CN114940701B

CN114940701B - 一种靶向抗真菌肽li及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114940701B
Application number: CN202210497816.4A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 宋静; 高筠函; 于宛琪
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2042-05-09
Also published as: CN114940701A

Abstract

本发明公开一种靶向抗真菌肽LI及其制备方法和应用，抗真菌肽LI的序列如SEQ IDNo.1所示。本发明以多肽L4(RLRLLLRLR‑NH₂)为活性中心，在N端添加亮氨酸形成帽子结构并在C端锚定异亮氨酸分别设计出抗菌肽，命名为抗菌肽LI。抗真菌肽LI在制备治疗靶向抗真菌感染性疾病的药物中的应用。抗真菌肽LI的治疗指数高达121.82。本发明在提高原有的多肽L4抗真菌活性的情况下，改变了其抗菌谱，使其成为靶向抗真菌肽，并且提高了细胞选择性，提高了其成为靶向抗真菌感染药物的发展潜力。

Description

一种靶向抗真菌肽LI及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种靶向抗真菌肽LI及其制备方法和应用。

背景技术

真菌在复杂的生态系统中发挥着关键作用。近年来，真菌已被认为是我们身体不同部位(例如，肠道、口腔、皮肤、肺、阴道)的共生微生物群的一个组成部分，尽管对于标准菌群组成的构成尚无共识，但一些研究指出肠道真菌可能来自口腔和饮食。然而，真菌感染已严重威胁了人类的健康。据估计，真菌疾病影响全球超过10亿人，其中对1.5亿人有严重感染。从影响皮肤、角质组织、粘膜的浅表和皮下感染到可能危及生命的涉及脑、心脏、肺、肝脏、脾脏和肾脏的全身感染。特别是免疫功能低下的HIV/AIDS或自身免疫性疾病患者，以及接受抗癌化疗或器官移植的患者都产生严重的危害。

目前占据市场主导地位的四大类抗真菌剂包括：唑类，抑制麦角甾醇的合成；多烯，与真菌膜甾醇相互作用；抑制葡聚糖合成的棘白菌素；以及嘧啶类，它们会干扰嘧啶代谢，导致DNA和RNA生物合成受到抑制。然而，侵袭性真菌感染的高死亡率、所需的长疗程、由于药物之间相似的作用机制而产生的交叉耐药性，促使人们急需寻找一种具有低毒性或抗菌效果更强的安全的替代品。抗菌肽(AMP)已成为预防或治疗真菌感染的新生药物。抗菌肽具有高度选择性、良好的耐受性以及由于其物理破坏细胞膜的作用机制而不易产生耐药性越来越受到人们的广泛关注。

在之前的研究中抗菌肽的设计主要集中在提高其广谱抗菌活性、降低细胞毒性、提高抗菌肽稳定性以及降低成本。但随着对抗菌药物研究的深入，人们逐渐认识到广谱的抗菌药物在发挥作用的同时也会对非致病菌群造成影响，体内的生态系统在宿主代谢及对病原体的抵抗中都发挥着极其重要的作用，而广谱抗菌药物的使用会破坏固有的生态系统，进一步促进了病原菌耐药性突变，对公共健康及环境安全造成了极大的威胁，引起免疫力下降，神经系统疾病，代谢功能障碍等继发性病变。而靶向抗真菌肽可以克服对正常菌群的杀伤作用从而避免宿主微生物群的破坏，更具针对性和高效性，不再造成因正常菌群的破坏而可能产生的二次感染和耐药菌株的出现。因此需要一种靶向抗真菌肽。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种靶向抗真菌肽LI，具有靶向抗真菌的效果。

本发明所采用的技术方案如下：一种靶向抗真菌肽LI，其序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的是提供一种靶向抗真菌肽LI的制备方法，如下：

(1)以多肽L4的序列：RLRLLLRLR-NH₂为活性中心，在其N端添加亮氨酸形成帽子结构并在C端锚定异亮氨酸设计出一种新的多肽；

(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到该多肽；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，再经过抗菌活性以及溶血毒性的测定，即完成多肽的制备，命名为抗菌肽LI，其序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的是提供一种靶向抗真菌肽LI在制备治疗靶向抗真菌感染性疾病的药物中的应用。

进一步的，以上的应用，所述的真菌为白色念珠菌或热带念珠菌。

本发明具有的有益效果及优点：通过本方法改造设计的抗菌肽LI具有高度的细胞选择性，对得到的抗菌肽LI进行抗细菌、抗真菌和溶血活性检测，发现LI对白色念珠球菌等15种菌种有明显的抑制作用，但对大肠杆菌等12种细菌没有抗菌活性，说明改变了原多肽L4(RLRLLLRLR-NH₂)的抗菌谱，而且具有很低的溶血活性。综上所述，抗菌肽LI是具有较高应用价值的靶向抗真菌肽。抗菌肽LI与原多肽L4相比，抗菌肽LI不仅提高了其抗真菌活性，抗菌肽LI的治疗指数比多肽L4提高了3.34倍，而且改变了抗菌谱，表明设计得到的抗菌肽LI具有较高的靶向抗真菌感染药物的发展潜力。

附图说明

图1为靶向抗菌肽LI的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

以L4(RLRLLLRLR-NH₂)为活性中心，在N端添加亮氨酸形成帽子结构并在C端锚定异亮氨酸分别设计出抗菌肽，命名为LI。LI的氨基酸序列如表1所示。

表1.LI和WL的氨基酸序列

L4和LI的电荷数都是+5，平均疏水值为分别为0.496，0.724。在L4和LI的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。

实施例2

固相化学合成法合成LI。

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干。

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，结果如图1所示。质谱图中显示的分子量与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：

抗菌肽抗菌活性以及溶血毒性的测定

1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养48h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。细菌检测结果见表2，真菌检测结果如表3。

表2 抗菌肽的抗细菌活性(μM)

表3 抗菌肽的抗真菌活性(μM)

通过表2和表3可以看出，LI没有抗细菌的活性但具有良好的抗真菌活性，并且提高了原肽L4抗真菌的活性，改变了原肽L4的抗菌谱，表明LI具有成为新一代靶向抗真菌药物的潜力。

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表4。

表4 L4和LI的溶血活性以及抗真菌治疗指数

通过表4可以看出，LI在检测范围内未表现出溶血活性。

以上结果显示，综合分析抗菌肽的靶向抗真菌活性和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抗真菌浓度的比值)来更全面的评价LI的生物学活性。由表4可以看出，LI与原肽L4相比较，不仅提高了其抗真菌活性(LI的治疗指数比L4提高了3.34倍)，而且改变了抗菌谱，表明设计得到的LI具有较高的靶向抗真菌感染药物的发展潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明的权利要求保护的范围。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种靶向抗真菌肽LI及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> NH2酰胺化

<400> 1

Leu Arg Leu Arg Leu Leu Leu Arg Leu Arg Ile

1 5 10

Claims

1.一种靶向抗真菌肽LI，其特征在于：序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种靶向抗真菌肽LI的制备方法，其特征在于，方法如下：

（1）以多肽L4 的序列：RLRLLLRLR-NH₂为活性中心，在其N端添加亮氨酸形成帽子结构并在C端锚定异亮氨酸设计出一种新的多肽；

（2）采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到该多肽；

（3）经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，再经过抗菌活性以及溶血毒性的测定，即完成多肽的制备，命名为抗菌肽LI，其序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种靶向抗真菌肽LI在制备治疗念珠菌感染性疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的念珠菌为白色念珠菌或热带念珠菌。