CN106220715A

CN106220715A - 一种博来霉素的制备方法

Info

Publication number: CN106220715A
Application number: CN201610880903.2A
Authority: CN
Inventors: 李敏; 谢新宇; 王晶珂; 张雪霞; 李梅; 邓佩佩; 郑学丽; 段宝玲
Original assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Current assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Priority date: 2016-10-10
Filing date: 2016-10-10
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2036-10-10
Also published as: CN106220715B

Abstract

本发明公开了一种博来霉素的制备方法。该方法包括将博来霉素发酵液滤液经大孔吸附树脂粗纯，经C18反相层析柱同步精纯与脱铜，再经大孔吸附树脂脱盐，得到纯度大于90%的博来霉素硫酸盐或盐酸盐。该方法采用精纯与脱铜为一体的C18反相层析精制工艺，制备所得博来霉素质量符合美国药典相关标准，总收率大于50%，且整个制备过程使用有机溶剂较少，安全环保,工艺简单易行，适用于大规模工业化生产。

Description

一种博来霉素的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种博来霉素的制备方法。

背景技术

博来霉素（Bleomycin，BLM）是20世纪60年代从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)发酵产物中发现的具有抗肿瘤活性的多组分糖肽类抗生素，它是一个由十余种组份组成的混合物，根据纸层析R_f值不同分为A、B两族，再分别进行CM-Sephadex-C25柱层析得到A₁、 A₂、 A₃、A₄、A₅、A₆和B₁、B₂、B₃、B₄、B₅、B₆，各组分区别在于末端氨基的不同。博来霉素结构式如下式所示。

A₂末端氨基R为-NH-CH₂-CH₂-CH₂-S⁺-(CH₃)₂

B₂末端氨基R为-NH-(CH₂)₄-NH-C(NH)-NH₂

以BLM A₂和B₂为主要成分的商品药Blonexane作为一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上与其它试剂联合广泛应用于治疗睾丸癌、霍奇金淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞瘤和其它肿瘤。博来霉素族抗生素在临床应用的突出特点是在治疗过程中没有常用抗癌药物所引起的白细胞减少,也不抑制机体的免疫功能。另外，研究证明博来霉素能有效抑制G+菌和G-菌, 对金葡球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、腊样芽孢杆菌、绿脓杆菌、枯草杆菌、草分枝杆菌等均具有较强的抗菌作用。

有关博来霉素及其同族化合物制备方法的报道较多的是利用博来霉素在水溶液中能解离成阳离子的特性，用弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂进行分离，再上大孔吸附树脂脱盐，浓缩干燥得到博来霉素铜盐粗粉，粗粉上葡聚糖凝胶柱进行层析精制，再采用双硫腙或是H₂S进行脱铜，反复用丙酮沉淀，真空干燥得到博来霉素精粉。

由于在发酵培养基中得到的博来霉素是含铜的复合物，而临床应用的则是去金属化合物，这样可以降低注射部位的疼痛感，所以博来霉素及其同族化合物的制备方法基本都是采用先纯化后脱铜的精制方式，需经过纯化与脱铜两个操作步骤，工艺较为繁琐。另外由于博来霉素及其同族化合物与铜的螯合物为极性很大的水溶性成分，分离纯化有相当的难度，成为制约最终产品质量的瓶颈。

博来霉素作为注射剂原料药，纯度影响到产品的最终质量，直接关系到临床用药的安全性，如何突破传统工艺，开发博来霉素高效且适于工业化生产的分离纯化工艺成为当前十分迫切的需要。

发明内容

本发明提供了一种高纯度、低成本、适于工业化生产的博来霉素制备的新工艺。制备得到的博来霉素以硫酸盐或盐酸盐形式存在，A₂+B₂组分含量大于90%，符合美国药典相关标准，总收率大于50%，而且生产成本低，安全环保，适合大规模化工业生产。

下面对本发明进行具体描述：

本发明的方法包括如下步骤：博来霉素发酵液滤液经大孔吸附树脂粗纯，经C18反相层析柱同步精纯与脱铜，再经大孔吸附树脂脱盐，得到博来霉素。该方法采用精纯与脱铜为一体的C18反相层析精制工艺，不仅实现了连续制备，将制备流程由普通工艺的48小时缩短为12小时；且整个制备过程使用有机溶剂较少，安全环保，工艺简单易行，适用于大规模工业化生产；制备得到的博来霉素以硫酸盐或盐酸盐形式存在，A₂+B₂组分含量大于90%，符合美国药典相关标准，总收率大于50%。

