CN113214355A - 一种专杀真菌的抗菌肽gl4w及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种专杀真菌的抗菌肽GL4W及其制备方法和应用，抗菌肽GL4W其序列如SEQ ID No.1所示。以抗菌肽L4(RLRLLLRLR)为活性中心，在其N端用甘氨酸形成帽子结构并在其C端添加色氨酸形成尾端锚定结构设计出抗菌肽，命名为GL4W。抗菌肽GL4W在制备治疗真菌引发的感染性疾病药物中的应用。本发明改变了抗菌肽L4的抗菌谱，成为一种专杀真菌的抗菌肽，并且提高了抗菌肽对细菌细胞的选择性，其成为抗真菌感染药物的发展潜力，抗菌肽GL4W的治疗指数高达39.61。

Description

一种专杀真菌的抗菌肽GL4W及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种专杀真菌的抗菌肽GL4W及其制备方法和应用。
背景技术
全球真菌感染率继续上升，真菌感染正在给全球医疗保健系统带来越来越大的临床负担，但可以对抗这些疾病的治疗选择仍然仅限于四种主要的抗真菌药物类别，即多烯类、三唑类、尼可霉素类和棘白菌素类。由于真核病原体中的一些有效药物靶点往往与人类基因/基因产物所共有，导致开发安全/无毒的抗真菌药物比开发抗细菌药物更具挑战性。
抗菌肽是动物机体抵御外界微生物侵害及清除体内突变细胞的一类小分子多肽，具有广谱抗菌、无毒性、无耐药性、无残留与无污染等优点，而且其热稳定性好，添加剂量小，完全符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产过程中使用，极具有作为新一代饲料添加剂的潜质。而且抗菌肽的抑菌机理与抗生素不同，抗菌肽是通过破坏细菌的细胞膜结构，使细胞内溶物外泄，从而杀死细胞，所以不易产生耐药性。更为重要的是，抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，只作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。据上述原因，抗菌肽完全有可能取代抗生素成为一类新型、高效、低毒、无残留的抗菌物质，具有广阔的应用前景。
虽然现有的一种抗菌肽L4(RLRLLLRLR-NH2)具有较好的抗真菌(GM＝8.00μM)与抗细菌(GM＝4.76μM)的抗菌活性，但其抗菌谱较广，而广谱抗菌药物的使用对机体菌群平衡的破坏能够引起继发感染且更易产生耐药性。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种专杀真菌的抗菌肽GL4W，其没有抗细菌的活性，是一种专杀真菌的抗菌肽。
本发明的目的通过如下技术实现：一种专杀真菌的抗菌肽GL4W，其序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明的另一目的是提供一种专杀真菌的抗菌肽GL4W的制备方法，如下：
(1)以抗菌肽L4为活性中心，其氨基酸序列为：RLRLLLRLR，在其N端用甘氨酸形成帽子结构，并在其C段添加色氨酸形成尾端锚定结构；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽GL4W；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽GL4W的制备。
进一步的，本发明的另一目的是提供一种专杀真菌的抗菌肽GL4W在制备治疗真菌引发的感染性疾病药物中的应用。
本发明具有如下优点及有益效果：抗菌肽GL4W具有很高的细胞选择性，对得到的抗菌肽进行抗细菌、抗真菌和溶血活性检测，发现抗菌肽GL4W对13种细菌(革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)没有抗菌活性，但对白色念珠球菌等13种真菌有明显的抑制作用，且几乎没有溶血活性。GL4W的治疗指数高达39.61。综上所述，GL4W是一种具有较高应用价值的抗真菌肽。
附图说明
图1为抗菌肽GL4W的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗菌肽的设计
由α-螺旋肽序列模板Rn(XRXXXRX)Rn(n＝1,2；X代表L)设计得到的L4(RLRLLLRLR)为活性中心，在其N端用甘氨酸形成帽子结构并在其C端添加色氨酸形成尾端锚定结构设计出专杀真菌的抗菌肽，命名为GL4W。GL4W的氨基酸序列如表1所示。
表1 GL4W的氨基酸序列
Figure BDA0003012974620000021
GL4W的电荷数是+5，平均疏水值均分别为0.610。将GL4W的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。
实施例2
固相化学合成法合成GL4W。
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干。
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，结果如图1所示。质谱图中显示的分子量与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3：
