发明内容
本发明提供一种万古霉素G的制备方法,能够提高万古霉素G的制备效率,实现万古霉素G的高效富集,获得高纯度的万古霉素G。
本发明提供一种万古霉素杂质G的制备方法,包括:(1)将含有万古霉素类原料的溶液进行水热反应,得到混合液;所述万古霉素类原料包括万古霉素和/或盐酸万古霉素;(2)采用树脂吸附所述混合液,然后采用洗脱液洗脱吸附所述混合液后的树脂,收集所述洗脱过程中产生的万古霉素杂质G的含量不低于75%的第一富集液;(3)采用第一纳滤膜对所述第一富集液实施浓缩脱盐处理,得到第一浓缩液;(4)对所述第一浓缩液实施柱层析分离,收集分离过程中产生的万古霉素杂质G的含量不低于99%的第二富集液;(5)采用第二纳滤膜对所述第二富集液实施浓缩脱盐处理,得到第二浓缩液;(6)对所述第二浓缩液实施冷冻干燥,得到万古霉素杂质G。
根据本发明的一实施方式,将所述万古霉素类原料与水混合后,调节pH为4~6,体系澄清后,得到所述含有万古霉素类原料的溶液;和/或,所述含有万古霉素类原料的溶液中万古霉素类原料的浓度为90g/L~100g/L。
根据本发明的一实施方式,所述水热反应的条件为:温度为50℃~70℃,和/或,时间为100h~140h。
根据本发明的一实施方式,得到所述第一富集液的过程包括:将所述混合液加入至装填有所述树脂的吸附柱中,以实现采用树脂吸附所述混合液;然后向所述吸附柱中加入洗脱液进行所述洗脱,收集洗脱过程中从所述吸附柱中流出的万古霉素杂质G的含量不低于75%的第一流出液,所述第一流出液即为所述第一富集液。
根据本发明的一实施方式,所述树脂包括非极性树脂;和/或,所述树脂的孔径为
根据本发明的一实施方式,所述洗脱液包括碳酸氢铵溶液,所述碳酸氢铵溶液中碳酸氢氨的浓度为0.3%~0.35%。
根据本发明的一实施方式,所述第一纳滤膜的孔径为400Da~500Da;和/或,步骤(3)中,所述第一浓缩液的体积为所述第一富集液的体积的1/20~1/30。
根据本发明的一实施方式,所述柱层析分离的过程中,所用的流动相包括流动相A和流动相B,流动相A包括质量浓度为(1±0.2)%的乙酸铵溶液,流动相B包括乙腈;其中,步骤(4)中,将所述第一浓缩液分为n份,所述柱层析分离包括n次循环分离过程,每次循环分离过程分离一份第一浓缩液,每次循环分离过程包括:从0至45min,流动相A与流动相B的体积比从(90±2):(10±2)逐渐减小至(20±2):(80±2);在(45.01±0.01)min时,调节流动相A与流动相B的体积比为(90±2):(10±2),并在(45.01±0.01)min至50min的时间段均保持流动相A与流动相B的体积比为(90±2):(10±2);然后进行下一次循环分离过程。
根据本发明的一实施方式,采用十八烷基硅烷键合硅胶柱实施所述柱层析分离。
根据本发明的一实施方式,所述第二纳滤膜的孔径为400Da~500Da;和/或,步骤(5)中,采用第二纳滤膜对所述第二富集液实施浓缩脱盐处理,直至通过所述第二纳滤膜的水体的电导率不大于100μs/cm,收集所述第二纳滤膜上的所述第二浓缩液。
