CN105254722B - 一种抗菌肽fk及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗菌肽fk及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽FK，所述抗菌肽FK由28个氨基酸残基组成，分子量3358.20Da，等电点11.41，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明同时公开了上述抗菌肽Fk的制备方法和应用。本发明中的抗菌肽FK具有分子量小、人工合成简单、抗菌作用广谱高效、溶血活性低的优点，具有广泛的应用前景。

Description

一种抗菌肽FK及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种菌肽FK及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐药性。目前应对微生物耐药的唯一手段是使用新型或者替代性的抗生素药物，这就需要持续开发新型抗微生物剂。抗菌肽是一种生物体内合成的天然小分子多肽，是多细胞生物天然免疫系统的重要功能分子，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有直接杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、杀菌活性强、杀菌机制独特，不易引起耐药性等优点，被认为是极具潜力的传统抗生素替代药物，具有很大的开发应用前景。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有广谱高效的抗菌活性和极低的溶血活性的新型抗菌肽FK及其应用。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种抗菌肽FK，所述蝎子抗菌肽FK由28个氨基酸残基组成，分子量3358.20Da，等电点11.41，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：Phe1Lys2Phe3Gly4Gly5Phe6Leu7Lys8Lys9Met10Trp11Lys12Ser13Lys14Leu15Ala16Lys17Lys1 8Leu19Arg20Ala21Lys22Gly23Arg24Glu25Met26Ile27Lys28。
本发明进一步提出了上述抗菌肽FK的制备方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
更近一步地，本发明提出了上述抗菌肽FK在制备抗菌或抑制细菌生长的药物或防腐剂或动物饲料或化妆品中的应用。
另一方面，本发明提出了一种组合物，所述组合物包含上述抗菌肽FK和药学上或美学上可接受的载体或稀释剂。
本发明进一步提出了上述组合物在制备抗菌或抑制细菌生长的药物或防腐剂或动物饲料或化妆品中的应用。
本发明研究发现，上述抗菌肽FK和含有抗菌肽FK的组合物可以广泛应用于制备抗菌制剂、或抑制细菌生长的药物、或防腐剂、或动物饲料、或化妆品中，如可以用作药物、杀菌剂、抗微生物制剂、动物饲料、化妆品和防腐保鲜等领域。
有益效果：本发明中的抗菌肽FK具有分子量小、人工合成简单、抗菌作用广谱高效、溶血活性低的优点，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
根据下述实施例可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所详细描述的本发明。
实施例1抗菌肽FK的制备。
(1)抗菌肽FK的化学合成方法：根据编码基因推导的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
(2)抗菌肽FK用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
抗菌肽FK是基因编码的一种小分子多肽，由28个氨基酸残基组成。分子量3358.20Da，等电点11.41，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：Phe1Lys2Phe3Gly4Gly5Phe6Leu7Lys8Lys9Met10Trp11Lys12Ser13Lys14Leu15Ala16Lys17Lys18Leu19Arg20Ala21Lys22Gly23Arg24Glu25Met26Ile27Lys28。
实施例2：抗菌肽FK抗菌活性检测。
微生物菌株接种到MH液体培养基中，37℃振荡培养到对数生长期，用新鲜MH液体培养基将菌液稀释到2×105CFU/ml备用。在无菌96孔板(Thermo，美国)各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释的抗菌肽FK样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔做为对照管。
表.1稀释方法
将96孔板放置37℃培养箱中缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收，计算FK样品对不同微生物的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)值。结果如表2所示。
由表2可见，FK对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出很强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌。MIC值处于2.93～85μg/ml的范围。
表2抗菌肽FK抗菌活性
实施例3：抗菌肽溶血活性测定。
将采集的新鲜C57小鼠血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107～108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的抗菌肽FK样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。
结果表明FK浓度为200μg/ml时，溶血百分比为5.93％。说明抗菌肽FK对哺乳动物红细胞具有极低的溶血活性。
综上所述，本发明的抗菌肽FK具有分子量小、人工合成简单、抗菌作用广谱高效、溶血活性低的优点，可以广泛应用于制备抗菌制剂、或抑制细菌生长的药物、或防腐剂、或动物饲料、或化妆品中。

Claims (5)

1.一种抗菌肽FK，其特征在于，所述抗菌肽FK由28个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的抗菌肽FK的制备方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
3.权利要求1所述的抗菌肽FK在制备抗菌或抑制细菌生长的药物或防腐剂或动物饲料或化妆品中的应用。
4.一种组合物，所述组合物包含权利要求1所述的抗菌肽FK和药学上或美学上可接受的载体或稀释剂。
5.权利要求4所述的组合物在制备抗菌或抑制细菌生长的药物或防腐剂或动物饲料或化妆品中的应用。
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