CN101891804B - 透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸 - Google Patents
透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101891804B CN101891804B CN2010102060244A CN201010206024A CN101891804B CN 101891804 B CN101891804 B CN 101891804B CN 2010102060244 A CN2010102060244 A CN 2010102060244A CN 201010206024 A CN201010206024 A CN 201010206024A CN 101891804 B CN101891804 B CN 101891804B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- rpod
- nucleic acid
- antisense
- pnag3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了一组以细菌基因rpoD为靶点的肽核酸-透膜肽反义抗菌序列。透膜肽介导的以编码细菌RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD为特异性靶点的反义核酸能够选择性抑制革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠埃希氏菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)或革兰氏阳性菌(包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)菌体内rpoD基因的表达，继而抑制细菌生长繁殖，具有抗菌效果好、毒性低、稳定性好及不易耐药的优点。本发明还公开了该组肽核酸-透膜肽的固相化学制备的方法，本发明合成的抗菌肽可用于制备抗多重耐药菌感染的反义药物，具有开发为高效转运和特异阻断细菌致病基因表达的广谱反义抗菌剂的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一组透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸抗菌序列及其制备方法和治疗多重耐药菌感染的应用。
背景技术
面对耐药细菌的迅速蔓延，感染性疾病的致死率继续攀高的严峻形势，控制耐药细菌的感染造成的危害已经成为各国政府高度关注的焦点，寻找和研制有效控制耐药细菌感染的新策略和新药物，已成为当今世界各国科学家当务之急的研究目标。
经典的抗生素研发重要策略之一是从已有各种类别抗生素中研发新的衍生物。伴随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对现有抗生素产生交叉耐药，采用结构修饰和改造研发新型抗生素受到限制，抗生素研发速度明显减慢。与此同时，新药研发成本越来越高，研发周期日益延长，许多制药公司逐步退出这一研发领域。美国FDA近20年来新申报和批准的抗生素数量减少了56％，在过去的40年中，全球仅有噁唑烷酮类的利奈唑胺和脂肽类的达托霉素上市成为药品。而且这些新型抗生素应用于临床后，并未避免耐药性的产生，细菌很快对这些抗生素产生了新的耐药性。当前抗生素耐药菌株的出现速度已经远远超过了研发新抗生素的速度。为了有效对抗日益严重的细菌耐药，必须寻找新的突破口。
反义抗菌剂突破以细菌蛋白为靶点的经典研究思路，根据致病菌体内基因组学相关信息、以细菌体内增值、致病性、耐药相关基因为靶点，从阻断相关基因的表达入手，进而达到抑制或杀灭细菌的作用，为抗耐药菌治疗带来了新的希望。与经典的抗生素相比较，反义抗菌剂具备以下突出的优点：①以细菌基因为靶点，选择性高；②应用过程中细菌生存选择压力低，不易产生耐药性；③靶点为致病基因，其作用不受基因点突变的影响，不会产生交叉耐药性；④靶点明确，研发成本低。因而反义抗菌剂被认为是被对抗耐药细菌最有希望的突破口，代表着21世纪分子治疗领域革命性的进展。
在硫代反义寡合苷酸、脱氧核酶、肽核酸(peptide nucleid acid，PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)等众多反义分子中，第三代反义分子PNA是较理想的反义抗菌剂先导化合物。PNA具有特异性强、与靶mRNA亲和性高、通透性好、体内和细胞内稳定性、半衰期长和毒性低等优点。新近的研究显示，由透膜肽(cell penetrating peptide，CPP)介导的靶向特定基因的PNA能够选择性抑制大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、分枝杆菌等细菌体内生存相关基因acpP、gyrA、rnpB、fmhB、inhA和rRNA，以及耐药相关基因 blaZ、vanA等的表达，进而抑制或杀灭细菌，其抗菌作用可以持续11个小时，细胞内半衰期可长达48小时。