本发明中,以盐酸万古霉素和/或万古霉素为起始物,通过水热反应可以获得组分较为单一的混合产物,增加上述混合液中万古霉素杂质G的含量,同时减少其他杂质种类及含量,通过大孔树脂吸附、洗脱液洗脱,可以获得万古霉素杂质G含量较高的粗富集品,配合后续的经第一纳滤膜浓缩脱盐、柱层析分离、第二纳滤膜浓缩脱盐、冷冻干燥等过程,可以获得高纯度的万古霉素杂质G,实现万古霉素杂质G的高效富集,其中,由于混合液中杂质较少,便于万古霉素杂质G的分离提纯,还可以简化万古霉素杂质G的制备工艺,操作过程简便快速,且可以降低成本(相对现有制备工艺,本发明成本可降低30倍以上),显著提高万古霉素杂质G的制备效率,实现万古霉素杂质G的批量生产,对于实际产业化应用具有重要意义。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的方案,下面对本发明作进一步地详细说明。以下所列举具体实施方式只是对本发明的原理和特征进行描述,所举实例仅用于解释本发明,并非限定本发明的范围。基于本发明实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
本发明的万古霉素杂质G的制备方法包括:(1)将含有万古霉素类原料的溶液进行水热反应,得到混合液;万古霉素类原料包括万古霉素和/或盐酸万古霉素;(2)采用树脂吸附混合液,然后采用洗脱液洗脱吸附混合液后的树脂,收集洗脱过程中产生的万古霉素杂质G的含量不低于75%的第一富集液;(3)采用第一纳滤膜对第一富集液实施浓缩脱盐处理,得到第一浓缩液;(4)对第一浓缩液实施柱层析分离,收集分离过程中产生的万古霉素杂质G的含量不低于99%的第二富集液;(5)采用第二纳滤膜对第二富集液实施浓缩脱盐处理,得到第二浓缩液;(6)对第二浓缩液实施冷冻干燥,得到万古霉素杂质G。
一般情况下,步骤(2)中,万古霉素杂质G的含量是指万古霉素杂质G的色谱纯度(或称色谱含量),即收集洗脱过程中产生的万古霉素杂质G的色谱纯度不低于75%的第一富集液。具体实施时,可以通过高效液相色谱(HPLC)法对洗脱过程中产生的第一流出液进行分析,分析结果中,各物质的峰面积之和为A总,其中,万古霉素杂质G的峰面积为A1,则第一流出液中万古霉素杂质G的色谱纯度为A1与A总的比值(即A1/A总),收集A1/A总不小于75%的第一流出液,即得到第一富集液。
此外,步骤(4)中,万古霉素杂质G的含量是指万古霉素杂质G的色谱纯度,即收集洗脱过程中产生的万古霉素杂质G的色谱纯度不低于99%的第二富集液。具体实施时,可以通过HPLC对分离过程中产生的第一流出液进行分析,分析结果中,各物质的峰面积之和为B总,其中,万古霉素杂质G的峰面积为B1,则第一流出液中万古霉素杂质G的色谱纯度为B1与B总的比值(即B1/B总),收集B1/B总不小于99%的第一流出液,即得到第二富集液。
本发明中,通过步骤(1)的水热反应,利于万古霉素类原料转化成万古霉素杂质G,配合后续的树脂吸附、洗脱液洗脱、第一纳滤膜浓缩脱盐、柱层析分离、第二纳滤膜浓缩脱盐、冷冻干燥等过程,可以实现万古霉素杂质G的高效富集,获得高纯度、高收率的万古霉素杂质G(一般是万古霉素杂质G晶体),以万古霉素为起始物(反应原料)为例,根据发明人的研究分析,相关可能的反应过程示意如下:
上述含有万古霉素类原料的溶液具体可以是万古霉素类原料的水溶液,在一些实施例中,可以将万古霉素类原料与水混合后,调节pH为4~6(例如pH为5),体系澄清后,得到含有万古霉素类原料的溶液。具体地,万古霉素类原料与水混合后,一般形成混悬液,调节该混悬液的pH为4~6,体系变为澄清,即制得含有万古霉素类原料的溶液。
一般情况下,万古霉素类原料与水混合后的体系为酸性,可以采用碱调节其pH为4~6,具体可以采用无机碱调节其pH为4~6,优选地,该无机碱包括氢氧化钠。
在一些优选实施例中,上述含有万古霉素类原料的溶液中,万古霉素类原料的浓度可以为90g/L~100g/L,例如90g/L、92g/L、94g/L、96g/L、98g/L、100g/L或其中的任意两者组成的范围。
