CN112876547A - 一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药的分离技术领域，具体涉及一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法。本发明中纯化乳酸链球菌素的方法包括：取Nisin粗品，先以苯基键合硅胶为固定相进行疏水层析，再以羧基键合硅胶为固定相进行弱阳离子层析，分离得到高纯度Nisin。本发明对盐析后的乳酸链球菌素粗纯液分别进行疏水层析和弱阳离子层析，仅通过三个步骤实现高纯度Nisin的制备，在提高乳酸链球菌素纯度的同时减少多肽的失活率，乳酸链球菌素的总活性回收率可达到75％以上，本发明两种层析方法的结合改善乳酸链球菌素的提纯效果，选择性好、分辨率高、分离速度快，且所用的层析色谱柱无需强酸强碱再生，绿色环保，色谱柱使用寿命长，从而可降低工业化生产成本。

Description

一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法

技术领域

本发明涉及生物医药的分离技术领域，具体涉及一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin，尼辛)亦称乳酸链球菌肽，是乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的多肽类化合物，由34个氨基酸残基组成，其分子末端有氨基和羧基，氨基末端为异亮氨酸，羧基末端为赖氨酸，分子量约为3500Da。乳酸链球菌具有稳定、高效的抗菌活性，可被人体吸收利用，不会改变人体肠道内正常菌群，且不会产生如其他抗菌素出现的耐药性问题或交叉抗性。乳酸链球菌素能有效抑制食品腐败的多种革兰氏阳性菌，是食品保鲜防腐、延长货架期的良品，到目前为止，全世界已有五十多个国家和地区批准将乳酸链球菌素作为食品防腐剂，现已广泛应用于乳制品、罐头、海产品、肉制品等。此外，乳酸链球菌素在医疗卫生领域也有较大的应用前景，如高纯度的乳酸链球菌素对治疗母牛乳腺炎就有很好的疗效。

然而进一步开发乳酸链球菌素的药用价值需要解决高纯度乳酸链球菌素的生产工艺问题。目前，乳酸链球菌的发酵生产是获得乳酸链球菌素的唯一途径，但发酵产物组分复杂，对分离和纯化工艺有极高的要求，很难实现高纯度乳酸链球菌素的制备。现有的市售乳酸链球菌素产品纯度较低，含有较多杂蛋白及其他非活性成分，进入机体后容易引起一些不良反应，阻碍了其在医药卫生领域的进一步应用和推广。因此，如何分离制得高纯度乳酸链球菌素是需要解决的研究问题。而另一方面，多肽类化合物在分离纯化后还存在回收率低的问题，一般多肽或蛋白质在纯化过程中容易受温度、pH值、缓冲液离子强度、溶剂等因素的影响，导致自身活性丧失。如公告号为CN100554276C的专利文献中建立了从含乳酸链球菌素的乳酸链球菌培养上清液中纯化乳酸链球菌素，虽然提高了纯度和得率，但活性多肽的总回收率仅能达到57％左右，可见其乳酸链球菌素在纯化操作中丧失了部分活性。公开号为CN105755074A的中国专利中公开了一种Nisin的提取方法，虽然提高了活性，但其工艺流程复杂，需经过四次层析分离的步骤，制备周期长、效率低、成本高，也不适用于工业化生产。

因此，在满足高纯度的条件下保证活性和稳定性，仍然是高纯度乳酸链球菌素制备面临的难题，绿色高效的纯化工艺仍有待进一步开发。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种选择性好、分辨率高、简单高效、绿色环保的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，使得到的乳酸链球菌素同时具有较高的纯度和活性。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，取Nisin粗品，先以苯基键合硅胶为固定相进行疏水层析，再以羧基键合硅胶为固定相进行弱阳离子层析，分离得到高纯度Nisin。

本发明对盐析后的乳酸链球菌素粗纯液分别进行疏水层析和弱阳离子层析，仅通过三个步骤实现高纯度Nisin的制备，并且乳酸链球菌素的活性回收率可达到75％以上。其中，疏水层析和弱阳离子层析均采用制备型高效液相色谱，分离速度快、分辨率高、选择性好。