细菌RNA聚合酶(RNAP)是催化转录合成RNA的重要酶，关闭该基因表达，细菌就会死亡，因而RNAP是很多抗生素作用的靶点。然而目前几乎所有临床常用的作用于RNAP的抗生素均出现耐药，一些以RNAP为靶点的新型药物尚在研究阶段便出现天然耐药细菌。细菌RNAP由α2ββ’4个亚基和σ因子组成。目前几乎所有以RNAP为靶点的抗生素均作用于β或β’亚基，而β和β’亚基又是最易发生突变的亚基，这两个亚基突变是导致多数抗生素耐药，以及不同种类抗生素间发生交叉耐药的主要机理机制。σ70因子广泛分布于细菌体内，主要功能识别启动子，促使DNA解链，启动RNA转录等重要功能，σ因子缺失会导致转录停止，进而细菌死亡。σ70因子的基因序列高度保守，除位于1.2和2.1区域之间的非保守区域外，其各区域的基因序列很少发生突变，因此是理想的反义药物的靶点，目前尚选择性无作用于σ70因子抗菌剂。采用反义策略，设计针对σ70因子基因的反义药物，将是反义抗菌剂研究领域新的突破口。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一组新型透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸序列。
本发明需要解决的技术问题之二是提供一组新型透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸序列的制备方法。
本发明需要解决的技术问题之三是公开所述透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸序列的应用。
本发明的构思是这样的：针对目前感染中最常见，耐药性发生率高，临床危害性大的革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠埃希氏菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)或革兰氏阳性菌(包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)为攻击目标，依据致病细菌基因组学信息，应用反义策略，以编码细菌RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD的mRNA为靶点分别设计革兰氏阴/阳性菌可共享的具有广谱抗菌效力的肽核酸反义序列，将其与能够促进细菌胞膜通透性的透膜肽通过肽键直接连接或通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连，得到具有高效转运和特异阻断细菌致病基因表达的广谱反义抗菌剂——透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ因子基因rpoD的反义肽核酸。
本发明提供的肽核酸-透膜肽反义抗菌序列是在对mRNA二级结构的预测和分析基础上选取最优能量结合区域设计并合成的，可特异性与编码细菌RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD 的mRNA的不同区域结合，阻断基因表达，此系列序列被命名为anti-G+/-rpoD PNA-CPP，序列如下表所示。所述的透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ因子基因rpoD的反义肽核酸序列为10或12个肽核酸单体与10个氨基酸通过肽键直接连接或通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连得到，羧基末端全部酰胺化修饰。上述所有肽核酸-透膜肽的羧基末端均进行酰胺化。
中英文数字缩写表示：G-革兰氏阴性细菌，G+革兰氏阳性细菌，PNA-CPP肽核酸-透膜肽，Gly甘氨酸，K赖氨酸，F苯丙氨酸，R精氨酸，X六氨基己酸，B β-丙氨酸，A腺嘌呤肽核酸单体，T胸腺嘧啶肽核酸单体，C胞嘧啶肽核酸单体，G鸟嘌呤肽核酸单体，5’肽核酸-透膜肽序列羧基末端，3’肽核酸-透膜肽序列氨基末端。
本发明提供的一组透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸序列，其制备方法是固相化学合成，用RP-HPLC色谱仪对其粗品进行分离纯化，再用MALDI-TOF质谱仪测定纯品的分子量。
设计及优化改造的主要思路是：
1.针对编码革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD的不同位点为起始点设计 反义其对应mRNA序列的共享肽核酸-透膜肽抗菌序列(按照列出顺序1-5分别以1、2、3、11、58位基因为起始点)，序列均由相同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列(KFF)3K通过肽键直接连接而组成；对anti-G-rpoD PNA-CPP 1进行负向移位和截短2种优化设计，所得序列均由不同长度肽核酸反义序列(10-12个肽核酸单体)和不同透膜肽序列((KFF)3K或(RXR)4XB)通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连或直接以肽键相连，但整体保持或对换肽核酸序列和透膜肽序列在肽链上的位置，且前者肽核酸反义序列均包含基因rpoD的1位起始编码子AUG的对应反义序列TAC，分别以基因rpoD的1、-1、-3位为起始位点，正向延伸11个碱基长度，后者肽核酸反义序列以基因rpoD的1位为起始位点，正向延伸9个碱基长度。