在一些具体实施例中,水热反应的条件为:温度可以为50℃~70℃,例如50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃或其中的任意两者组成的范围,利于进一步提高万古霉素杂质G的纯度及收率,反应时间一般可以为100h~140h,例如100h、105h、110h、115h、120h、125h、130h、135h、140h或其中的任意两者组成的范围。
具体实施时,可以将适量水与万古霉素类原料混合,得到混悬液;向其中加入碱以调节pH为4~6,体系澄清后,转移至容量瓶中,振荡摇匀并定容,制得万古霉素类原料浓度为90g/L~100g/L的含有万古霉素类原料的溶液,随后可以密封容量瓶,将容量瓶置于50℃~70℃的水浴中进行保温,以使容量瓶中的溶液进行上述水热反应。
上述混合液制备完成后,可以立即使用,或者在5℃左右存放后使用,具体实施时可以根据需要选择。其中,在5℃左右的低温下存放,可以防止混合液继续反应,进一步减少杂质,提高万古霉素杂质G的制备效率。
本发明中,采用树脂吸附混合液,可以实现对万古霉素杂质G的粗富集(即初步富集),该树脂具体可以是大孔树脂,其孔径一般可以为
例如
或其中的任意两者组成的范围。在一些优选实施例中,所用的树脂可以包括非极性树脂,尤其可以是非极性大孔树脂,例如采用来自日本三菱化学的HP20SS树脂。
在一些实施例中,上述制备过程作用的洗脱液(或称解析液)可以包括碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液,该碳酸氢铵溶液中碳酸氢氨的浓度为0.3%~0.35%,其pH约为7.8~8.0,电导率约为3.52±0.1ms/cm,采用该洗脱液利于进一步提高万古霉素杂质G的纯度及产率。
在一些实施例中,得到第一富集液的过程包括:将混合液加入至装填有树脂的吸附柱中,以实现采用树脂吸附混合液;然后向吸附柱中加入洗脱液进行洗脱,收集洗脱过程中从吸附柱中流出的万古霉素杂质G的色谱含量不低于75%的第一流出液,第一流出液即为第一富集液。
将混合液加入至装填有树脂的吸附柱中后,吸附柱中的树脂对混合液中的万古霉素杂质G等成分进行吸附,具体实施时,可以先向吸附柱中加入纯化水冲洗吸附柱,以洗去吸附柱内的残留废液,然后再向其中加入洗脱液进行洗脱;洗脱过程中,吸附在树脂上的不同组分按照极性情况依次流出,当检测到流出液(即第一流出液)中万古霉素杂质G的色谱含量不低于75%时,开始收集,直至流出液中万古霉素杂质G的色谱含量开始低于75%时,停止收集,所收集的流出液即为第一富集液。其中,可以采用高效液相色谱(HPLC)法检测第二流出液中万古霉素杂质G的含量;混合液、纯化水、洗脱液均从吸附柱的上端加入至吸附柱中,洗脱过程中产生的第一流出液从吸附柱的下端流出。
在一些实施例中,第一纳滤膜的孔径可以为400Da~500Da,利于对第一富集液进行浓缩脱盐处理,在纳滤浓缩脱盐过程中,第一富集液中的盐随水一起通过纳滤膜,实现浓缩脱盐,收集第一纳滤膜上的浓缩液,即得到第一浓缩液。
一般情况下,步骤(3)中,通过第一纳滤膜将第一富集液浓缩至使第一浓缩液的体积为第一富集液的体积的1/20~1/30,即浓缩后的体系体积为浓缩前的体系体积的1/20~1/30,例如1/20、1/22、1/25、1/28、1/30或其中的任意两者组成的范围。
