CN111647044A - 一种富含苯丙氨酸抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK及其制备方法和应用。抗菌肽的序列如SEQ ID No.1所示。制备方法：选择氨基酸Phe和Arg交替排列，保证其发挥抗菌功能所需要的的疏水性，用Glu和Lys替代Arg，使肽在与细胞膜作用时，利用肽之间的吸引能力增加其聚集浓度，并保证与细菌细胞膜吸引所需要的一定的正电荷数，设计出该抗菌肽。该抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。通过本制备方法技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测发现对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等革兰氏阴性菌株具有较强抗菌活性，且在128μM都未产生溶血，有较高的治疗指数。

Description

一种富含苯丙氨酸抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本项发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK及其制备方法和应用
背景技术
在畜牧业中，由于传统抗生素的长期使用和滥用，细菌耐药性问题和药物残留问题严重害畜产品质量和人类身体健康，使其成为不可忽视的问题。因此，迫切需要开发新型抗菌药物来解决此问题。而抗菌肽是植物、动物、昆虫等生物体内的一类生物活性小分子，在先天防御机制中起着重要作用，与传统抗生素相比，抗菌肽具有广谱抗菌活性、理化性质稳定，并由于其独特作用机制对细菌和真菌不易对其产生耐药性等优点，具有开发成新型抗生素的潜力。
虽然目前已经提取出来许多天然抗菌肽，并且进行了不同深入的研究，比如melittin、PG-1、LL-37、indolicidin等，但是天然抗菌肽往往存在活性不高、毒性强，序列长，提取过程复杂、合成成本高等弊端，限制了抗菌肽的开发应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK及其制备方法和应用，缩短肽链长度，解决天然抗菌肽序列长，合成成本高且对真核细胞有毒的问题。
本发明的目的通过如下技术实现：一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK的方法，步骤如下：
在抗菌肽从头设计及构效关系的基础上，选择优势疏水氨基酸Phe和在短肽设计中脱颖而出的电荷氨基酸Arg交替排列，保证其发挥抗菌功能所需要的的疏水性，用Glu/Lys替代Arg使肽在与细胞膜作用时，利用肽之间的吸引能力增加其聚集浓度，并保证与细菌细胞膜吸引所需要的一定的正电荷数，全新设计出富含苯丙氨酸的较短抗菌肽RFEK。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
本发明的优点及有益效果如下：根据抑菌和溶血活性计算治疗指数发现，抗菌肽RFEK治疗指数高达107.63，是蜂毒素治疗指数的166倍，具有较高的细胞选择性。抗菌肽RFEK对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等革兰氏阴性菌株具有较强抗菌活性，且在128μM都未产生溶血。综上所述，抗菌肽RFEK是一种具有较高应用价值的抗菌肽。通过本方法制备的抗菌肽，合成序列短，降低合成成本，并保证了高抗菌低毒性，有较高的治疗指数，在治疗大肠杆菌及沙门氏菌方面的感染中具有成为抗生素替代物的潜力。
附图说明
图1为抗菌肽RFEK的高效液相色谱图；
图2为抗菌肽RFEK的质谱图。
具体实施方式
实施例1抗菌肽的设计及制备合成
在抗菌肽从头设计及构效关系的基础上，选择优势疏水氨基酸Phe和在短肽设计中脱颖而出的电荷氨基酸Arg交替排列，保证其发挥抗菌功能所需要的的疏水性，用Glu/Lys替代Arg使肽在与细胞膜作用时，利用肽之间的吸引能力增加其聚集浓度，并保证与细菌细胞膜吸引所需要一定的正电荷数，全新获得抗菌肽RFEK，其氨基酸序列如表1所示。
表1抗菌肽RFEK的氨基酸序列
Figure BDA0002525648010000021
抗菌肽RFEK的电荷数为+4，疏水值为0.278，疏水力矩为0.021。通过在抗菌肽的C端酰胺化增加一个正电荷，N端乙酰化增加稳定性。该方法使肽具有较短的氨基酸序列，减少合成成本，在保持高效抑菌活性的同时具有较低的溶血活性，提高抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，具有成为抗生素替代物的发展潜力。
实施例2
固相化学合成法合成RFEK抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3
1、抗菌肽的抑菌活性
将肽配置成为2.56mM/L储存液备用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2所示。
表2抗菌肽RFEK对革兰氏阴性菌的抑菌活性
Figure BDA0002525648010000031
通过表2可得，抗菌肽RFEK对以上被测菌株表现出与蜂毒素相差不大的强抗菌活性。
2、溶血活性测定和治疗指数
采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到3mL PBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS溶液洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μl红细胞悬液与用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h后取出，4℃，1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值，每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μl 0.1％Tritonx-100作为阳性对照，50μl红细胞加50μl PBS作为阴性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。
抗菌肽对不同细胞的选择性作用通过治疗指数来评价。抗菌肽的治疗指数为抗菌肽最小溶血浓度与最小抑菌浓度几何平均数的比值。如抗菌肽在最高测定浓度128μM仍未表现出溶血活性，则256μM将作为最小溶血浓度用于计算治疗指数。治疗指数越大，表明该抗菌肽对细菌具有更高的抑菌活性，同时又保持较低的细胞毒性，说明抗菌肽具有更高的细胞选择性。溶血活性和治疗指数结果见表3。
表3 RFEK的溶血活性和治疗指数
Figure BDA0002525648010000041
抗菌肽RFEK在最大测定浓度128μM未表现出溶血活性，计算治疗指数为107.63，与蜂毒素相比，具有较高的细胞选择性。以上结果表明将所设计的抗菌肽RFEK具有较高的替代抗生素发展的潜力。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种富含苯丙氨酸抗菌肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Phe Glu Phe Arg Phe Lys Phe Arg
1 5

Claims (3)

1.一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK的制备方法，其特征在于，选择氨基酸Phe和氨基酸Arg交替排列，用氨基酸Glu和Lys替代氨基酸Arg，使肽在与细胞膜作用时，利用肽之间的吸引能力增加其聚集浓度，并保证与细菌的细胞膜吸引所需要的正电荷数，设计出富含苯丙氨酸的抗菌肽RFEK，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种富含苯丙氨酸抗菌肽RFEK在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
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