优选地，本发明的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法包括如下步骤：

(1)盐析：在乳酸链球菌素发酵液中加入固体无机盐，溶解后离心，收集沉淀复溶，得到Nisin粗品溶液；

(2)反相色谱分离：取Nisin粗品溶液进样，用平衡液I对苯基键合硅胶色谱柱进行柱平衡，再用洗脱液I进行洗脱，收集洗脱峰I部分，得到精纯液I；

(3)离子交换色谱分离：取精纯液I进样，用平衡液II对羧基键合硅胶色谱柱进行柱平衡，再用洗脱液II进行洗脱，收集洗脱峰II部分，得到精纯液II，最后进行后处理，即得高纯度Nisin。

本发明反相色谱分离采用苯基键合的硅胶色谱柱，其对样品中不同组分的结合力强度不同，作用力弱的Nisin可通过降低洗脱液中的盐浓度或增加有机溶剂浓度实现解吸附，而疏水作用力强的杂蛋白、色素、异味物质等杂质组分吸附于色谱柱介质表面，需在完成分离后用再生液进行清洗解离。现有技术中普遍采用C18色谱柱作为固定相进行反相层析分离，如专利文献CN100554276C中记载的工艺方法，但C18硅胶柱介质表面的烷基链长度对蛋白质、多肽类物质的吸附保留和活性回收有很大影响，烷基链越长，固定相疏水性越强，蛋白质和多肽与固定相的结合力越强，为使Nisin顺利洗脱需增加流动相有机溶剂的洗脱浓度，而有机溶剂会引起多肽链聚集，导致蛋白分子生物活性丧失并不可逆吸附。而本发明采用了表面键合苯基的硅胶基质，其疏水性相对C18柱较弱，因而在分离时可减少有机溶剂的使用，避免Nisin失活，同时有利于节约资源和成本，减少环境污染。并且，Nisin和杂质成分在疏水层析作用中有较大的选择性差异，采用苯基键合硅胶柱比C18柱分离的效果更好，提纯比活性和回收率也更高。

离子交换色谱可使目标产物和带相反电荷的介质以静电力的作用结合，再通过改变流动相的离子强度或调整pH值、增加有机溶剂的方式进行洗脱。乳酸链球菌素为碱性多肽，在等电点pH值下带正电荷，可以和阳离子交换填料表面吸附结合。本发明采用带羧基的弱酸性阳离子交换色谱柱可快速分离Nisin和杂质组分，去除样品中不被阳离子柱吸附的寡聚糖、糖类多肽、杂质蛋白等，并且在Nisin洗脱后可较好地实现柱再生。而目前多用强阳离子交换色谱进行分离，其虽然可以增加Nisin的吸附量，但同时增加了杂蛋白、色素等在固定相介质中的吸附强度，使柱子再生不彻底，杂蛋白、色素等物质在色谱柱中的保留沉积不仅会影响其分辨率和产物的提纯效果，还会大大缩短色谱柱的使用寿命。

优选地，本发明的步骤(1)具体为：在室温条件下，在乳酸链球菌素发酵液中加入10～35wt％的无机盐，搅拌溶解后，静置1～5小时，离心，弃去上清液，收集沉淀，用浓度为30～60mmol/L、pH值为2.5～4.0的缓冲液复溶，得到粗纯液。

进一步优选，本发明所用无机盐可以选自钠盐、钾盐或铵盐。

进一步优选，本发明所用缓冲液为乙酸钠-乙酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、乳酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液中的至少一种。

优选地，本发明的步骤(2)中平衡液I为pH值为2.5～4.0的缓冲液与氯化钠的混合溶液；其中，氯化钠的浓度为460～520mmol/L。

优选地，本发明的步骤(2)中洗脱液I为浓度为30～60mmol/L、pH值为2.5～4.0的缓冲液。

优选地，步骤(2)还包括在收集洗脱峰I后，用再生液I和平衡液I分别清洗色谱柱，完成色谱柱的再生。

进一步优选，所述再生液I的pH值为2.5～4.0。

进一步优选，所述再生液I为不同浓度的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿、异丙醇等溶液。

优选地，步骤(3)中平衡液II为浓度为1～10mmol/L、pH值为3.0～4.0的缓冲液。

优选地，步骤(3)中洗脱液II为pH值为3.0～4.0的0～30％乙醇。

进一步优选，步骤(3)中的洗脱为用pH值为3.5～3.8的0～10％乙醇进行梯度洗脱。

优选地，步骤(3)还包括在收集洗脱峰II后，用再生液II和平衡液II分别清洗色谱柱，完成色谱柱的再生。

进一步优选，所述再生液II为pH值为2～3的75～95％乙醇。

优选地，本发明步骤(2)和(3)中进样的流速为250～330mL/min。

本发明相比于现有技术，具有如下有益效果：

(1)本发明通过苯基键合硅胶的疏水层析作用和羧基键合硅胶的离子交换层析作用对Nisin发酵液进行分离提纯，在提高乳酸链球菌素纯度的同时减少多肽的失活率，有效保证了高纯度乳酸链球菌素的生物活性；