2.针对编码革兰氏阳性菌(包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD的不同位点为起始点设计反义其对应mRNA序列的共享肽核酸-透膜肽抗菌序列(按照列出顺序1-5分别以36、123、159、233、312位基因为起始点)，序列均由相同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列通过肽键直接连接而组成。对anti-G+rpoD PNA-CPP 4进行负向移位的优化设计，所得序列由肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连，但整体对换肽核酸序列和透膜肽序列在肽链上的位置，且该序列以基因rpoD的231位为起始位点，正向延伸11个碱基长度。
经过设计和优化改造后筛选到17条序列具有良好的透膜递送效率和不同的抗菌活性，且无毒性，非常有希望用于治疗细菌感染的新药开发。
通过药效学实验证明，本发明所述的互补于基因rpoD序列的反义肽核酸均具有抑制敏感和耐药细菌生长的特性，在抗耐药菌治疗方面显示出广阔的应用前景。
附图说明
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。
图1是肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10纯品的RP-HPLC色谱图；
图2是肽核酸-透膜肽nti-G-rpoD PNA-CPP 10纯化的MALDI-TOF质谱图；
图3是不同剂量肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10和anti-G+rpoD PNA-CPP 4分别与E.coli MG1655和MRSAATCC29213作用的浓度效应关系测定结果；
图4是不同剂量肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10和anti-G+rpoD PNA-CPP 4分别与E.coli MG1655和MRSAATCC29213作用后平板克隆形成实验结果的统计图；
图5是anti-G-rpoD PNA-CPP 1和anti-G+rpoD PNA-CPP 4分别对E.coli MG1655和MRSAATCC29213rpoD mRNA表达的影响图示。
具体实施方式
细菌耐药性的产生使得临床上许多曾经有效的抗生素失效，因此本发明的研究目的是寻找新的反义抗菌药物靶点。为此，本发明根据细菌的分子生物学信息，以细菌生存必需的RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD为靶基因，利用连接透膜肽形成共轭物的方法将反义肽核酸药物导入敏感或耐药菌体内，用功能学实验来评估以rpoD为靶基因的反义肽核酸药物能否抑制或阻断rpoD的表达，从而抑制或杀死细菌，进而证实RNA聚合酶σ70因子可以作为反义抗菌药物的新靶点。
实施例1 透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸的设计：
在GENBANK中检索到的大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655)的RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi：49175990)，该序列全长1842bp，该序列的1bp至613bp之间是RpoD的有效序列，其中1bp至65bp编码RpoD的1.1区域，95bp至126bp编码RpoD的1.2区域，137bp至348bp编码RpoD的非必需区域，379bp至449bp编码RpoD的2.0区域，453bp至535bp编码RpoD的3.0区域，541bp至599bp编码RpoD的4.0区域。
在GENBANK中检索到的肠炎沙门氏杆菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Paratyphi A str.)的RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi：56412276)，该序列全长1983bp，该序列的46bp至660bp之间是RpoD的有效序列，其中46bp至110bp编码RpoD的1.1区域，142bp至173bp编码RpoD的1.2区域，184bp至395bp编码RpoD的非必需区域，426bp至496bp编码RpoD的2.0区域，505bp至582bp编码RpoD的2.0区域，588bp至646bp编码RpoD的4.0区域。
在GENBANK中检索到的肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578)的RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi：152968582)，该序列全长1842bp，该序列的1bp至613bp之间是RpoD的有效序列，其中1bp至65bp编码RpoD的1.1区域，95bp至126bp编码RpoD的1.2区域，137bp至348bp编码RpoD的非必需区域，379bp至449bp编码RpoD的2.0区域，453bp至535bp编码RpoD的3.0区域，541bp至599bp编码RpoD的4.0区域。