本发明中,通过柱层析分离,从第一浓缩液中分离出万古霉素杂质G,实现万古霉素杂质G的二次富集。在一些实施例中,柱层析分离的过程中,所用的流动相包括流动相A和流动相B,流动相A包括质量浓度为(1±0.2)%的乙酸铵溶液,流动相B包括乙腈,其中,乙酸铵溶液可以是由乙酸铵溶于水配制而成,其质量浓度一般控制为1%,考虑配制过程中的误差,所配制的乙酸铵溶液的质量浓度偏差范围一般是±0.2%或±0.1%,即所配制的乙酸铵溶液的质量浓度为(1±0.2)%或(1±0.1)%。
其中,步骤(4)中,将所述第一浓缩液分为n份,所述柱层析分离包括n次循环分离过程,每次循环分离过程分离一份第一浓缩液,每次循环分离过程包括:从0至45min,流动相A与流动相B的体积比从(90±2):(10±2)逐渐减小至(20±2):(80±2);在(45.01±0.01)min时,调节流动相A与流动相B的体积比为(90±2):(10±2),并在(45.01±0.01)min至50min的时间段均保持流动相A与流动相B的体积比为(90±2):(10±2);然后进行下一次循环分离过程。具体地,每次循环分离过程中,在0min时(即开始分离之前),流动相A与流动相B的体积比为(90±2):(10±2),开始分离后,从0min至45min,流动相A与流动相B的体积比逐渐降低,直至在45min时流动相A与流动相B的体积比达到(20±2):(80±2);随后,在(45.01±0.01)min时,调节流动相A与流动相B的体积比为(90±2):(10±2),并保持该体积比至50min,然后进行下一次循环分离。
具体实施时,可以在柱层析分离仪器上按照上述调节过程设置梯度系统,通过仪器自动切换阀门,以实现调节上述各时间点的流动相组成。
具体地,采用装填有填料的层析柱进行柱层析分离,该层析柱可以是高压制备柱,尤其可以采用十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18),其填料的粒径约为10±2μm或10±1μm,例如是来自华谱新创科技有限公司的C18HCE填料(粒径约为10μm)。具体实施时,将第一浓缩液加入至装填有上述填料的层析柱中,上柱量(即加入至层析柱中的第一浓缩液的量)为:第一浓缩液中万古霉素G的质量(通过HPLC检测计算)与填料的体积比为7g~7.5g:1000mL(即每7g~7.5g万古霉素杂质G对应1L体积填料),填料体积为层析柱中的填料装填体积。柱层析分离过程中,收集从层析柱中流出的万古霉素杂质G的含量不低于99%的第二流出液,该第二流出液即为第二富集液,其中,具体可以采用HPLC检测第二流出液中万古霉素杂质G的色谱含量。
在采用第二纳滤膜对第二富集液进行浓缩脱盐处理过程中,第二富集液中的盐随水一起通过第二纳滤膜,实现对第二富集液的浓缩脱盐,在一些实施例中,第二纳滤膜的孔径为400Da~500Da。
在一些实施例中,步骤(5)中,采用第二纳滤膜对第二富集液实施浓缩脱盐处理,直至通过第二纳滤膜的水体的电导率不大于100μs/cm,收集第二纳滤膜上的第二浓缩液。
具体实施时,可以将第二浓缩液置于冷冻机中冻干(即冷冻干燥),即得到万古霉素杂质G(一般为万古霉素杂质G晶体粉末)。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、取23g万古霉素结晶粉(含有万古霉素B)于250mL烧杯中,向其中加180mL水制成混悬液,采用1mol/L的氢氧化钠溶液调节体系pH约为5,体系澄清后,转移至250mL容量瓶中,震荡使溶液均匀并定容;然后瓶口加塞并用封口胶密封;