(2)本发明制得的高纯度乳酸链球菌素比活性达到55000IU/mg以上，总活性回收率达到75％以上；

(3)本发明的阳离子交换采用带羧基的弱阳离子交换基质，既可以吸附结合乳酸链球菌素，又能使杂蛋白、色素等杂质不易沉积于固定相中，有利于提高目标产品的纯度和色谱柱的再生；

(4)本发明通过两种层析方法的结合改善乳酸链球菌素的提纯效果，选择性好、分辨率高、分离速度快，且分离所用的层析色谱柱无需通过强酸强碱再生，使用寿命长，工艺简单高效，绿色环保，同时有助于降低工业化生产成本。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法均为本领域的常规方法。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。

本发明提供一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，包括如下步骤：

(1)盐析：在室温条件下，在乳酸链球菌素发酵液中加入10～35wt％的钠盐，搅拌溶解后，静置1～5小时，离心，弃去上清液，收集沉淀，用浓度为30～60mmol/L、PH值为2.5～4.0的乙酸钠-乙酸缓冲液复溶，得到Nisin粗品溶液；

(2)反相色谱分离：取Nisin粗品溶液以220～320mL/min的流速进样，先用3～6倍柱体积的平衡液I对苯基键合硅胶色谱柱进行柱平衡，再用洗脱液I进行洗脱，当基线上升时开始收集至吸收峰下降回到基线，即收集洗脱峰I部分，得到精纯液I；收集结束后用3～6倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用3～6倍柱体积的平衡液I清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；其中，平衡液I为浓度为30～60mmol/L、pH值为2.5～4.0的乙酸钠-乙酸缓冲液与氯化钠的混合溶液，混合溶液中氯化钠浓度为460～520mmol/L；洗脱液I为浓度为30～60mmol/L、pH值为2.5～4.0的乙酸钠-乙酸缓冲液；再生液I为pH值为2.5～4.0的50～75％乙醇；

(3)离子交换色谱分离：取精纯液I以220～320mL/min的流速进样，先用3～6倍柱体积的平衡液II对羧基键合硅胶色谱柱进行柱平衡，再用洗脱液II进行洗脱，当基线上升时收集主要的洗脱峰II部分，得到精纯液II，最后进行后处理，即得高纯度Nisin；收集结束后用3～6倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用3～6倍柱体积的平衡液II清洗，完成羧基键合硅胶色谱柱的再生；其中，平衡液II为浓度为1～10mmol/L、pH值为3.0～4.0的乙酸钠-乙酸缓冲液，洗脱液II为pH值为3.0～4.0的0～30％乙醇，再生液II为pH值为2～3的75～95％乙醇。

本发明的乳酸链球菌素发酵液中蛋白质含量≥6mg/mL，生物效价≥35000IU/ml，比活性≥5500IU/mg；Nisin粗品溶液中蛋白质含量≥7.5mg/mL，生物效价≥130000IU/ml，比活性≥15000IU/mg；精纯液I中蛋白质含量≥2.5mg/mL，生物效价≥90000IU/ml，比活性≥30000IU/mg；精纯液II中蛋白质含量≥5mg/mL，生物效价≥340000IU/ml，比活性≥55000IU/mg；得到的高纯度Nisin的总活性回收率≥75％。

上述乙酸钠-乙酸缓冲液还可以用柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、乳酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或其他同类缓冲液替换；盐析所用钠盐也可用其他无机盐替换，如钾盐或、铵盐等。

上述再生液I也可用相同pH值的其他溶剂替换，如甲醇、甲酸、乙腈、异丙醇等。本发明在硅胶表面键合苯基作为疏水层析介质，对Nisin和杂质的分离效率更高，减少Nisin失活率，同时可用弱酸性的有机溶液进行柱再生，减少强酸或强碱的使用，既可延长色谱柱使用寿命，又有利于节约资源和成本，减少环境污染。