在GENBANK中检索到铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi：882038)，该序列全长1854bp，该序列的1bp至617bp之间是RpoD的有效序列，其中6bp至61bp编码RpoD的1.1区域，97bp至128bp编码RpoD的1.2区域，139bp至352bp编码RpoD的非必需区域，383bp至453bp编码RpoD 的2.0区域，462bp至539bp编码RpoD的3.0区域，545bp至623bp编码RpoD的4.0区域。
在GENBANK中检索到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus Mu 50)的RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi：57634611)，该序列全长1107bp，该序列的9bp至368bp之间是RpoD的有效序列，其中14bp至94bp编码RpoD的1.1区域，96bp至132bp编码RpoD的1.2区域，135bp至205bp编码RpoD的的2.0区域，214bp至291bp编码RpoD的3.0区域，297bp至355bp编码RpoD的4.0区域。
根据碱基互补原则，从DNA序列得到rpoD的mRNA，应用RNAstructure 4.5计算机软件进行辅助设计，筛选出一系列反义核酸作用靶位点，根据这些靶位点设计出相应的反义肽核酸，再根据自由能最低原理、反义寡聚核苷酸与靶序列结合的净能量、反义寡聚核苷酸与直链靶序列结合所需要的能量、反义寡聚核苷酸-靶序列结合后碱基从靶序列断裂需要的能量、反义寡聚核苷酸分子内结合所需要的能量、反义寡聚核苷酸分子间结合所需要的能量、核酸-靶序列解链的温度等参数，各挑选出5条件较优的反义核酸序列，同时设计了随机对照的错配和无关反义核酸序列(mismatch/unrelated anti-G+/-rpoD-PNA-CPP)。经BLAST软件验证实验所用的反义核酸序列均具有高度特异性，并为增加其溶解性、稳定性、以及与靶基因序列的亲和力采用第三代反义核酸修饰结构肽核酸，并在末端连接透膜肽以达到高效透细菌外膜、递送反义肽核酸的目的，
anti-G-rpoD PNA-CPP 1-10是以编码革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD的mRNA为靶点设计的共享肽核酸-透膜肽反义抗菌序列。anti-G-rpoD PNA-CPP 1-5是针对rpoD的不同位点为起始点设计的反义其对应mRNA序列的共享肽核酸-透膜肽抗菌序列(按照列出顺序1-5分别以1、2、3、11、58位基因为起始点正向延伸)，且均由相同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列通过肽键直接连接而组成。anti-G-rpoD PNA-CPP 6-10是对anti-G-rpoD PNA-CPP 1的优化设计，均由不同长度肽核酸反义序列(10-12个肽核酸单体)和透膜肽序列通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连，且肽核酸反义序列均包含基因rpoD的1位起始编码子AUG的对应反义序列TAC；anti-G-rpoD PNA-CPP 6与anti-G-rpoD PNA-CPP 1在肽核酸反义序列上相同，anti-G-rpoD PNA-CPP 7-10整体对换肽核酸序列和透膜肽序列在链上的位置，anti-G-rpoD PNA-CPP 7与anti-G-rpoD PNA-CPP 1在肽核酸反义序列上相同，anti-G-rpoD PNA-CPP8的肽核酸反义序列是对anti-G-rpoD PNA-CPP 1的的肽核酸反义序列负向移位设计，分别以基因rpoD的-1、-3位为起始位点，正向延伸11个碱基长度，anti-G-rpoD PNA-CPP10的肽核酸反义序列是对anti-G-rpoD PNA-CPP 1的肽核酸反义序列的截短设计，以基因rpoD 的1位为起始位点，正向延伸9个碱基长度。
anti-G-rpoD PNA-CPP 10的错配序列：5′-GTTTCTCTTCAG-Gly-KFFKFFKFFK-3′
anti-G-rpoD PNA-CPP 10的无关序列：5′-GTCGGATCAATT-Gly-KFFKFFKFFK-3′
anti-G+rpoD PNA-CPP 4的错配序列：5′-GGTTTTGCTCCA-KFFKFFKFFK-3′
anti-G+rpoD PNA-CPP 4的无关序列：5′-GGTCAGATAGCC-KFFKFFKFFK-3′
下面通过具体实施例，以肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10和anti-G+rpoD PNA-CPP 4为例，进一步详述本发明。
