CN116478265B - 一种衍生自猪肝脏抗菌肽tjh及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种衍生自猪肝脏的抗菌肽TJH及其制备方法和应用，属于农业畜牧兽医应用领域，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。通过截取猪肝脏抗菌肽LEAP‑2氨基末端的23个氨基酸，得到一条多肽；将带负电氨基酸Asp和Glu均替换为疏水性氨基酸Leu，使其净正电荷含量为6、疏水值为0.519，最后，将C端酰胺化，N端乙酰化，进一步提高净正电荷和稳定性，得到净正电荷含量为7、疏水性为0.519的第二条多肽，命名为抗菌肽TJH。本发明的抗菌肽TJH对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有高效的杀菌作用，而且具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，使其具备成为抗生素替代物的发展潜力。
Description
技术领域
本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种衍生自猪肝脏抗菌肽TJH及其制备方法和应用。
背景技术
畜禽饲料中添加饲用抗生素能够提高动物肠道对营养物质的吸收和利用、改善肠道菌群丰富度、提高动物对病原微生物的免疫力。因此，抗生素作为饲料添加剂被广泛应用到畜禽养殖中。然而，随着全球耐药菌感染病例的持续上升，新一代抗菌药物的研发已迫在眉睫。抗菌肽是一种天然的小分子多肽，具有来源广泛和安全性高等特点，广泛存在于动植物和微生物体内，并因其独特的细胞膜作用机制而不易产生耐药性。抗菌肽不仅具有抗菌活性，而且对病毒、寄生虫、肿瘤等均有杀伤作用。因此，抗菌肽已成为生物领域的研究热点，尤其在畜牧兽医领域具有极为广阔的市场应用前景。故研究一种安全、高效的抗菌肽来代替饲用抗生素已经迫在眉睫。现有的猪肝脏表达的抗菌肽LEAP-2，其肽链长度较长，杀菌活性较差，不利于作为抗菌药物使用。
发明内容
基于以上问题，本发明的目的在于公开一种衍生自猪肝脏抗菌肽TJH，将具有77个氨基酸长度的衍生自猪肝脏抗菌肽LEAP-2通过截取和替代的方法简化，并保留其活性中心，增加抗菌肽的杀菌活性，使其具备成为抗生素替代物的潜力。
本发明的目的是这样实现的：一种衍生自猪肝脏抗菌肽TJH，其氨基酸序列如SEQID No.1所示，其C端乙酰化，N端酰胺化。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种衍生自猪肝脏抗菌肽TJH的制备方法，如下：通过截取猪肝脏抗菌肽LEAP-2氨基末端的23个氨基酸，得到含有2个净正电荷、疏水值为0.100的一条多肽，其氨基酸序列为：RDDSECLTRLCRKRRCSLSVAQE；然后将该条多肽的带负电氨基酸Asp和Glu均替换为疏水性氨基酸Leu，以提高疏水性和净正电荷，得到第二条多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其净正电荷含量为6、疏水值为0.519，最后，将所述的第二条多肽的C端酰胺化，N端乙酰化，进一步提高净正电荷和稳定性，其净正电荷含量为7、疏水性为0.519，然后采用固相化学合成法和反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成第二条多肽的制备；再经过杀菌活性的测定、溶血活性的测定、真核细胞毒性的测定，最终将第二条多肽命名为抗菌肽TJH。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种衍生自猪肝脏表达抗菌肽TJH在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。
进一步的，如上所述的应用，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌。
进一步的，如上所述的应用，所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。
本发明的有益效果及优点如下：本发明对抗菌肽TJH进行生物学活性检测，发现其不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等6种菌种有高效的杀灭作用，而且具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在128μM浓度下造成1.25％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，在64μM浓度下小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到了90.83％，其已具备成为饲用抗生素替代物的发展潜力。
附图说明
图1为本发明的抗菌肽TJH的高效液相色谱图。
图2为本发明的抗菌肽TJH的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱图。
图3为本发明的抗菌肽TJH的杀菌活性图。
图4为本发明的抗菌肽TJH和蜂毒素ME的溶血活性图。
图5为本发明的抗菌肽TJH和蜂毒素ME的细胞毒性图。
具体实施方式
下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明:
实施例1
抗菌肽的设计
猪肝脏表达抗菌肽LEAP-2的氨基酸序列为：