具体地，本发明涉及一种高纯度博来霉素的制备方法，包括以下步骤：

1）博来霉素发酵液用酸调节pH值至2.0～2.5，加入助滤剂搅拌均匀，过滤得到博来霉素滤液；

2）博来霉素滤液用碱溶液调节pH值至6.0～6.5，通过大孔吸附树脂进行吸附，用甲醇-硫酸水溶液或甲醇-盐酸水溶液进行解吸，经HPLC检测收集解吸液；

3）解吸液同上法再进行1次大孔吸附树脂吸附，用甲醇水溶液进行解吸，解吸液浓缩至干，用甲醇溶解过滤，得到醇沉液；

4）醇沉液减压浓缩，通过C18反相层析柱进行精制与脱铜，用含EDTA-2Na的甲醇缓冲液作为洗脱剂进行洗脱，收集层析液，浓缩除去溶剂，得到纯化液；

5）纯化液上大孔吸附树脂进行脱盐，用甲醇水溶液进行解吸，HPLC检测收集解吸液，浓缩冻干，得到博来霉素。

其中步骤1）中调节pH值所用的酸为草酸或冰乙酸中的任意一种，优选为草酸，博来霉素发酵液pH值调至2.0～2.5，一方面有利于发酵液过滤，另一方面有利于絮凝沉淀杂质。

步骤1）中所用助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为珍珠岩，用量为每升发酵菌丝体转化液中加入助滤剂0.03～0.05千克。

步骤2）中调节pH所用的碱溶液为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液中的任意一种，优选浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液。

步骤2）、3）、5）中所用大孔吸附树脂为LX-18、700F、HZ818、HZ803或LX-20B树脂中的任意一种，优选为700F树脂，步骤2）中树脂用量为每升博来霉素滤液使用树脂0.06～0.12升，步骤3）中解吸液过滤后再次进行大孔吸附树脂吸附时，每升上柱液使用树脂0.03～0.05升。大孔吸附树脂上柱流速为1.5BV/h，解吸流速为0.5BV/h。步骤3）与步骤5）可使用同一根大孔吸附树脂柱。

步骤2）中的甲醇-硫酸水溶液或甲醇-盐酸水溶液中甲醇体积含量为10～20%，硫酸或盐酸浓度为0.03～0.05mol/L。

步骤3）、5）中的甲醇水溶液中的甲醇体积含量为50%～80%。

步骤3）在大孔树脂吸附完成后，用10倍柱体积的去离子水洗柱可洗去盐分和大量色素杂质。

步骤4）中醇沉液减压浓缩至15～25mg/mL，优选20mg/mL。

步骤4）中C18反相层析柱填料为C18ME或C18TDE中的任意一种。

步骤4）中的洗脱剂中EDTA-2Na浓度为1.4～1.6g/L、甲醇体积含量为10%～30%，乙酸的体积含量为0.3～0.5%，氨水调pH4.0～4.5，其中EDTA-2Na浓度优选为1.5g/L，甲醇体积含量优选为15%。

本发明所得博来霉素为盐酸盐或硫酸盐，可作为博来霉素制剂原料或是肿瘤早期诊断试剂盒原料使用。本发明制得的博来霉素精粉A2+B2组分含量90%以上，总的提取收率大于50%。

本发明的博来霉素的制备方法具有如下优点：1、制备过程中大孔吸附树脂的应用，避免了利用离子交换树脂交换量低，树脂使用量大，树脂处理再生困难、使用寿命短的不利因素，同时解吸过程在富集单位的同时除去了大量杂质，提高了主峰纯度。2、利用高压反向层析，洗脱液中加入金属螯合物实现了精纯和脱铜为一体的精制工艺。3、工艺简单，产品纯度高，全程总收率达到50%以上，适用于工业化生产。

附图说明

附图1：BLM精粉HPLC检测图谱。

具体实施方式

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。除非特别说明，实施例中所述百分比均为体积百分比。博来霉素发酵液可采用任何现有技术制得（如闫丽，中国农业科学院硕士学位论文《博莱霉素发酵培养基及发酵条件优化研究》），本发明所使用的博来霉素发酵液均为华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供，所用设备及试剂均为市售产品。