实施例2 肽核酸-透膜肽的制备及分离纯化
在本实施例中，按上述序列制备所有肽核酸-透膜肽，同时制备错配和无关肽核酸-透膜肽序列作为对照。本实施例以HATU/DIEA为缩合剂，在MBHA-Rink树脂上，采用Fmoc保护α-氨基酸，从C-端(羧基端)向N-端(氨基端)手动/自动固相合成C-末端酰胺化的肽核酸-透膜肽链。合成的肽核酸-透膜肽经过高浓度TFA剪切后，用RP-HPLC色谱仪对其粗品进行分离纯化，再用MALDI-TOF质谱仪测定纯品的分子量。
具体试验步骤如下。
第一步，肽核酸-透膜肽的固相合成(以anti-G-rpoD PNA-CPP 10样品为例)。制备的肽核酸-透膜肽从C端到N端逐个进行。首先称量0.025g MBHA-Rink树脂装柱，加2.0ml二氯甲烷(CHCl2)，使其溶胀，20％哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱保护，DMF清洗。以1∶1∶2的摩尔比将9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的第一个氨基酸或肽核酸单体、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA)溶解于适量二甲基甲酰胺(DMF)，活化后与脱保护后的树脂在柱上循环偶合反应2～6h，DMF洗涤。以后连接的氨基酸重复以上活化、缩合、脱保护和洗涤的过程，直到制备结束。
第二步，肽核酸-透膜肽的剪切(以anti-G-rpoD PNA-CPP 1样品为例)。取下反应后的树脂，加入切割液(95％三氟乙酸，5％间甲酚)，室温反应1.5-2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，3500转/分钟离心5分钟，收集沉淀并室温干燥。
第三步，肽核酸-透膜肽的RP-HPLC纯化(以anti-G-rpoD PNA-CPP 1样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱梯度分离(洗脱液为含0.1％三氟乙酸的20％-80％的乙腈)，收集260nm处洗脱峰。
第四步，抗菌肽的RP-HPLC分析(以1号样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向色谱柱梯度分析(洗脱液为含0.1％三氟乙酸的20％-80％ 的乙腈)，计算多肽纯品的纯度。结果如图2所示，纯化后的anti-G-rpoD PNA-CPP 10经过RP-HPLC分析，在色谱图中显示其纯度为达到90％以上。
第五步，肽核酸-透膜肽纯品的MALDI-TOF质谱鉴定(以1号样品为例)。取0.5μl多肽样品溶液的氧化铁分散液点于MALDI靶板上，再点上0.5μL的有机基质溶液，待靶板上的点样液干燥、结晶后，将靶板放进质谱仪，进行质谱测定。结果如图1所示，制备的US1经过MALDI-TOF分析，在质谱图中显示的分子量测定值(4122.7KD)与anti-G-rpoD PNA-CPP 10序列计算出的理论值(4121.4KD)一致，说明制备的肽核酸-透膜肽即为设计的肽核酸-透膜肽。
实施例3 肽核酸-透膜肽的MIC测定
第一步，取无菌96孔板1个，取非边缘的10行×6列＝60孔，每行分别标记为“抗生素对照、肽核酸-透膜肽1、2、3、4、5”。每孔分别加入50μl M-H营养肉汤。
第二步，在每行第一列孔中对应标记分别加入50μl浓度为2048ug/ml的抗生素和浓度为100μM的肽核酸-透膜肽1、2、3、4、5。
第三步，充分混匀每行第一孔后吸出50μl加入第二孔，充分混匀后吸出50μl加入第三孔，依此类推，2倍倍比稀释至第十孔，弃去最后吸出的50μl含药M-H营养肉汤。
第四步，挑受试菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆于2ml LB肉汤中摇菌至对数生长期，吸取适量菌液用M-H营养肉汤按2倍倍比稀释至OD620约为0.1(0.5麦氏比浊标准)，此稀释倍数下细菌浓度约为5×107～8个/ml，再稀释500倍后按50μl/孔加入96孔板中。
第五步，微孔震荡器上充分振荡1min后置于37℃培养12～16h后肉眼观察各孔菌液清亮程度，肉眼可见清亮的最低药物浓度对应孔浓度即为此药物的MIC。结果见表1-3。
表1anti-G+rpoD PNA-CPP对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果；
Table 1 MIC of anti-rpoD PNA-peptides for quality cortrol and clinical strains of MRSA in M-Hbroth culture
Structures shown in uppercase letters are for peptide sequences and lowercase lettersare for PNA sequence.The PNAs are written from their N to their Oterminusand the Nterminus∞rresponds to the 5V end of a conventional oligonudeotide.