实施例1

本实施例提供一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，包括如下步骤：

(1)盐析：在室温条件下，在乳酸链球菌素发酵液中加入浓度为20wt％的氯化钠溶液，搅拌溶解后，静置2小时，离心，弃去上清液，收集沉淀，用浓度为50mmol/L、PH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液复溶，得到Nisin粗品溶液；

(2)反相色谱分离：取Nisin粗品溶液以300mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的平衡液I对苯基键合硅胶色谱柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)进行柱平衡，再用洗脱液I进行洗脱，当基线上升时开始收集至吸收峰下降回到基线，即收集洗脱峰I部分，得到精纯液I；收集结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的平衡液I清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生，再生后的色谱柱可用于下次分离；其中，平衡液I为浓度为50mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液与氯化钠的混合溶液，混合溶液中氯化钠浓度为500mmol/L；洗脱液I为浓度为500mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液；再生液I为pH值为3.6的60％乙醇；

(3)离子交换色谱分离：取精纯液I以300mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的平衡液II对羧基键合硅胶色谱柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)进行柱平衡，再用洗脱液II进行线性梯度洗脱，当基线上升时收集主要的洗脱峰II部分，得到精纯液II，精纯液II经过冷冻干燥，即得到高纯度Nisin；收集结束后用5倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的平衡液II清洗，完成羧基键合硅胶色谱柱的再生；其中，平衡液II为浓度为5mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液，洗脱液II为pH值为3.6的10％乙醇；再生液II为pH值为2.8的90％乙醇。

本实施例所用色谱柱的介质填料均为宁波博睿瀚达生物科技有限公司自行生产。分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法对乳酸链球菌素发酵液、Nisin粗品溶液、精纯液I和精纯液II进行生物活性测定，结果如表1所示，最终得到的高纯度Nisin的总活性回收率可达到76.4％。

表1实施例1中各步骤样品的生物活性测定结果

实施例2

本实施例提供一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，包括如下步骤：

(1)盐析：在室温条件下，在乳酸链球菌素发酵液中加入浓度为20wt％的氯化钠溶液，搅拌溶解后，静置2小时，离心，弃去上清液，收集沉淀，用浓度为50mmol/L、PH值为3.6的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液复溶，得到Nisin粗品溶液；

(2)反相色谱分离：取Nisin粗品溶液以300mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的平衡液I对苯基键合硅胶色谱柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)进行柱平衡，再用洗脱液I进行洗脱，当基线上升时开始收集至吸收峰下降回到基线，即收集洗脱峰I部分，得到精纯液I；收集结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的平衡液I清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；其中，平衡液I为浓度为50mmol/L、pH值为3.6的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液与氯化钠的混合溶液，混合溶液中氯化钠浓度为500mmol/L；洗脱液I为浓度为500mmol/L、pH值为3.6的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液；再生液I为pH值为3.6的60％乙醇；

(3)离子交换色谱分离：取精纯液I以300mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的平衡液II对羧基键合硅胶色谱柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)进行柱平衡，再用洗脱液II进行线性梯度洗脱，当基线上升时收集主要的洗脱峰II部分，得到精纯液II，精纯液II经过冷冻干燥，即得到高纯度Nisin；收集结束后用5倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的平衡液II清洗，完成羧基键合硅胶色谱柱的再生；其中，平衡液II为浓度为5mmol/L、pH值为3.6的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，洗脱液II为pH值为3.6的10％乙醇；再生液II为pH值为2.5的90％乙醇。

本实施例所用色谱柱的介质填料均为自行生产。分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法进行检测，所得高纯度Nisin的总活性回收率为75.8％，各步骤活性测定结果如表2所示。

表2实施例2中各步骤样品的生物活性测定结果

对比例1

本对比例提供一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其与实施例1的区别仅在于反相色谱分离的色谱柱为C18柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)，所用分离介质为自行生产的十八烷基键合硅胶，其他操作方法与条件均与实施例1相同。

分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法对乳酸链球菌素发酵液、Nisin粗品溶液、精纯液I和精纯液II进行生物活性测定，所得高纯度Nisin的总活性回收率为51.8％，各步骤活性测定结果如表3所示。

表3对比例1中各步骤样品的生物活性测定结果

对比例2

本对比例提供一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其与实施例1的区别仅在于离子交换色谱分离的色谱柱为强阳离子琼脂糖凝胶柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)，所用填料为SP Sepharose BigBead，其他操作方法与条件均与实施例1相同。

