CN115197304B - 一种枯草三十七肽的分离纯化方法 - Google Patents

一种枯草三十七肽的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种枯草三十七肽的分离纯化方法。所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，包括以下步骤：将待处理样品进行反相C18半制备柱分离，采用三氟乙酸水溶液和乙腈水溶液作为流动相进行梯度洗脱。所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。

Description

一种枯草三十七肽的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种枯草三十七肽的分离纯化方法。
背景技术
为满足畜禽营养需求，改善饲料品质，提高饲料适口性，改善畜产品风味，饲料添加剂在养殖产业中的应用越来越广泛。抗生素具有抑制和杀灭病原微生物，促进畜禽生长，提高饲料利用率等功能被广泛应用于饲料添加剂。由于抗生素在饲料中添加使用时被滥用、超量使用或不按停药期使用，导致细菌耐药性、环境污染、食品安全、饲料成本等一系列问题。
抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs）是一种具有抗菌活性的小分子多肽，是维护宿主细胞防御外来病原菌感染的第一防御屏障。抗菌肽在胃肠内具有易降解、不易产生耐药性等优点，已成为传统抗生素的一个极具潜力的替代品。
枯草三十七肽(sublancin)是一种由 37 个氨基酸组成的生物多肽，氨基酸序列为GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQNYRQFCR，分子式为C162H254N50O51S5，相对分子质量为3879.8Da（按2018年国际相对原子质量），性质稳定，可耐受1.5-9.5的pH环境，在高温环境中能够稳定存在。枯草三十七肽具有抗革兰氏阳性菌活性，其抗菌谱包括巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、产气夹膜梭菌等，对革兰氏阴性菌无明显抑菌效果。同时能够改善动物肠道健康、提高机体免疫力和生长性能。因此，枯草三十七肽具有代替抗生素作为饲料添加剂的巨大潜力。
目前关于枯草三十七肽的分离纯化方法需要在特定的pH除杂、超滤等一系列工艺条件下进行，存在工艺复杂、纯化条件严苛、试剂耗损成本高等问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种枯草三十七肽的分离纯化方法，所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，具有简单易操作、分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少、环境友好、工艺简单和适合工业化规模生产等优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种枯草三十七肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
将待处理样品进行反相C18半制备柱分离，采用三氟乙酸水溶液和乙腈水溶液作为流动相进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱顺序包括：
0~15min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%；
15~25min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为60%~69%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为31%~40%；
25~30min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%；
30~35min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%。
所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，简便，且可以获得99.7%以上纯度的枯草三十七肽。该方法无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。
优选地，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积百分含量为0.1%~0.2%。
优选地，所述乙腈水溶液中乙腈的含量为77vol %~83vol %。
优选地，所述梯度洗脱的洗脱顺序包括：
0~15min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%；
15~25min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为35%；
25~30min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%；
30~35min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%。
优选地，收集16~18min内的所述梯度洗脱的洗脱液。
优选地，所述梯度洗脱的流动相流速为2~4mL/min。
优选地，所述待处理样品中枯草三十七肽的浓度为10~20mg/ml。
优选地，将所述梯度洗脱的洗脱液进行冷冻干燥。
优选地，所述冷冻干燥的温度为-65~-70℃。
优选地，所述冷冻干燥的时间为47~49h。
优选地，所述枯草三十七肽的分离纯化方法分离纯化得到的枯草三十七肽的色谱纯度≥99.7%。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，简便，且可以获得99.7%以上纯度的枯草三十七肽。该方法无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。
（2）本发明提供的枯草三十七肽的分离纯化方法分离纯化得到的枯草三十七肽可用于饲料添加剂，能够代替抗生素，能够改善动物肠道健康、提高机体免疫力和生长性能，还具有提高食品安全和降低饲料的成本的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明制备的枯草三十七肽半制备色谱图；
图2为本发明制备的枯草三十七肽分离纯化后的HPLC-UV色谱图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种枯草三十七肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
将待处理样品进行反相C18半制备柱分离，采用三氟乙酸水溶液和乙腈水溶液作为流动相进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱顺序包括：