1、GL4W抗细菌活性的测定：本实验参考美国临床实验室标准委员会(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推荐的方法，测定肽的最小抑制浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀细菌浓度(Minimumbactericidal concentration，MBC)，并根据抗菌肽阳离子特征进行适当改进，具体步骤如下：
(1)菌体准备：取冻存于-20℃的菌种划线接种于MHA固体培养基，37℃过夜培养。随后挑单菌落接种于MHB中，220rpm，37℃培养至对数生长期，用MHB调整其浓度至OD600nm＝0.1，最后用MHB进一步稀释1000倍至(0.5-1)×105CFU/mL。
(2)多肽的稀释：在96孔板中A行内加入95μL 0.2％BSA稀释液，其余孔加入50μL0.2％BSA稀释液。将5μL 2.56mM浓度的肽加入A行孔中，充分混匀，然后吸取50μL加入B行，以此类推，倍比稀释至G行，混匀后吸取50μL弃去。每个测定肽设置三个平行。
(3)菌液接种：将50μL菌液加入96孔板A-G行孔中，H行1-6号孔同样加入50μL菌液作为阳性对照，7-12号孔加入50μL新鲜的MHB培养基作为阴性对照，混匀后置于37℃下培养24h。
(4)最小抑制浓度确定：阳性孔浑浊，表明细菌正常生长，阴性孔清亮，表明实验过程无污染。若测试孔无肉眼可见菌生长，则其对应的最低药物浓度即为测定肽的最小抑制浓度。检测结果见表2。
表2 GL4W的抗细菌活性(μM)
Figure BDA0003012974620000041
2、GL4W抗真菌活性的测定：本实验参考美国临床实验室标准委员会(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推荐的方法，测定肽的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀细真菌浓度(Minimumfungicidal concentration，MFC)，并根据抗菌肽阳离子特征进行适当改进，具体步骤如下：
(1)菌体准备：取冻存于-20℃的菌种划线接种于YM固体培养基，28℃过夜培养。随后挑单菌落，于去离子水中调节菌体浓度至0.5麦氏比浊度，并用PRMI-1640培养基进一步稀释1000倍至(0.5-1)×103CFU/mL。
(2)多肽的稀释：步骤同3.1(2)
(3)真菌接种：同3.1(3)，将真菌菌液50μL接种于96孔板中，28℃培养48h。
(4)最小抑制浓度确定：同3.1(4)
(5)最小杀真菌浓度确定：同3.1(5)，测定MIC后，从无肉眼可见菌生长孔中取50μL样品，用PBS连续倍比稀释后涂布于YM固体培养基上，28℃孵育培养48h后计算菌落数，以杀死99.99％细菌的最低药物浓度为测定肽的最小杀真菌浓度。本实验独立重复三遍。检测结果见表3。
表3 GL4W的抗真菌活性(μM)
Figure BDA0003012974620000051
通过表2和表3可以看出，GL4W对细菌几乎没有杀灭活性但对于真菌具有较强的杀灭作用，表明GL4W具有成为新一代专抗真菌药物的潜力。
3、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表4。
表4 GL4W溶血活性的测定
Figure BDA0003012974620000061
通过表4可以看出，GL4W在检测范围内未表现出溶血活性。
以上结果显示，综合分析抗菌肽的抗真菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价抗菌肽的生物学活性。由表4可以看出，GL4W具有较高的治疗指数(39.61)，表明设计得到的GL4W抗菌肽具有成为高效抗真菌药物的发展潜力。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种专杀真菌的抗菌肽GL4W及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Arg Leu Arg Leu Leu Leu Arg Leu Arg Trp
1 5 10

Claims (3)

1.一种专杀真菌的抗菌肽GL4W，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种专杀真菌的抗菌肽GL4W的制备方法，其特征在于，方法如下：
(1)以抗菌肽L4为活性中心，其氨基酸序列为：RLRLLLRLR，在其N端用甘氨酸形成帽子结构，并在其C段添加色氨酸形成尾端锚定结构；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽GL4W；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽GL4W的制备。
3.根据权利要求1所述的一种专杀真菌的抗菌肽GL4W在制备治疗真菌引发的感染性疾病药物中的应用。
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