비율로 사용되는 조성물.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    이투린 패밀리의 구성원은 이투린 A [서열번호 1], 이투린 AL [서열번호 2], 이투린 C [서열번호 3], 미코수브틸린 [서열번호 4] 또는 바실로마이신 D [서열번호 5], 바실로마이신 F [서열번호 6], 바실로마이신 L [서열번호 7], 바실로마이신 LC [서열번호 8], 및 바실로펩틴 A, B 또는 C [서열번호 17]로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    이투린 패밀리의 구성원은 이투린 A [서열번호 1] 또는 이의 활성 유도체이고, 선택적으로, 상기 활성 유도체는 C14, C15 또는 C16 이소형인 조성물.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    서팩틴 패밀리의 구성원은 에스페린 [서열번호 9], 리케나이신 [서열번호 10], 푸밀라시딘 [서열번호 11] 및 서팩틴 [서열번호 12]으로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    서팩틴 패밀리의 구성원은 서팩틴 [서열번호 12]이고, 선택적으로, 상기 활성 유도체는 C12, C13, C14, C15, C16, 또는 C17 이소형인 조성물.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항생제 조성물이 이투린 A의 C15 이소형 및 서팩틴의 C15 이소형을 포함하는 조성물.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 항생제 조성물의 식품 또는 식이 보충제로서의 용도.
  23. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 항생제 조성물을 포함하는 식이 보충제 또는 식품.
  24. 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 청구항 23에 따른 식이 보충제 또는 식품.
  25. 박테리아 감염의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 청구항 23에 따른 식이 보충제 또는 식품.
  26. 청구항 25에 있어서,
    치료, 예방 또는 개선될 수 있는 박테리아 감염은 그람 양성 박테리아 감염인 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 그람 양성 박테리아는 클로스트리듐 종, 바실러스 종, 리스테리아 종, 미코박테륨 종, 락토바실러스, 스타필로코커스 종, 연쇄상구균 종, 및 엔테로코커스 종을 포함한 후벽군 문의 것들을 포함하는 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 박테리아는 클로스트리듐 종, 바람직하게는 C. 디피실리인 조성물.
  29. 청구항 27에 있어서,
    상기 박테리아는 스타필로코커스 종, 바람직하게는 S. 아우레우스인 조성물.
  30. 청구항 25에 있어서,
    치료, 예방 또는 개선될 수 있는 박테리아 감염은 그람 음성 박테리아 감염인 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 그람 음성 박테리아는 엔테로박테리아세아에, 예를 들어, 살모넬라 종 및 에스케리치아 종 및 캄필로박터 종, 슈도모나스 종 및 비브리오 종을 포함하는 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 박테리아는 비브리오 종, 바람직하게는 V. 하베이 또는 V. 파라헤몰리티쿠스인 조성물.
  33. 청구항 25에 있어서,
    치료, 예방 또는 개선될 수 있는 박테리아 감염은 미코박테륨 종 감염인 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서,
    상기 미코박테륨 종은 미코박테륨 튜버큘로시스 또는 미코박테륨 레프래이고, 가장 바람직하게는 미코박테륨 튜버큘로시스인 조성물.
  35. C. 디피실리 감염을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한, 클로로테타인 또는 이의 유도체 또는 유사체.
  36. C. 디피실리 감염을 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 클로로테타인 또는 이의 유도체 또는 유사체를 투여하거나 또는 투여한 단계를 포함하는 방법.
  37. 박테리아 감염을 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의, 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 항생제 조성물 또는 청구항 23에 따른 식이 보충제 또는 식품을 투여하거나 또는 투여한 단계를 포함하는 방법.
  38. 청구항 37에 있어서,
    치료, 예방 또는 개선될 박테리아 감염은 청구항 26 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
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