0~15min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%（例如65%、66%、67%、68%、69%或70%），流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%（例如30%、31%、32%、33%、34%或35%）；
15~25min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为60%~69%（例如60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或69%），流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为31%~40%（例如31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%）；
25~30min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%（例如65%、66%、67%、68%、69%或70%），流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%（例如30%、31%、32%、33%、34%或35%）；
30~35min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%（例如65%、66%、67%、68%、69%或70%），流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%（例如30%、31%、32%、33%、34%或35%）。
所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，简便，且可以获得99.7%以上纯度的枯草三十七肽。该方法无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。
本发明提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，相比于现有的分离纯化方法（AKTA纯化系统和固定化金属离子亲和色谱），采用半制备柱分离纯化枯草三十七肽具有分离效果好、节省洗脱溶剂、纯化步骤简单等多个优点。
本发明提供的枯草三十七肽的分离纯化方法无需调节pH，也无需超滤浓缩，可以通过直接上半制备柱的方式实现较高纯度的枯草三十七肽的制备。极大程度上简化了高纯度枯草三十七肽的分离纯化工艺，减少了分离纯化阶段对于特定设备（比如超滤膜、pH测量仪）的依赖程度，降低了试剂的耗损，更适合于工艺化生产。
本发明的枯草三十七肽的分离纯化方法，选择三氟乙酸水溶液和乙腈水溶液作为流动相，进行反相C18半制备柱的梯度洗脱可以获得较好的分离度，且出峰时间稳定。
优选地，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积百分含量为0.1%~0.2%。
在一些具体的实施方式中，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积百分含量例如可以为，但不限于0.1%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%、0.17%、0.18%、0.19%或0.2%。
优选地，所述乙腈水溶液中乙腈的含量为77vol %~83vol %。
在一些具体的实施方式中，所述乙腈水溶液中乙腈的含量例如可以为，但不限于77vol %、78vol %、79vol %、80vol %、81vol %、82vol %、83vol %。
在一定体积百分数的流动相条件下，有助于提升洗脱的分离度。
优选地，所述梯度洗脱的洗脱顺序包括：
0~15min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%；
15~25min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为35%；
25~30min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%；
30~35min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%。
优选地，收集16~18min内的所述梯度洗脱的洗脱液。
优选地，所述梯度洗脱的流动相流速为2~4mL/min。
在一些具体的实施方式中，所述梯度洗脱的流动相流速为2mL/min、2.2mL/min、2.4mL/min、2.6mL/min、2.8mL/min、3.0mL/min、3.2mL/min、3.4mL/min、3.6mL/min、3.8mL/min或4mL/min。
发明人发现采用上述反相C18半制备柱分离以及梯度洗脱程序时，收集16min-18min内的洗脱液，经低温冷冻干燥后，获得白色粉末状枯草三十七肽，色谱纯度大于99.7%。
优选地，所述待处理样品中枯草三十七肽的浓度为10~20mg/ml。
在一些具体的实施方式中，所述待处理样品中枯草三十七肽的浓度例如可以为，但不限于10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml或20mg/ml。
优选地，将所述梯度洗脱的洗脱液进行冷冻干燥。
优选地，所述冷冻干燥的温度为-65~-70℃。
在一些具体的实施方式中，所述冷冻干燥的温度例如可以为，但不限于-65℃、-66℃、-67℃、-68℃、-69℃或-70℃。
优选地，所述冷冻干燥的时间为47~49h。
在一些具体的实施方式中，所述冷冻干燥的时间例如可以为，但不限于47h、48h或49h。
优选地，所述枯草三十七肽的分离纯化方法分离纯化得到的枯草三十七肽的色谱纯度≥99.7%。
通过本发明提供的枯草三十七肽的分离纯化方法分离纯化得到的枯草三十七肽具有较高的色谱纯度，可以直接用于质谱分析。
下面将结合实施例和对比例对本发明的实施方案进行详细说明。
实施例1
本实施例提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
将枯草三十七肽利用超纯水进行复溶，得到待处理样品，待处理样品中枯草三十七肽的浓度为19.2mg/ml，进行反相C18半制备柱分离，采用0.1vol %三氟乙酸水溶液和80vol %乙腈水溶液梯度洗脱，洗脱程序见表1，收集枯草三十七肽出峰范围的洗脱液，如图1中保留时间16min-18min范围，低温冷冻干燥，获得白色粉末状枯草三十七肽，色谱纯度大于99.7%，如图2所示。
表1 实施例1的洗脱程序
时间（ min ） 流速（ ml/min ） 三氟乙酸水 溶液 vol % 乙腈水溶液 vol %
0 2 70 30
15 2 65 35
2 5 2 6 5 3 5
3 0 2 7 0 30
3 5 2 7 0 30
实施例2
本实施例提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
将枯草三十七肽利用超纯水进行复溶，得到待处理样品，待处理样品中枯草三十七肽的浓度为10mg/ml，进行反相C18半制备柱分离，采用0.2vol %三氟乙酸水溶液和80%vol乙腈水溶液梯度洗脱，洗脱程序见表2，收集枯草三十七肽出峰范围的洗脱液，保留时间16min-18min范围的洗脱液，低温冷冻干燥，获得白色粉末状枯草三十七肽，色谱纯度大于99.7%。
表2 实施例2的洗脱程序
