CN113956340B - 一种衍生自羊源抗菌肽rlr及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种衍生自羊源抗菌肽RLR及其制备方法和应用，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明通过截取羊源抗菌肽ChBac5末端的16个氨基酸，得到一条多肽RFR；将RFR刚性结构的双Pro‑Pro替换为促进α‑螺旋的Ala，并替换末端的Asn为Arg，得到一条多肽RFRR；利用Ile和Leu替换两侧的双Ala‑Ala，并利用Leu替换Phe，最后C端酰胺化得到抗菌肽RLR，本发明的抗菌肽RLR在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。抗菌肽对革兰氏阴性菌有高效的抑制作用和极低的溶血活性，但是不损伤革兰氏阳性菌，使其成为窄谱抗生素替代物的发展潜力。

Description

一种衍生自羊源抗菌肽RLR及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种衍生自羊源抗菌肽RLR及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽是生物体内广泛存在的一种具有抗菌活性的多肽，对真菌、病毒、寄生虫和癌细胞也有杀伤作用，有些抗菌肽还具有趋化作用、促进伤口愈合和调节免疫等多种功能。到目前为止，普遍认为抗菌肽主要作用于细菌的细胞膜，通过膜的破坏作用，引起细胞内容物的泄露，导致细胞死亡。抗菌肽这种特殊的作用机制使细菌通过基因突变产生耐药性的可能性大大降低。因此，抗菌肽的研究已成为基因工程和药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。
生物体内的抗菌肽通常以长链多肽为主，例如：37个氨基酸的人源Cathelicidin抗菌肽LL-37、36个氨基酸的猪骨髓细胞RNA源的PMAP-36以及63个氨基酸的鸡源抗菌肽AvBD4等。这些抗菌肽不仅长度过长，生产合成困难，抑菌活性难以调控，而且有些还会对人血红细胞产生不可逆的损伤。此外，这些抗菌肽通常抑菌谱广，甚至对大部分有益菌具有杀伤效果，不利于实际的生产应用。随着农业农村部194号公告的颁布，饲料中已全面禁用抗生素，因此，开发高抑菌活性和细胞选择性的窄谱抗菌短肽已迫在眉睫。羊源抗菌肽ChBac5具有43个氨基酸长度，结构复杂，而且抑菌谱过广，不利于生产应用。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的在于公开一种衍生自羊源抗菌肽RLR，其目的是简化羊源抗菌肽ChBac5的复杂序列并缩小抑菌谱，在保留活性中心的情况下，合理改造序列性质，提高了抗菌肽对革兰氏阴性菌的选择性，使其拥有成为窄谱抗生素替代物的潜力。
本发明的目的是这样实现的：一种衍生自羊源抗菌肽RLR，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明的另一目的是提供一种衍生自羊源抗菌肽RLR的制备方法，如下：通过截取羊源抗菌肽ChBac5末端的16个氨基酸，得到含有5个正电荷，疏水值为3.66的一条多肽RFR，其氨基酸序列为：RFRPPIRRPPIRPPFN；将RFR刚性结构的双Pro-Pro替换为促进α-螺旋的Ala，并替换末端的Asn为Arg，进一步提高抗菌肽的正电荷含量，得到含有6个正电荷，疏水值为0.186的一条多肽RFRR，其氨基酸序列为：RFRAAIRRAAIRAAFR；利用Ile和Leu替换两侧的双Ala-Ala，提高疏水性，并利用Leu替换Phe，降低细胞毒性，最后C端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性，得到含有7个正电荷，疏水值为0.535的抗菌肽RLR，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种衍生自羊源抗菌肽RLR在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果及优点如下：本发明的方法简化羊源抗菌肽ChBac5并缩小抗菌谱，在不影响抗菌肽的杀菌活性之外，有效地将制备出只针对革兰氏阴性菌的药物。对抗菌肽RLR进行抗菌和溶血活性检测，发现不但对大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌等菌种有高效的抑制作用和极低的溶血活性，但是不损伤革兰氏阳性菌；该抗菌肽在128 μM浓度下仅造成4.64 %的红细胞溶血，其已具备成为窄谱抗生素替代物和饲用型抗菌肽的发展潜力。
附图说明
图1为本发明的抗菌肽的高效液相色谱图。
图2为本发明的抗菌肽的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱图。
图3 肽RLL和蜂毒素ME的溶血活性图。
具体实施方式
下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明:
实施例1
抗菌肽的设计
羊源抗菌肽ChBac5的氨基酸序列为：RFRPPIRRPPIRPPFNPPFRPPVRPPFRPPFRPPFRPPIGPFP
通过截取羊源抗菌肽ChBac5末端的16个氨基酸，得到含有含有5个正电荷，疏水值为3.66的一条多肽RFR，其氨基酸序列为：RFRPPIRRPPIRPPFN；
