CN110607265B - 一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株及其应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株及其应用 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019308，分类学命名Bacillus Subtilis。本技术方案的有益效果在于提供了一种可抑制致病细菌和真菌的枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株，该菌株可产生多种抗菌物质，有抑制金黄色葡萄球菌、稻瘟病菌、棉花黄霉菌等致病菌。而且其产生的细菌素适用范围广，具有耐高温、强酸和强碱的特性，具有广泛的应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株及其应用。
背景技术
自青霉素被发现并投入使用，其优良的抗细菌感染效果一直广为人们称赞。此后，随着越来越多的抗生素被发现以及抗生素的扩大培养使得产量越来越高，人们可以很容易获得抗生素。有研究表明，抗生素不仅可防止细菌感染和治疗致病微生物引起的疾病，还可以作为抗菌促生长剂，在家禽饲养过程中适当使用提高饲料利用率和促进动物生长。大多养户在养殖过程中为获得最大化的收益，频繁使用“万能”抗生素，这极大增加抗生素的使用量。过量抗生素导致微生物抗性基因的富集与扩散。随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始重视抗生素滥用和食品安全问题。与此同时，同样有抑菌效果的细菌素走进人们的视野。细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的蛋白质、多肽或者前体多肽，细菌素具有抑制其他微生物生长的功能，细菌素效果好、无抗药性的特性深受人们青睐。
细菌素化学本质是多肽，由细菌染色体编码核糖体合成，有的细菌素是质粒编码合成。几乎所有的细菌都能产细菌素，有的可以产两种甚至是两种以上，细菌素分子量小、无毒、含稀有氨基酸而被视为分子遗传学、基因工程的好材料，也用于食品防腐和医疗保健等方向。自有报道称，乳酸菌素可以抑制非肠道微生物之后，人们便开始了对天然抑菌剂乳酸菌细菌素深入研究，发现有极少数在食品和生物医学领域有使用潜能，比如：Lacticin3147和Nisin等。其中，1988年Nisin作为食品添加剂通过FDA认证，其后被广泛用作食品的防腐和保鲜。来自于乳酸菌的细菌素已成为人们热衷的研究对象，而忽视了对细菌分泌的细菌素的研究，尤其是像芽孢杆菌这种分泌物丰富的细菌有更大的研究价值。
因此，筛选具有良好抑菌能力的细菌素产生菌，并研究其生物学特性及对不同细菌和真菌的抑制作用，可为微生物源细菌素提供优质的资源，对于细菌素药物的广泛应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种可抑制致病细菌和真菌的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株可产生多种抗菌物质。
本发明提供的技术方案为一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019308，分类学命名Bacillus Subtilis。
而且，所述菌株能分泌4种细菌素。
而且，所述4种细菌素中其一是细菌素subtilosin A，其二是链霉素，其三是表面活性肽surfactin。
以及，枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。
以及，枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株在抑制棉花黄霉菌中的应用。
以及，枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株在抑制稻瘟病菌中的应用。
其中，所述稻瘟病菌是稻瘟病菌168。
其中，所述稻瘟病菌是稻瘟病菌NO-1。
而且，所述4种细菌素至少适用于20-80℃的温度条件。
而且，所述4种细菌素至少适用于2-12的pH条件。
与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：提供了一种可抑制致病细菌和真菌的枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株，该菌株可产生多种抗菌物质，有抑制金黄色葡萄球菌、稻瘟病菌、棉花黄霉菌等致病菌。而且其产生的细菌素适用范围广，具有耐高温、强酸和强碱的特性，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为UV-2600分光光度计扫描CZ162菌株活性成分，其中线条1：不产细菌素枯草芽孢杆菌对照；线条2：枯草芽孢杆菌CZ162菌株。