时间（ min ） 流速（ ml/min ） 三氟乙酸水 溶液 vol % 乙腈水溶液 vol %
0 2 70 30
15 2 65 35
2 5 2 6 5 3 5
3 0 2 70 3 0
3 5 2 7 0 3 0
实施例3
本实施例提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
将枯草三十七肽利用超纯水进行复溶，得到待处理样品，待处理样品中枯草三十七肽的浓度为20mg/ml，进行反相C18半制备柱分离，采用0.1vol %三氟乙酸水溶液和77%乙腈水溶液梯度洗脱，洗脱程序见表3，收集枯草三十七肽出峰范围的洗脱液，保留时间16min-18min范围的洗脱液，低温冷冻干燥，获得白色粉末状枯草三十七肽，色谱纯度大于99.7%。
表3 实施例3的洗脱程序
时间（ min ） 流速（ ml/min ） 三氟乙酸水 溶液 vol % 乙腈水溶液 vol %
0 2 70 30
15 2 65 35
2 5 2 6 5 3 5
3 0 2 70 3 0
3 5 2 7 0 3 0
实施例4
本实施例提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
将枯草三十七肽利用超纯水进行复溶，得到待处理样品，待处理样品中枯草三十七肽的浓度为15mg/ml，进行反相C18半制备柱分离，采用0.1vol %三氟乙酸水溶液和83%vol乙腈水溶液梯度洗脱，洗脱程序见表4，收集枯草三十七肽出峰范围的洗脱液，保留时间16min-18min范围的洗脱液，低温冷冻干燥，获得白色粉末状枯草三十七肽，色谱纯度大于99.7%。
表4 实施例4的洗脱程序
时间（ min ） 流速（ ml/min ） 三氟乙酸水 溶液 vol % 乙腈水溶液 vol %
0 2 7 0 3 0
1 5 2 6 5 3 5
2 5 2 6 5 3 5
3 0 2 7 0 3 0
3 5 2 7 0 3 0
对比例1
本对比例提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于流动相种类不同，有机相为乙腈-水-三氟乙酸混合液，乙腈、水和三氟乙酸的体积比为800：200：0.085，具体的洗脱程序见表5。获得白色粉末状枯草三十七肽，色谱纯度99.5%。
表5 对比例1的洗脱程序
时间（ min ） 流速（ ml/min ） 三氟乙酸水 溶液 vol % 乙腈 - 水 - 三氟乙酸混合液 vol %
0 2 70 30
15 2 65 35
2 5 2 6 5 3 5
3 0 2 70 3 0
3 5 2 7 0 3 0
对比例2
本对比例提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，与实施例1的区别在于流动相种类和洗脱程序不同，有机相为乙腈-水-三氟乙酸混合液，乙腈、水和三氟乙酸的体积比为800：200：0.085，洗脱程序为等度洗脱，具体的洗脱程序见表6。获得白色粉末状枯草三十七肽，色谱纯度99.4%。
表6 对比例2的洗脱程序
时间（ min ） 流速（ ml/min ） 三氟乙酸水 溶液 vol % 乙腈 - 水 - 三氟乙酸混合液 vol %
0 2 68.5 31.5
40 2 6 8.5 31.5
综上可知，本发明提供的枯草三十七肽的分离纯化方法，操作简单，且可以获得较高纯度的枯草三十七肽。该方法无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (8)

1.一种枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待处理样品进行反相C18半制备柱分离，采用三氟乙酸水溶液和乙腈水溶液作为流动相进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱顺序包括：
0~15min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%；
15~25min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为60%~69%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为31%~40%；
25~30min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%；
30~35min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%~70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%~35%；
所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积百分含量为0.1%~0.2%；
所述乙腈水溶液中乙腈的含量为77vol %~83vol %；
所述枯草三十七肽的氨基酸序列为GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQNYRQFCR。
2.根据权利要求1所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱顺序包括：
0~15min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%；
15~25min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为65%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为35%；
25~30min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%；
30~35min流动相中所述三氟乙酸水溶液的体积百分比为70%，流动相中所述乙腈水溶液的体积百分比为30%。
3.根据权利要求1所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，收集16~18min内的所述梯度洗脱的洗脱液。
4.根据权利要求1所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流动相流速为2~4mL/min。
5.根据权利要求1所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，所述待处理样品中枯草三十七肽的浓度为10~20mg/ml。
6.根据权利要求1所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，将所述梯度洗脱的洗脱液进行冷冻干燥。
7.根据权利要求6所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，所述冷冻干燥的温度为-65~-70℃；
所述冷冻干燥的时间为47~49h。
8.根据权利要求1~7任一项所述的枯草三十七肽的分离纯化方法，其特征在于，所述枯草三十七肽的分离纯化方法分离纯化得到的枯草三十七肽的色谱纯度≥99.7%。
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