表2 anti-G-rpoD PNA-CPP对大肠杆菌的MIC测定结果；
表3 anti-G-rpoD PNA-CPP对沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌和铜绿假单胞菌的MIC测定结果；
实施例4 肽核酸-透膜肽的浓度效应关系测定
第一步，取无菌96孔板1个，取非边缘的10行×6列＝60孔，每行分别标记为“受试 菌生长对照、肽核酸-透膜肽高、中、低剂量组”。
第二步，每组取5个复孔，受试菌生长对照组每孔分别加入50μl M-H营养肉汤，肽核酸-透膜肽高、中、低剂量组分别加入50μl 2倍于对应剂量浓度的含药M-H营养肉汤。
第三步，挑受试菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆于2ml LB肉汤中摇菌至对数生长期，吸取适量菌液用M-H营养肉汤按2倍倍比稀释至OD620约为0.1(0.5麦氏比浊标准)，此稀释倍数下细菌浓度约为5×107～8个/ml，再稀释500倍后按50μl/孔加入96孔板中。
第四步，微孔震荡器上充分振荡1min后置于37℃培养，每1h于酶标仪测定OD6201次至16h，取5孔OD值平均值和对应时间绘制浓度效应关系曲线。
结果如图3所示，与各自对应的正常对照组相比，anti-G-rpoD PNA-CP10组和anti-G-rpoDPNA-CP10组均可剂量依赖性的抑制E.coli MG1655和MRSA ATCC29213的生长，且三个剂量组(40、20和10μM)的anti-G-rpoD PNA-CP 10和anti-G-rpoD PNA-CP 10在作用3-6h即可明显抑制E.coli MG1655和MRSA ATCC29213的生长。
实施例5不同剂量肽核酸-透膜肽作用后平板克隆形成实验
第一步，取无菌96孔板1个，取非边缘的10行×6列＝60孔，每行分别标记为“受试菌生长对照、肽核酸-透膜肽高、中、低剂量组”。
第二步，每组取5个复孔，受试菌生长对照组每孔分别加入50μl M-H营养肉汤，肽核酸-透膜肽高、中、低剂量组分别加入50μl 2倍于对应剂量浓度的含药M-H营养肉汤。
第三步，挑受试菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆于2ml LB肉汤中摇菌至对数生长期，吸取适量菌液用M-H营养肉汤按2倍倍比稀释至OD620约为0.1(0.5麦氏比浊标准)，此稀释倍数下细菌浓度约为5×107～8个/ml，再稀释500倍后按50μl/孔加入96孔板中。
第四步，微孔震荡器上充分振荡1min后置于37℃培养培养12～16h后，充分混匀每孔菌液后吸取10μl至适量无菌去离子水中，均匀涡旋15s，同上法100倍比连续稀释102～106倍后，分别取0.1ml菌液接种于M-H琼脂平板上(各接种三份)，35℃孵育过夜后，取菌落数在30-300之间的平板计数，并取其平均数。
第六步，CFU＝三块板的菌落平均数×稀释倍数，即为原液中每毫升菌液中的活菌数。肉眼计数菌落数，并求其平均值，从而在对数坐标纸绘制不同剂量药物组CFU统计数据图。
结果如图4所示，与各自对应的正常对照组相比，anti-G-rpoD PNA-CP10组和anti-G-rpoDPNA-CP10组均可剂量依赖性的降低CFU，且三个剂量组(40、20和10μM)的anti-G-rpoDPNA-CP 10和anti-G-rpoD PNA-CP10可降低CFU2-6个数量级。
实施例6 PCR引物的设计与合成
依据GeneBank中报道的Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655、Salmonella enterica subsp.enterica serovar Paratyphi A str.ATCC9150、Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578、Pseudomonas aeruginosa PAO1以及MRSA Mu50的rpoD及16S rRNA的基因序
列，用软件PrimerPremier5.0设计了rpoD及16S rRNA的10对特异性扩增引物。引物均经BLAST软件验证具有高度特异性，并由Invitrogen生物工程技术服务有限公司合成，序列见下表。
实施例7 RT-PCR法检测反义靶基因rpoD的mRNA表达变化
1、提取细菌总RNA：
(1)冰浴5min后的菌液5000rpm离心10min，弃去上清，收集细菌沉淀；
(2)细菌沉淀中加入100μl裂解液，37℃孵育30min，每隔10min振荡1次，以充分裂解细菌；
(3)加入1ml Trizol reagent，室温放置5min后加氯仿0.2ml/ml Trizol reagent，盖紧离心管，用手轻柔混匀离心管；
(4)吸取水相上清转移至一新的离心管中，加入异丙醇0.5ml/ml Trizol reagent，盖紧离心管，用手轻柔混匀，室温放置20min，13000rpm、4℃离心20min；
(5)弃去上清，加入75％乙醇1ml/ml Trizol reagent，用手剧烈摇荡使RNA充分溶解，8000rpm、4℃离心10min；
(6)弃去上清，然后置于清洁环境挥干乙醇10min，但不要干燥过分，以免降低RNA的溶解度。将RNA溶于DEPC处理过的水中作为RT模板(必要时可在55～60℃孵育 助溶)，或于-20℃冻存。
2、RT：用DU800核酸蛋白分析仪测总RNA的浓度及纯度。反应体系20μl：5×RT buffer10μl(含Mg2+)，2.5mmol/1.28ml dNTP 5μl，随机引物1μl，模板RNA 1μg，RNase inhibitor 1μl，10U/μl反转录酶AMV 1μl，用DEPC处理过的水补足20μl。反应条件：30℃ 15min，85℃ 30sec，25℃ 1min，冰浴后进行PCR或-20℃保存cDNA。
3、PCR：反应体系25μl：Takara Premix Taq 12.5μl，0.1μmol/L引物各1μl，模板cDNA 1μl，用DEPC处理过的水补足25μl。反应条件：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，循环数取32，最后一个循环的延伸条件为72℃ 7min。
4、PCR产物分析：取5μl PCR反应产物加入含0.5μg/ml溴化乙啶的1.0％的琼脂糖凝胶的点样孔中，5V/cm进行电泳。电泳结束后用凝胶成像仪进行观察照相并进行光密度扫描，测条带密度值(Integral density value，IDV)。因为16SrRNA在细菌中稳定表达，所以本发明以16srRNA作为内参照。
结果如图5所示，E.coli MG1655和MRSA ATCC29213的rpoD和16S rRNA的RT-PCR的扩增产物的电泳结果显示，各组分别在219bp、398bp、242bp、437bp处出现特异性扩增条带。与各自对应的正常对照组相比，anti-G-rpoD PNA-CP10组和anti-G-rpoD PNA-CP10组均可剂量依赖性的降低rpoD mRNA的表达。
本发明的研究结果提示，以RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD为靶点设计的反义肽核酸可以有效的抑制靶基因的转录、表达，抑制或杀死细菌。上述的反义肽核酸具有开发为抗耐药菌的反义核酸药物的前景。
序列表
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸
<130>无
<160>14