分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法对乳酸链球菌素发酵液、Nisin粗品溶液、精纯液I和精纯液II进行生物活性测定，所得高纯度Nisin的总活性回收率为69.5％，各步骤活性测定结果如表4所示。

表4对比例2中各步骤样品的生物活性测定结果

对比例3

本对比例提供一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，包括如下步骤：

(1)盐析：在室温条件下，在乳酸链球菌素发酵液中加入浓度为20wt％的氯化钠溶液，搅拌溶解后，静置2小时，离心，弃去上清液，收集沉淀，用浓度为50mmol/L、PH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液复溶，得到Nisin粗品溶液；

(2)离子交换色谱分离：取Nisin粗品溶液以300mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的平衡液I对羧基键合硅胶色谱柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)进行柱平衡，再用洗脱液I进行线性梯度洗脱，当基线上升时收集主要的洗脱峰I部分，得到精纯液I，精纯液I经过冷冻干燥，即得到高纯度Nisin；收集结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的平衡液I清洗，完成羧基键合硅胶色谱柱的再生；其中，平衡液I为浓度为5mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液，洗脱液I为pH值为3.6的10％乙醇；再生液I为pH值为2.8的90％乙醇。

(3)反相色谱分离：取精纯液I以300mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的平衡液II对苯基键合硅胶色谱柱(直径100mm×长度1000mm，粒径5μm，孔径120埃)进行柱平衡，再用洗脱液II进行洗脱，当基线上升时开始收集至吸收峰下降回到基线，即收集洗脱峰II部分，得到精纯液II；收集结束后用5倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的平衡液II清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；其中，平衡液II为浓度为50mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液与氯化钠的混合溶液，混合溶液中氯化钠浓度为500mmol/L；洗脱液II为浓度为500mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液；再生液II为pH值为3.6的60％乙醇。

本对比例所用色谱柱的介质填料均为自行生产。分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法对乳酸链球菌素发酵液、Nisin粗品溶液、精纯液I和精纯液II进行生物活性测定，所得高纯度Nisin的总活性回收率为73.3％，各步骤活性测定结果如表5所示。

表5对比例3中各步骤样品的生物活性测定结果

以上实施例对本发明要求保护的技术方案参数范围内点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换形成的新的技术方案，同样都在本发明要求的保护范围内，并且本发明方案所有涉及的参数间如无特别说明，则相互之间不存在不可替换的唯一组合。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，并不用于限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以采用等同替换或等效变换的方式获得与本发明相似或相近的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，取Nisin粗品，先以苯基键合硅胶为固定相进行疏水层析，再以羧基键合硅胶为固定相进行弱阳离子层析，分离得到高纯度Nisin。

2.根据权利要求1所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)盐析：在乳酸链球菌素发酵液中加入固体无机盐，溶解后离心，收集沉淀复溶，得到Nisin粗品溶液；

(2)反相色谱分离：取Nisin粗品溶液进样，用平衡液I对苯基键合硅胶色谱柱进行柱平衡，再用洗脱液I进行洗脱，收集洗脱峰I部分，得到精纯液I；

(3)离子交换色谱分离：取精纯液I进样，用平衡液II对羧基键合硅胶色谱柱进行柱平衡，再用洗脱液II进行洗脱，收集洗脱峰II部分，得到精纯液II，最后进行后处理，即得高纯度Nisin。

3.根据权利要求2所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤(1)中复溶所用溶剂为pH值为2.5～4.0的缓冲液。

4.根据权利要求2所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤(2)中平衡液I为pH值为2.5～4.0的缓冲液与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠浓度为460～520mmol/L；洗脱液I为pH值为2.5～4.0的缓冲液。

5.根据权利要求2所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤(2)还包括在收集洗脱峰I后，用再生液I和平衡液I分别清洗色谱柱，完成色谱柱的再生。

6.根据权利要求5所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，所述再生液I的pH值为2.5～4.0。

7.根据权利要求2所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤(3)中平衡液II为pH值为3.0～4.0的缓冲液，洗脱液II为pH值为3.0～4.0的0～30％乙醇。

8.根据权利要求7所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤(3)中的洗脱为用pH值为3.5～3.8的0～10％乙醇进行梯度洗脱。

9.根据权利要求2所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤(3)还包括在收集洗脱峰II后，用再生液II和平衡液II分别清洗色谱柱，完成色谱柱的再生。

10.根据权利要求9所述的制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法，其特征在于，所述再生液II为pH值为2～3的75～95％乙醇。