2、将容量瓶置于60℃的水浴中,保温120h,以使其中的溶液进行水热反应,反应完成后,得到混合液;将含有混合液的容量瓶放入5℃冰箱快速冷却;
3、取1L的HP20SS树脂(来自日本三菱化学)装柱,得到含有大孔树脂的吸附柱;将冰箱中的容量瓶取出,取出其中的混合液进行上柱(即将混合液加入至吸附柱中),上柱完成后,用1L的纯化水冲洗吸附柱,以洗去柱内的残留废液;其中,HP20SS树脂的平均孔径约为
;
4、配置0.3%的NH4HCO3溶液(PH约为7.93,电导率约为3.50ms/cm),将该NH4HCO3溶液加入至吸附柱中进行洗脱,通过HPLC检测洗脱过程中产生的第一流出液中万古霉素杂质G的色谱纯度,收集万古霉素杂质G的色谱纯度不低于75%的第一流出液,得到第一富集液,第一富集液的体积共约2.6L;
5、采用第一纳滤膜对第一富集液进行浓缩脱盐,浓缩至使得到的第一浓缩液的体积为105mL(第一浓缩液的体积约为第一富集液的1/24.8),停止浓缩,得到第一浓缩液;其中,第一纳滤膜的孔径为400Da-500Da;
为了方便计算,使用盐酸万古霉素标准品为对照品,采用欧盟药典EP10.4记录的万古霉素B的检测方法,计算第一浓缩液中万古霉素杂质G的含量约为3.2g;检测过程简述如下:
(1)色谱条件
色谱柱:Waters ACQUITY
CSH
TM C18 2.1×150mm填料粒径1.7μm;
流速:0.30±0.02ml/min
柱温:40±2℃;
检测波长:280nm;
自动进样器温度:5℃;
进样量:2μL;
(2)流动相
流动相A’:取乙腈、甲醇、溶液A按照体积比3:4:93混和,抽滤,即得;
流动相B’:取乙腈、甲醇、溶液A按照体积比10:40:50混和,抽滤,即得;
其中,溶液A按照如下过程配制:取7.0g三羟甲基氨基甲烷,将其溶解于大约950mL的水中,测量溶液的温度,鉴于缓冲液对温度的依赖性,用体积浓度为20%(V/V)的冰醋酸溶液调节pH至8.0~8.3,再用水稀释至1000mL,混匀,即得溶液A。
(3)梯度系统(表1)
表1
注:表1中的“→”表示流动相含量的变化趋势,如“88→75”表示随着时间的延长,在7~21min内流动相A’的体积含量从88%变化至75%。
测得万古霉素B的相对保留时间约为19min,万古霉素杂质G的出峰时间为万古霉素B的出峰时间的0.9倍。
6、采用华谱新创科技有限公司的C18HCE填料(粒径10μm),将其装填至层析柱中,装填体积为50mm×250mm,然后对第一浓缩液进行柱层析分离,具体是将第一浓缩液分批,进行多次柱层析分离,每次柱层析分离时,加入至层析柱中的第一浓缩液的质量与层析柱中填料的装填体积之比为7g:1L,流动相包括浓度1%的乙酸铵溶液(流动相A)和乙腈(流动相B),从开始向层析柱中加入流动相进行柱层析算起,按照表2的时间调整流动相组成(梯度系统),分离过程中,通过HPLC检测产生的第二流出液中万古霉素杂质G的色谱纯度,收集分离过程中从层析柱流出的万古霉素杂质G的色谱纯度不低于99%的第二流出液,将每次柱层析分离得到的万古霉素杂质G的含量不低于99%的第二流出液合并,即得到第二富集液;
表2
注:表2中的“→”表示流动相含量的变化趋势,如“90→20”表示从0~45min,流动相A’的体积含量从90%逐渐减小至10%。
7、采用第一纳滤膜对第二富集液进行浓缩脱盐,浓缩至通过第二纳滤膜的废水的电导率不大于100μs/cm(纳滤设备内剩余浓缩液体积约68mL)后停止,得到第二浓缩液;