将RFR刚性结构的双Pro-Pro替换为促进α-螺旋的Ala，并替换末端的Asn为Arg用来进一步提高抗菌肽的正电荷含量，得到含有6个正电荷，疏水值为0.186的一条多肽RFRR，其氨基酸序列为：RFRAAIRRAAIRAAFR；
利用Ile和Leu替换两侧的双Ala-Ala以提高疏水性，并利用Leu替换Phe以降低细胞毒性，最后C端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性，得到含有7个正电荷，疏水值为0.535的抗菌肽RLR，其氨基酸序列为：RLRILIRRAAIRLILR-NH2。抗菌肽的序列如表1所示，并利用固相化学合成法合成该抗菌肽RLR。
表1 衍生肽的氨基酸序列
肽 氨基酸序列 分子量 (Dalton)
RLR RLRILIRRAAIRLILR-NH<sub>2</sub> 2002.54
实施例2：
抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定抗菌肽RLR的最小抑菌浓度。以2mg/ml的BSA（含0.01 %乙酸）作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100 μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液（~105个/mL）于各孔中。分别设置阳性对照（含有菌液而不含有抗菌肽）和阴性对照（既不含菌液也不含抗菌肽）。37 ℃恒温培养14-18 h，用酶标仪在492 nm（OD492nm）处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2 抗菌肽的抑菌活性
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通过表2可以看出，抗菌肽RLR对于革兰氏阴性菌（E. coli 25922, S. typhimurium 14028和S. pullorum 7913）表现出较高的抑菌活性，而不损伤革兰氏阳性菌（S. aureus 29213, S. epidermidis 12228和S. aureus 43300）。
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1 mL，肝素抗凝后溶解到2 mL的 PBS溶液中，3000 rpm离心10 min，收集红细胞；用PBS溶液洗涤3遍，再用10 mL PBS溶液重悬；取50µL红细胞悬液与50 µL不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37 ℃培养箱内恒温孵育1 h；随后在4 ℃，3000 rpm下离心10 min；取出上清液用酶标仪在570 nm处测定光吸收值。其中50µL红细胞加50 µL PBS溶液作为阴性对照，50 µL红细胞加50 µL的0.1 % Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10 %溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图3。通过图3可以看出，抗菌肽RLR在检测范围内未表现出溶血活性，在64 µM浓度下造成1%的红细胞溶血，未能引起10 %的红细胞溶血，与对照组蜂毒素呈显著性差异。通过表3可以看出，抗菌肽RLR的选择指数高于具有强毒性的蜂毒素，表明抗菌肽RLR具备开发成为饲用型抗菌肽的潜力。
表3 短肽的MHC（µM）、GM（µM）和SI值
Figure 282620DEST_PATH_IMAGE002
。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种衍生自羊源抗菌肽RLR及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 1
Arg Leu Arg Ile Leu Ile Arg Arg Ala Ala Ile Arg Leu Ile Leu Arg
1 5 10 15

Claims (3)

1.一种衍生自羊源抗菌肽RLR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种衍生自羊源抗菌肽RLR的制备方法，其特征在于，方法如下：通过截取羊源抗菌肽ChBac5末端的16个氨基酸，得到含有5个正电荷，疏水值为3.66的一条多肽RFR，其氨基酸序列为：RFRPPIRRPPIRPPFN；将RFR刚性结构的双Pro-Pro替换为促进α-螺旋的Ala，并替换末端的Asn为Arg，进一步提高抗菌肽的正电荷含量，得到含有6个正电荷，疏水值为0.186的一条多肽RFRR，其氨基酸序列为：RFRAAIRRAAIRAAFR；利用Ile和Leu替换两侧的双Ala-Ala，提高疏水性，并利用Leu替换Phe，降低细胞毒性，最后C端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性，得到含有7个正电荷，疏水值为0.535的抗菌肽RLR，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种衍生自羊源抗菌肽RLR在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
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