大孔吸附树脂：HZ803、HZ818、700F，上海华震科技有限公司；LX-18，LX-20B,西安蓝晓科技新材料股份有限公司

C18反向层析填料：C18ME、C18TDE，华谱科仪科技有限公司

博来霉素进行HPLC检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（长：250mm，内径：4.6mm，填料粒径：5µm）；流动相：A相：0.96克己烷磺酸钠+1.86克EDTA-2Na+4mL乙酸溶于1L水中，氨水调pH4.3；B相：甲醇：乙腈=7:3；检测器：UV检测器；检测波长：291nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10µL。

实施例1

博来霉素发酵液300L，草酸调节pH值为2.0，加入珍珠岩9Kg，搅拌均匀，过滤得到的滤液使用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.0，体积为245L。滤液通过径高比1：6的吸附树脂700F柱吸附，树脂装量15L，上柱流速为22.5L/h，上柱完毕，先用纯化水洗涤吸附树脂柱上的杂质，然后用20%甲醇（含0.03M硫酸）解吸，解吸流速7.5L/h，HPLC检测，合并解吸液，用10mol/L氢氧化钠溶液调节解吸液pH值为6.5，过滤除去不溶物，得到滤液60L。滤液通过径高比1：4的层析树脂700F柱二次富集、脱盐，树脂装量1.8L，上柱流速为2.7L/h。上柱完毕后，先使用10倍柱体积水洗涤树脂柱，后用70%甲醇水溶液洗脱，流速为1.35L/h，HPLC检测，收集脱盐解吸液，解吸液浓缩至干，约2L甲醇溶解，过滤除去沉淀物，醇沉液浓缩至约300mL，上DAC-HB80（装填介质为C18ME）柱吸附，使用洗脱液等度洗脱（洗脱液配比为：EDTA-2Na浓度为1.4g/L、甲醇体积含量20%，乙酸的体积含量为0.3%，氨水调pH至4.2），洗脱流速为200mL/min，HPLC检测，收集洗脱液，浓缩除去溶剂后得到纯化液。纯化液上径高比为1：4的吸附树脂700F吸附，树脂装量1.8L，吸附完毕10倍柱体积水洗涤树脂柱，再用70%甲醇溶液洗脱，流速为0.9L/h，收集脱盐纯化液，浓缩除去溶剂后，冻干，得到博来霉素硫酸盐精粉24.3克，A2+B2纯度为93.1%，HPLC检测图谱见附图1，总收率54.2%。

实施例2

博来霉素发酵液280L，草酸调节pH值为2.2，加入珍珠岩9kg，搅拌均匀，过滤得到的滤液使用9mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.0，体积为230L。滤液通过径高比1：6的吸附树脂LX-20B柱吸附，树脂装量25L，上柱流速为37.5L/h，上柱完毕，先用纯化水洗涤吸附树脂柱上的杂质，然后用10%甲醇（含0.05M硫酸）解吸，解吸流速18.75L/h，HPLC检测，合并解吸液，用10mol/L氢氧化钠溶液调节解吸液pH值为6.3，过滤除去不溶物，得到滤液80L。滤液通过径高比1：4的层析树脂700F柱二次富集、脱盐，树脂装量4L，上柱流速为6L/h。上柱完毕后，先使用10倍柱体积水洗涤树脂柱，后用60%甲醇溶液洗脱，流速为2L/h，HPLC检测，收集脱盐解吸液，解吸液浓缩至干，约2L甲醇溶解，过滤除去沉淀物，醇沉液浓缩至约280mL，上DAC-HB80（装填介质为C18ME）柱吸附，使用洗脱液等度洗脱（洗脱液配比为：EDTA-2Na浓度为1.5g/L、甲醇体积含量15%，乙酸的体积含量为0.3%，氨水调pH至4.0），洗脱流速为200mL/min，HPLC检测，收集洗脱液，浓缩除去溶剂后得到纯化液。纯化液上径高比为1：4的吸附树脂700F柱吸附，树脂装量4L，吸附完毕10倍柱体积水洗涤树脂柱，再用60%甲醇溶液洗脱，流速为2L/h，收集脱盐纯化液，浓缩除去溶剂后，冻干，得到博来霉素硫酸盐精粉22.1克，A2+B2纯度为91.8%，总收率53%。