MWHLKLFAVLVICLLLAVQVHGSPIPELSSAKRRPRRMTPFWRAVSLRPIGASCRDDSECLTRLCRKRRCSLSVAQE；
通过截取猪肝脏抗菌肽LEAP-2的氨基末端的23个氨基酸，得到含有2个净正电荷，疏水值为0.100的抗菌肽。
获得的一条多肽，其氨基酸序列为：
RDDSECLTRLCRKRRCSLSVAQE
将带负电氨基酸Asp和Glu替换为疏水性氨基酸Leu以提高疏水性和净正电荷，得到第二条多肽，其净正电荷含量为6个，疏水值为0.519，其氨基酸序列为：
RLLSLCLTRLCRKRRCSLSVAQL
最后，将第二条多肽的N端酰胺化，C端乙酰化以进一步提高净正电荷和稳定性，得到净电荷含量为7，疏水性为0.519的抗菌肽TJH。抗菌肽TJH的序列如表1所示。
表1抗菌肽TJH的氨基酸序列。
实施例2：
固相化学合成法合成抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2M的硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3
1、杀菌活性的测定：以PBS为稀释液，将12.5μl的浓度为16μM的抗菌肽加入到987.5μl的PBS中，取上述溶液100μl置于1.5ml EP管内，然后添加等体积的待测菌液，孵育2h。随后，取10μl孵育完成的菌液加入990μl的PBS，震荡后取10μl稀释液均匀涂布在固体培养基MHA上。阳性对照组为未经过抗菌肽处理的细菌样品。37℃恒温培养12-18h，计算细菌存活率。通过图3可以看出，TJH对革兰氏阴性菌(E.coli 25922、E.coli UB1005和E.coliK99)和革兰氏阳性菌(S.aureus 29213、S.aureus 12228和S.aureus 43300)均表现出较高的杀菌活性。
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mL PBS溶液中，3000rpm离心10min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；孵育结束后取出，4℃、3000rpm下离心10min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值。其中50μL红细胞加50μL PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度，检测结果见图4。通过图4可以看出，抗菌肽TJH在检测范围内未表现出溶血活性，该抗菌肽在128μM浓度下造成1.25％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，与对照组蜂毒素ME呈显著性差异。
3、真核细胞毒性的测定：采用MTT法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。
(1)培养基的准备及细胞的培养：将DMEM(培养基)与胎牛血清按9:1混合配置完全培养基，并复苏液氮中的小鼠巨噬细胞RAW264.7，以细胞长满瓶底80％-90％为宜。
(2)待测细胞的处理：无菌PBS清洗并重悬细胞3次，并用0.25％胰蛋白酶溶液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入终浓度约为2×104的50μL细胞悬液。
(3)抗菌肽处理：96孔板第一孔内加入10μL抗菌肽并倍比稀释，96孔板1-10孔内加入50μL稀释后的细胞悬液，第11孔加50μL完全培养基，第12孔加100μL完全培养基。恒温培养4h；
(4)毒性检测：取50μL 5mg/mL MTT溶液加入96孔板，继续培养3-4h后，加入150μLDMSO，酶标仪OD570nm处测定吸光度，检测结果见图5。通过图5可以看出，抗菌肽TJH在检测范围内未表现出对小鼠巨噬细胞RAW264.7的毒性，与对照组蜂毒素ME呈现显著性差异。
Claims (3)
1.一种衍生自猪肝脏抗菌肽TJH，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其C端酰胺化，N端乙酰化。
2.根据权利要求1所述的一种衍生自猪肝脏抗菌肽TJH的制备方法，其特征在于，方法如下：通过截取猪肝脏抗菌肽LEAP-2氨基末端的23个氨基酸，得到含有2个净正电荷、疏水值为0.100的一条多肽，其氨基酸序列为：RDDSECLTRLCRKRRCSLSVAQE；然后将该条多肽的带负电氨基酸Asp和Glu均替换为疏水性氨基酸Leu，以提高疏水性和净正电荷，得到第二条多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其净正电荷含量为6、疏水值为0.519，最后，将所述的第二条多肽的C端酰胺化，N端乙酰化，进一步提高净正电荷和稳定性，其净正电荷含量为7、疏水性为0.519，然后采用固相化学合成法和反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成第二条多肽的制备；再经过杀菌活性的测定、溶血活性的测定、真核细胞毒性的测定，最终将第二条多肽命名为抗菌肽TJH。
3.根据权利要求1所述的一种衍生自猪肝脏抗菌肽TJH在制备治疗大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌感染性的疾病的药物中的应用。
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