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>1
gttttgctcc at 12
<210>2
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>2
ggttttgctc ca 12
<210>3
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>3
gggttttgct cc 12
<210>4
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>4
gtgactgcgg gt 12
<210>5
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>5
ggtcagatag cc 12
<210>6
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>6
ttttgctcca tt 12
<210>7
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>7
ttgctccatt ca 12
<210>8
<211>10
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(10)
<400>8
tttgctccat 10
<210>9
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>9
gtcggatcaa tt 12
<210>10
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>10
agtttttcag ca 12
<210>11
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>11
tcatccattt ga 12
<210>12
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>12
gtttctcgtc ag 12
<210>13
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>13
cgcccaattt ct 12
<210>14
<211>12
<212>DNA
<213>革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)
<220>
<221>肽核酸
<222>(1)..(12)
<400>14
ttctcgtcag ta 12
Claims (2)
1.一种透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的肽核酸-透膜肽anti-G-rpoDPNA-CPP 10，其特征在于，其序列为5′-KFFKFFKFFK-Gly-TTTGCTCCAT-3′
中英文数字缩写表示：G-革兰氏阴性细菌，G+革兰氏阳性细菌，PNA-CPP肽核酸-透膜肽，Gly甘氨酸，K赖氨酸，F苯丙氨酸，A腺嘌呤肽核酸单体，T胸腺嘧啶肽核酸单体，C胞嘧啶肽核酸单体，G鸟嘌呤肽核酸单体，5’肽核酸-透膜肽序列羧基末端，3’肽核酸-透膜肽序列氨基末端。
2.根据权利要求书1所述的肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10在制备抗敏感及多重耐药的大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌的药物中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102060244A CN101891804B (zh) | 2010-06-21 | 2010-06-21 | 透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102060244A CN101891804B (zh) | 2010-06-21 | 2010-06-21 | 透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101891804A CN101891804A (zh) | 2010-11-24 |
| CN101891804B true CN101891804B (zh) | 2012-12-26 |
Family
ID=43101176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102060244A Expired - Fee Related CN101891804B (zh) | 2010-06-21 | 2010-06-21 | 透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101891804B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014187315A1 (zh) * | 2013-05-21 | 2014-11-27 | 成都先导药物开发有限公司 | 一种化合物给药前体及药物载体制剂 |
| CN108498806A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-09-07 | 四川大学 | 一种反义肽核酸-dna四面体载体复合物及其制备方法和应用 |
| WO2019232059A1 (en) * | 2018-05-29 | 2019-12-05 | Techulon Inc. | Antisense oligonucleotides for the treatment of p. aeruginsoa, a. baumannii and k. pneumoniae infections |
| WO2021133928A1 (en) * | 2019-12-27 | 2021-07-01 | Techulon Inc. | Antisense oligonucleotides for the treatment of pseudomonas and acinetobacter infections |
| CN114592080B (zh) * | 2022-04-01 | 2023-12-01 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 检测四种病原菌的RT-ddPCR试剂 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001027262A1 (en) * | 1999-10-13 | 2001-04-19 | Pantheco A/S | Gene selection using pnas |
| CN1387567A (zh) * | 1998-11-11 | 2002-12-25 | 潘特科有限公司 | 肽与核酸类似物诸如pna、lna、或吗啉代之间的缀合物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001076636A2 (en) * | 2000-04-06 | 2001-10-18 | Pantheco A/S | Pharmaceutical composition of modified pna molecules |
-
2010