8、将第二浓缩液转入冻干机中下冻干,得到万古霉素G粉末约1.2g;
采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)仪(岛津LCMS-2020)对上述晶体进行分析,分析过程简述如下:
1、色谱条件
(1)色谱柱:ZORBAX Eclipse plus C18,4.6×100mm,3.5μm;
(2)流速:1.0mL/min;
(3)柱温:40℃;
(4)检测波长:280nm;
(5)流动相:
流动相C:0.1%甲酸溶液;
流动相D:乙腈
(6)不同时间段流动相组成(表3)
表3
2、质谱条件
(1)分析模式:扫描(正离子);
(2)接口温度:350℃;
(3)DL温度:250℃;
(4)加热块温度:200℃;
(5)雾化器流量:1.5L/min;
(6)干燥气流量:15L/min。
通过上述LC-MS分析,测得万古霉素G晶体的MS色谱图见图1、质谱图见图2(保留时间约为13.045),相关LC-MS测定数据见表4。
表4
从表2推导出的分子式和核磁轰击基团碎片,得到上述万古霉素杂质G晶体的分子结构式与欧盟药典EP10.4中给出的万古霉素杂质G的结构式是一致的,其结构式如下:
万古霉素杂质G的结构式
此外,通过HPLC分析,测得万古霉素结晶粉(水热反应前)的HPLC分析图谱见图3,水热反应后形成的混合液的HPLC分析图谱见图4,第一富集液的HPLC分析图谱见图5,第二富集液的HPLC分析图谱见图6。
从图3和图4可以看到,万古霉素经水热反应后,并未生成更多杂质,反而部分反应前的杂质减少或消失,同时,万古霉素杂质G的含量明显提高,实现万古霉素杂质G的批量生产;
从图5可以看出,经树脂吸附、洗脱液洗脱后,位移大于万古霉素杂质G峰处基本无峰,仅剩少量峰位移位于万古霉素杂质G前面的少量杂质,在后续的柱层析分离过程中,该些杂质会被挤压到在万古霉素杂质G流出之前从层析柱中流出,而在万古霉素杂质G流出之后基本无其他杂质峰干扰,从而可以提高第一浓缩液的上柱量,相较于常规万古霉素分离过程中0.1‰~1‰的上柱量(加入层析柱中的样品质量与填料体积比为0.1g~1g:1L),通过本发明的制备方法,可以将柱层析分离过程中的上柱量提高至7‰~7.5‰(加入层析柱中的样品质量与填料体积比为7g~7.5g:1L),显著提高制备效率;
从图6可以看出,经柱层析分离后,得到的第二富集液中的万古霉素杂质G纯度显著提高,由此,通过后续的第二纳滤膜浓缩脱盐、冷冻干燥等过程,可以获得纯度极高的万古霉素杂质G产品。
实施例2~实施例6
参照实施例1的过程,调整步骤1中体系的pH、以及步骤(2)中的水浴温度(即水热反应温度)、保温时间(即水热反应时间)等条件,并通过HPLC检测水热反应后形成的混合液中万古霉素杂质G的含量、万古霉素B的含量、以及杂质种类数量,具体见表5。除表5示出的区别外,其余条件与实施例1基本相同。
表5
从表3可以看到,实施例1~实施例7均能提高水热反应后的产物体系中万古霉素杂质G的含量,并控制降低的杂质种类数量,从而保证后续的分离纯化,提高整体制备效率。此外,进行水热反应的溶液的pH、以及水热反应温度、反应时间均会影响产物体系中万古霉素杂质G的含量和杂质种类数量,具体实施时,可以通过调控进行水热反应的溶液的pH、以及水热反应温度、反应时间等条件,进一步提高万古霉素杂质G的纯度及产率。
以上对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。