实施例3

博来霉素发酵液300L，冰乙酸调节pH值为2.0，加入硅藻土10Kg，搅拌均匀，过滤得到的滤液使用11mol/L碳酸钠溶液调节pH值为6.0，体积为280L。滤液通过径高比1：6的吸附树脂HZ818柱吸附，树脂装量20L，上柱流速为30L/h，上柱完毕，先用纯化水洗涤吸附树脂柱上的杂质，然后用10%甲醇（含0.05M硫酸）解吸，解吸流速12L/h，HPLC检测，合并解吸液，用10mol/L碳酸钠溶液调节解吸液pH值为6.2，过滤除去不溶物，得到滤液78L。滤液通过径高比1：4的层析树脂HZ818柱二次富集、脱盐，树脂装量2.4L，上柱流速为3.6L/h。上柱完毕后，先使用10倍柱体积水洗涤树脂柱，后用80%甲醇溶液洗脱，流速为1.2L/h，HPLC检测，收集脱盐解吸液，解吸液浓缩至干，约2L甲醇溶解，过滤除去沉淀物，醇沉液浓缩至约280mL，上DAC-HB80（装填介质为C18ME）柱吸附，使用洗脱液等度洗脱（洗脱液配比为：EDTA-2Na浓度为1.6g/L、甲醇体积含量10%，乙酸的体积含量为0.4%，氨水调pH至4.2），洗脱流速为200mL/min，HPLC检测，收集洗脱液，浓缩除去溶剂后得到纯化液。纯化液上径高比为1：4的吸附树脂HZ818柱吸附，树脂装量2.4L，吸附完毕10倍柱体积水洗涤树脂柱，再用80%甲醇溶液洗脱，流速为1.2L/h，收集脱盐纯化液，浓缩除去溶剂后，冻干，得到博来霉素硫酸盐精粉23.5克，A2+B2纯度为91.5%，总收率54%。

实施例4

博来霉素发酵液250L，冰乙酸调节pH值为2.5，加入硅藻土10Kg，搅拌均匀，过滤得到的滤液使用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.4，体积为210L。滤液通过径高比1：6的吸附树脂HZ803柱吸附，树脂装量18L，上柱流速为27L/h，上柱完毕，先用纯化水洗涤吸附树脂柱上的杂质，然后用20%甲醇（含0.03M盐酸）解吸，解吸流速9L/h，HPLC检测，合并解吸液，用10mol/L氢氧化钠溶液调节解吸液pH值为6.5，过滤除去不溶物，得到滤液60L。滤液通过径高比1：4的层析树脂HZ803柱二次富集、脱盐，树脂装量1.8L，上柱流速为2.7L/h。上柱完毕后，先使用10倍柱体积水洗涤树脂柱，后用70%甲醇溶液洗脱，流速为0.9L/h，HPLC检测，收集脱盐解吸液，解吸液浓缩至干，约2L甲醇溶解，过滤除去沉淀物，醇沉液浓缩至约300mL，上DAC-HB80（装填介质为C18TDE）柱吸附，使用洗脱液等度洗脱（洗脱液配比为：EDTA-2Na浓度为1.5g/L、甲醇体积含量30%，乙酸的体积含量为0.5%，氨水调pH至4.5），洗脱流速为200mL/min，HPLC检测，收集洗脱液，浓缩除去溶剂后得到纯化液。纯化液上径高比为1：4的吸附树脂HZ803柱吸附，树脂装量1.8L，吸附完毕10倍柱体积水洗涤树脂柱，再用70%甲醇溶液洗脱，流速为0.9L/h，收集脱盐纯化液，浓缩除去溶剂后，冻干，得到博来霉素盐酸盐精粉21.8克，A2+B2纯度为93.1%，总收率52.8%。

实施例5

博来霉素发酵液300L，草酸调节pH值为2.3，加入珍珠岩15Kg，搅拌均匀，过滤得到的滤液使用10mol/L碳酸钠溶液调节pH值为6.0，体积为260L。滤液通过径高比1：6的吸附树脂LX-18柱吸附，树脂装量22L，上柱流速为33L/h，上柱完毕，先用纯化水洗涤吸附树脂柱上的杂质，然后用10%甲醇（含0.05M盐酸）解吸，解吸流速11L/h，HPLC检测，合并解吸液，用10mol/L氢氧化钠溶液调节解吸液pH值为6.3，过滤除去不溶物，得到滤液80L。滤液通过径高比1：4的层析树脂700F柱二次富集、脱盐，树脂装量2.4L，上柱流速为3.6L/h。上柱完毕后，先使用10倍柱体积水洗涤树脂柱，后用75%甲醇溶液洗脱，流速为1.2L/h，HPLC检测，收集脱盐解吸液，解吸液浓缩至干，约2L甲醇溶解，过滤除去沉淀物，醇沉液浓缩至约300mL，上DAC-HB80（装填介质为C18ME）柱吸附，使用洗脱液等度洗脱（洗脱液配比为：EDTA-2Na浓度为1.5g/L、甲醇体积含量20%，乙酸的体积含量为0.5%，氨水调pH至4.0），洗脱流速为200mL/min，HPLC检测，收集洗脱液，浓缩除去溶剂后得到纯化液。纯化液上径高比为1：4的吸附树脂700F柱吸附，树脂装量2.4L，吸附完毕10倍柱体积水洗涤树脂柱，再用75%甲醇溶液洗脱，流速为1L/h，收集脱盐纯化液，浓缩除去溶剂后，冻干，得到博来霉素盐酸盐精粉23.9克，A2+B2纯度为93%，总收率54%。

实施例6

博来霉素发酵液260L，冰乙酸调节pH值为2.0，加入硅藻土12Kg，搅拌均匀，过滤得到的滤液使用10mol/L碳酸钠溶液调节pH值为6.0，体积为220L。滤液通过径高比1：6的吸附树脂700F柱吸附，树脂装量20L，上柱流速为20L/h，上柱完毕，先用纯化水洗涤吸附树脂柱上的杂质，然后用20%甲醇（含0.04M盐酸）解吸，解吸流速10L/h，HPLC检测，合并解吸液，用10mol/L碳酸钠溶液调节解吸液pH值为6.5，过滤除去不溶物，得到滤液80L。滤液通过径高比1：4的层析树脂LX-18柱二次富集、脱盐，树脂装量2.4L，上柱流速为3.6L/h。上柱完毕后，先使用10倍柱体积水洗涤树脂柱，后用65%甲醇溶液洗脱，流速为1.8L/h，HPLC检测，收集脱盐解吸液，解吸液浓缩至干，约2L甲醇溶解，过滤除去沉淀物，醇沉液浓缩至约230mL，上DAC-HB80（装填介质为C18TDE）柱吸附，使用洗脱液等度洗脱（洗脱液配比为：EDTA-2Na浓度为1.4g/L、甲醇体积含量25%，乙酸的体积含量为0.5%，氨水调pH至4.3），洗脱流速为200mL/min，HPLC检测，收集洗脱液，浓缩除去溶剂后得到纯化液。纯化液上径高比为1：4的吸附树脂LX-18柱吸附，树脂装量2.4L，吸附完毕10倍柱体积水洗涤树脂柱，再用65%甲醇溶液洗脱，流速为1.2L/h，收集脱盐纯化液，浓缩除去溶剂后，冻干，得到博来霉素盐酸盐精粉21.7克，A2+B2纯度为92.3%，总收率53.2%。

Claims

1.一种博来霉素的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

博来霉素发酵液滤液经大孔吸附树脂粗纯，经C18反相层析柱同步精纯与脱铜，再经大孔吸附树脂脱盐，得到博来霉素。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

4）醇沉液减压浓缩，通过C18反相层析柱进行精制与脱铜，用含EDTA-2Na的甲醇缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集层析液，浓缩除去溶剂，得到纯化液；

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤1）中调节pH所用的酸，为草酸或冰乙酸中的任意一种；所用助滤剂为珍珠岩或硅藻土，用量为每升发酵液加入助滤剂0.03～0.05千克。

4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤2）中调节pH所用的碱溶液为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液中的任意一种。

5.根据权利要求2所述的方法，其中步骤2）、3)、5）中所用大孔吸附树脂为LX-18、700F、HZ818、HZ803或LX-20B树脂中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2）中的甲醇-硫酸水溶液或甲醇-盐酸

水溶液中甲醇体积含量为10～20%，硫酸或盐酸浓度为0.03～0.05mol/L。

7.根据权利要求2所述的方法，其中步骤3）、5）中的甲醇水溶液的甲醇体积含量为50%～80%。

8.根据权利要求2所述的方法，其中步骤4）中C18反相层析柱填料为C18ME

或C18TDE中的任意一种。

9.根据权利要求2所述的方法，其中步骤4）的洗脱液中EDTA-2Na浓度为1.4～1.6g/L、甲醇体积含量为10%～30%，乙酸的体积含量为0.3～0.5%，氨水调pH至4.0～4.5；其中EDTA-2Na浓度优选为1.5g/L，甲醇体积含量优选为15%。

10.根据权利要求2所述的方法，其中步骤5）得到的博来霉素为硫酸盐或盐酸盐形式。