- 2010-06-21 CN CN2010102060244A patent/CN101891804B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1387567A (zh) * | 1998-11-11 | 2002-12-25 | 潘特科有限公司 | 肽与核酸类似物诸如pna、lna、或吗啉代之间的缀合物 |
| WO2001027262A1 (en) * | 1999-10-13 | 2001-04-19 | Pantheco A/S | Gene selection using pnas |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Xin-Xing Tan et al.Peptide Nucleic Acid Antisense Oligomer as a Therapeutic Strategy against Bacterial Infection: Proof of Principle Using Mouse Intraperitoneal Infection.《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》.2005, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101891804A (zh) | 2010-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6465429B1 (en) | Antimicrobial cationic peptides | |
| CN101891804B (zh) | 透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸 | |
| Sridevi et al. | Inhibitory effects of reserpine against efflux pump activity of antibiotic resistance bacteria | |
| CA2222599A1 (en) | Antimicrobial cationic peptides | |
| US10774113B2 (en) | Anti-infective compound | |
| Conlon et al. | Antimicrobial properties of brevinin‐2‐related peptide and its analogs: efficacy against multidrug‐resistant Acinetobacter baumannii | |
| Liu et al. | Autoinducer-2 influences tetracycline resistance in Streptococcus suis by regulating the tet (M) gene via transposon Tn916 | |
| Lee et al. | Synergistic effect of tetrandrine and ethidium bromide against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) | |
| Gu et al. | A teleost bactericidal permeability-increasing protein-derived peptide that possesses a broad antibacterial spectrum and inhibits bacterial infection as well as human colon cancer cells growth | |
| Zuo et al. | Effects of metformin on Streptococcus suis LuxS/AI-2 quorum sensing system and biofilm formation | |
| van Geelen et al. | (Some) current concepts in antibacterial drug discovery | |
| CN102939301A (zh) | 作为抗菌剂使用的肽化合物 | |
| KR20170053877A (ko) | 벼메뚜기에서 유래한 항균 펩타이드 옥시야신-2 및 그의 조성물 | |
| CN101215325A (zh) | 一组抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN101475630B (zh) | 牛蛙抗菌肽temporin-La及其基因和在制药中的应用 | |
| KR102010847B1 (ko) | 벼메뚜기에서 유래한 옥시야신-5 펩타이드 및 이를 함유하는 항균, 항진균 또는 항알레르기성 조성물 | |
| CN103421100B (zh) | 一种抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN100365018C (zh) | 一组抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN101503459B (zh) | 牛蛙抗菌肽temporin-Lb及其基因和在制药中的应用 | |
| CN101182351A (zh) | 一组抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| Kharadze et al. | In vitro antimicrobial activity study of some new arginine-based biodegradable poly (ester urethane) s and poly (ester urea) s | |
| Mani et al. | Molecular and functional characterization of metabolites from terrestrial Streptomyces hygroscopicus AVS7 isolated from Western Ghats, India | |
| KR102595446B1 (ko) | 신규한 펩티드핵산을 포함하는 플로로퀴놀론계 항생제 내성 대장균에 대한 항균용 조성물 | |
| CN109535238B (zh) | 一种经结构改造的抗菌肽Cec4或其盐及应用 | |
| US9156893B2 (en) | Antimicrobial bacteria strains and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: The Fourth Military Medical University of the Chinese People's Liberation Army Bai Hui Document name: the First Notification of an Office Action |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121226 Termination date: 20160621 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |