CN105755074A - 一种Nisin的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Nisin的提取方法，它包括Nisin A和Nisin Z。步骤主要包括浓缩上清液、DEAE-Sepharose FF柱层析、Sephacry1S-200HR柱层析、反相HPLC分离技术。本发明中提取的Nisin A和Nisin Z纯度高、回收率高。能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌。
Description
技术领域
本发明属于产乳酸菌代谢产物中的有效成分提取领域，具体涉及Nisin的提取物新方法，为抑制大量的腐败菌和致病菌提供参数，对今后的大规模工业化生产提供依据。
背景技术
细菌素可以抑制大量的腐败菌和致病菌，因此，近年来受到国内外广大学者的关注，其中乳酸菌细菌素因其安全性尤为受到关注。然而要使细菌素更好地应用到生物技术领域，而这又是建立在乳酸菌细菌素的纯化基础上。
Nisin是目前研究最深和最广泛的细菌素之一，由Hirsch于1951年首次单独发现，也是市场上唯一可见的细菌素。Nisin是乳酸乳球菌乳酸亚种(LactococusLactisSubsp.Laclis)某些菌株产生的一种小肽，亦称之为乳酸链球菌肽或乳酸链球菌素或称尼生素。早在1928年，Rgoers等就发现乳酸链球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。1944年Mattike等发现血清学N群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质，命名为N-ih-nibtioyrsubsnatee，即N群抑菌物质，简称为Nisin。Nisin是一种含34个氨基酸的小肽，分子质量约为3500u，分子式为H228N42O37S7。分子内不含芳香氨基酸，但含有Dha、Dhb、羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸。通过硫醚键形成5个内环，其活性分子常为二聚体或四聚体。Nisin的前体肽由57个氨基酸组成。其中N－端23个残基构成信号肽区；信号肽在细胞表面被信号肽酶水解去除后，释放成熟、有生物活性的Nisin。在自然状态下，Nisin分子有2种形式：NisinA和NisinZ。NisinA和NisinZ的差异仅在第27位氨基酸的种类不同，NisinA是组氨酸，而NisinZ是天门冬酰胺(如图1)。刘进国研究结果表明，在同样的浓度下，NisinZ的溶解度和抗菌能力比NisinA强。
在提取过程中，以NisinA和NisinZ的纯度和活性为主要指标。
乳酸菌细菌素应用到工业化生产的障碍主要归因于两个方面：a.细菌素在培养基中的产量很少；b.乳酸菌细菌素提纯费用高。复合培养基中本身含有的疏水性肽杂质的干扰，这就使乳酸菌细菌素的分离纯化需要一个复杂而又高耗费的过程，因此乳酸菌细菌素的分离纯化是目前急需解决的问题。关于乳酸菌细菌素的分离纯化，研究者们也相继进行了大量的研究。目前制约乳酸链球菌肽市场竞争力的主要因素是后提取成本太高。在使用成本上难于同化学防腐剂进行竞争。
Daba等报道了一种简便的乳酸链球菌肽分离纯化方法，该方法先将发酵液pH调至5.5，在该pH下部分乳酸链球菌肽吸附到菌体细胞上，然后使乳酸链球菌肽从菌体细胞上解析，然而实验结果仅仅使用菌体本身进行吸附和解析，吸附和解析效率都很低(其中吸附效率很难超过60％)，因此采用该方法乳酸链球菌肽总收率只有10％。
Stoffels采用HIC和离子交换树脂法提取乳酸链球菌肽，乳酸链球菌肽的纯度提高了60倍，回收率可达45％左右。
国内的乳酸链球菌肽后提取研究工作中，还连栋等先将乳酸链球菌肽发酵液高温灭活菌体后用硅藻土等吸附剂进行吸附，然后用聚乙二醇和氯化钠水溶液进行解吸，但该专利(公开号：1120845；公开日：2003年9月10日)没有报道解吸后如何去除表面活性剂聚乙二醇的方法。
乳酸菌细菌素的分离纯化在过去二十年已经完成了一个非常重要的阶段，但总结起来，目前，乳酸菌的分离纯化仍然需要进一步提高，首先，分离过程中尽量缩短时间和利用简单的工艺来保证乳酸菌细菌素的活性；其次，乳酸菌细菌素的收率和纯度尚不能同时达到要求。现在的实验室提取技术能保证纯度在80％～90％，本发明在实验室建立一种Nisin的提取方法，纯度可达到98％，回收率可达70％，并且具有很强的保持活性能力。对今后的大规模工业化生产提供依据。
发明内容
建立一种Nisin的提取方法，为抑制大量的腐败菌和致病菌提供参数，对今后的工业化生产提供依据。
本发明是通过以下途径实现的：
1.将LactococusLactisSubsp.Laclis接种到MRS肉汤培养基中，37℃摇瓶培养(200r/min)48h后，常温4000r/min离心30min，弃沉淀。上清液经Mini_Pellicon切向流超滤系统超滤浓缩后6000r/min离心取上清液，即得到粗提液。
2.DEAE-SepharoseFF柱层析：将粗提液用A缓冲液(20mmol/LpH6.8磷酸盐缓冲液)充分透析，8000r/min离心取上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱，用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱，并将收集的活性洗脱液经StirredCells8050超滤杯浓缩后，用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液充分透析。
3.SOURCE15PHE柱层析：将阴离子柱收集的活性组份上A缓冲液预平衡过的SOURCE15PHE柱，A缓冲液淋洗至基线，再用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱，最后用蒸馏水洗脱得到3个活性峰，收集合并后浓缩。
4.Sephacry1S-200HR柱层析：浓缩后的样品过含0.50mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacry1S-200HR柱，然后以同样的缓冲液洗脱，得到两个洗脱峰，收集活性峰样品浓缩，再经Milli-Q水充分透析。
5.反相HPLC分离：100％乙腈(0.1％TFA)平衡C18柱，将经分子筛后收集的活性组份上柱，用80％乙腈(0.1％TFA)进行线性梯度洗脱，收集到若干分子量在分子质量约为3500u的小肽，冷冻干燥后得到白色粉末状的固体。
本发明的有益效果是：
提取的NisinA和NisinZ纯度高、回收率高。能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌。
附图说明：
图1：Nisin的结构示意图(注：△Abu，β－甲基脱氢丙氨酸；△Ala，脱氢丙氨酸；D－Alas－S－Alas，羊毛硫氨酸；D－Abu－S－Alas，β－甲基羊毛硫氨酸)
具体实施方式：
实施例1：一种Nisin的获得方法
1将LactococusLactisSubsp.Laclis接种到MRS肉汤培养基中，37℃摇瓶培养(200r/min)48h后，常温4000r/min离心30min，弃沉淀。上清液经Mini_Pellicon切向流超滤系统超滤浓缩后6000r/min离心取上清液，即得到粗提液。
2DEAE-SepharoseFF柱层析：将粗提液用A缓冲液(20mmol/LpH6.8磷酸盐缓冲液)充分透析，8000r/min离心取上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱，用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱，并将收集的活性洗脱液经StirredCells8050超滤杯浓缩后，用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液充分透析。
3SOURCE15PHE柱层析：将阴离子柱收集的活性组份上A缓冲液预平衡过的SOURCE15PHE柱，A缓冲液淋洗至基线，再用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱，最后用蒸馏水洗脱得到3个活性峰，收集合并后浓缩。
4Sephacry1S-200HR柱层析：浓缩后的样品过含0.50mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacry1S-200HR柱，然后以同样的缓冲液洗脱，得到两个洗脱峰，收集活性峰样品浓缩，再经Milli-Q水充分透析。
5反相HPLC分离：100％乙腈(0.1％TFA)平衡C18柱，将经分子筛后收集的活性组份上柱，用80％乙腈(0.1％TFA)进行线性梯度洗脱，收集到若干分子量在分子质量约为3500u的小肽，冷冻干燥后得到白色粉末状的固体。
实施例2：Nisin分子量的测定
用MALDI-TOF质谱法进行Nisin分子量精确地测定，两种主要成分NisinA和NisinZ均为单一组份，分子量在3500u左右，纯度达98％(现在的实验室提取技术能保证纯度在80％～90％)。
实施例3：Nisin抑菌活性
管碟法测定粗提液对不同检测菌的抑菌活性：牛津杯内加入粗提液200μL,以抑菌圈直径表示抑菌活性的大小。
管碟法试验结果表明NisinA和NisinZ对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌都有抑制作用。
平均值±标准差mm
| 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | 沙门杆菌 | |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 |
| Nisin A | 31.64±1.03 | 22.60±0.70 | 29.67±0.48 |
| Nisin Z | 34.75±2.39 | 24.87±1.51 | 31.49±0.56 |
注：对照组为灭菌水。
实施例4：粗提液的稳定性
粗提液稳定性的测定
4.1热稳定性：将粗提液分别经108℃、115℃和121℃高压灭菌处理，以经孔径为0.22um的微孔滤膜过滤的样品作为对照，用管碟法测抑菌活性，对照的抑菌活性基本无变化。平均值±标准差mm
4.2pH稳定性：通过直接调节粗提液的pH值考察环境酸碱度对抗菌物抑菌活性的影响，以未经酸碱调节的粗提液(pH为7.0)作为对照，其抑菌活性基本无变化。
平均值±标准差mm
4.3蛋白酶稳定性：37℃水溶条件下，用反应浓度均为1mg/mL的蛋白酶K和胰蛋白酶处理粗提液不同时间，测酶处理液的抑菌活性，以不加酶处理的粗提液作为对照组，抑菌活性降低不明显。
平均值±标准差mm
结果：粗提液经108℃、115℃和121℃分别处理10min，其抑菌活性均没有降低，即使121℃处理120min后抑菌活性也仅下降25％；由此表明粗提液中的抗菌物具有较好的热稳定性；对不同酸碱度的试验表明抗菌物的最适pH范围是6.0～7.5，当pH<5.5或者pH>9.0时抑菌活性有明显的降低；粗提液用两种蛋白酶处理不同时间后，抑菌活性降低不明显，说明粗提液对蛋白酶K、胰蛋白酶具有一定的耐受性。
Claims (1)
1.一种Nisin的提取方法，其特征是，所述Nisin的提取步骤为：
(1)将LactococusLactisSubsp.Laclis接种到MRS肉汤培养基中，37℃摇瓶培养(200r/min)48h后，常温4000r/min离心30min，弃沉淀，上清液经Mini_Pellicon切向流超滤系统超滤浓缩后6000r/min离心取上清液，即得到粗提液；
(2)DEAE-SepharoseFF柱层析：将粗提液用A缓冲液(20mmol/LpH6.8磷酸盐缓冲液)充分透析，8000r/min离心取上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱，用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱，并将收集的活性洗脱液经StirredCells8050超滤杯浓缩后，用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液充分透析；
(3)SOURCE15PHE柱层析：将阴离子柱收集的活性组份上A缓冲液预平衡过的SOURCE15PHE柱，A缓冲液淋洗至基线，再用含1.00mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液进行线性梯度洗脱，最后用蒸馏水洗脱得到3个活性峰，收集合并后浓缩；
(4)Sephacry1S-200HR柱层析：浓缩后的样品过含0.50mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacry1S-200HR柱，然后以同样的缓冲液洗脱，得到两个洗脱峰，收集活性峰样品浓缩，再经Milli-Q水充分透析；
(5)反相HPLC分离：100％乙腈(0.1％TFA)平衡C18柱，将经分子筛后收集的活性组份上柱，用80％乙腈(0.1％TFA)进行线性梯度洗脱，收集到若干分子量在分子质量约为3500u的小肽，冷冻干燥后得到白色粉末状的固体。
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|---|---|---|---|---|
| CN108374033A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-08-07 | 钟文文 | 一种乳酸链球菌素的提取方法 |
| CN109265524A (zh) * | 2018-09-10 | 2019-01-25 | 苏州汉德瑞生物工程有限公司 | 一种基于树脂吸附法分离乳酸链球菌素的方法 |
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