具体实施方式
本发明的枯草芽孢杆菌的分离和鉴定方法如下：
枯草芽孢杆菌CZ162从湖北省某猪养殖场污泥样品分离得到。具体分离步骤为：称取家禽排泄污泥1g加入含有99mL无菌蒸馏水并带有玻璃珠的三角瓶中，放置于28℃摇床内振荡30min，取样做梯度稀释后，涂布于含有20μg/mL氨苄霉素的牛肉膏蛋白胨平板中，置于37℃生化培养箱中培养48h，从中筛选出菌株。以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、稻瘟病菌为检测菌，采用牛津杯法，对分离的菌株产活性物质验证试验，筛选出对金黄色葡萄球菌、稻瘟病真菌具有较强抑菌能力的菌株CZ162。
采用16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列分析法，对菌株CZ162进行分子鉴定。将菌株接种到5ml LB培养液(蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g,NaCl 10.0g，H2O 1000mL)，37℃、200rpm/min培养24小时，10000rpm/min离心1min，收集菌体于1.5ml离心管中，采用CTAB法抽提细菌基因组。分别使用16S rDNA、gyrA和gyrB等引物，进行PCR扩增，扩增产物经测序后与GenBank已登录的相关序列进行核苷酸序列同源性比对分析，与Bacillus Subtilis相比，其16S rDNA、gyrA和gyrB序列相似性都达到99.5％,将其鉴定为这个种。
以下给出本发明的枯草芽孢杆菌CZ162的一些性能研宄结果：
实验1菌株CZ162产生的细菌素对金黄色葡萄球菌和植物致病真菌的抑制作用
CZ162菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取菌株上清发酵液。以金黄色葡萄球菌为指示菌，取其活化后菌液均匀涂布到LB培养基上。用镊子夹取已灭菌的牛津杯于涂布金黄色葡萄球菌的LB培养基平板中，向牛津杯中加入100μL CZ162菌株发酵液。将平板置于37℃恒温培养箱中培养14h，每个处理三个重复，测定其抑菌能力。结果表明：枯草芽孢杆菌CZ162对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，其抑菌圈直径达到为13.5±0.5mm。
分别蘸取棉花黄霉菌、稻瘟病168、稻瘟病NO-1等植物致病真菌的孢子，均匀涂抹到PDA培养基平板上。用镊子夹取已灭菌的牛津杯于涂布真菌的PDA培养基平板中，向牛津杯中加入100μL CZ162菌株发酵液，将平板置于30℃恒温培养箱中培养4d，每个处理三个重复，观察抑菌效果。结果表明：CZ162菌株产生的发酵液活性物质对棉花黄霉菌、稻瘟病168、稻瘟病NO-1都有很强的抑制能力，其抑菌圈直径分别达到26.2±2.1mm、36.8±2.4mm和28.4±2.6mm。
实验2菌株CZ162产生的细菌素在不同温度条件下对植物致病真菌的抑制
取CZ162菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取上清菌株发酵液。对枯草芽孢杆菌CZ162的发酵液进行不同温度处理后，牛津杯法测量其对真菌棉花黄霉菌、稻瘟病168、稻瘟病NO-1等农作物致病真菌抑菌能力，每个处理三个重复。经过20-80℃温度下处理2小时，枯草芽孢杆菌CZ162发酵液对农作物致病指示真菌抑制作用变化不显著(表1)。在80℃时，CZ162产生的细菌素对真菌棉花黄霉菌、稻瘟病168、稻瘟病NO-1的抑菌圈直径分别为27.2±1.5mm、35.6±2.8mm、27.7±2.6mm，与最适温度下的抗菌活性相比，其活性没有显著下降，表明枯草芽孢杆菌CZ162产生的细菌素具有很广的温度适应范围，可用于高温条件下抑制农作物致病真菌。
表1温度对CZ162菌株细菌素抑菌能力的影响
Figure GDA0002957563590000041
注：x±SD：表示抑菌圈大小(mm)的平均值±标准偏差。
实验3菌株CZ162产生的细菌素在不同pH条件下对植物致病真菌的抑制
对枯草芽孢杆菌CZ162的发酵液经不同pH值的酸或碱处理后，处理之后恢复pH至7，牛津杯法测量抑菌圈大小，每个处理三个重复。经过pH 2-12条件下分别处理4小时，枯草芽孢杆菌CZ162发酵液对农作物致病真菌都保持较强的抑制作用，表明枯草芽孢杆菌CZ162产生的细菌素有很广的酸碱度适应范围(表2)。其中，在pH为2的强酸处理条件下，枯草芽孢杆菌CZ162产生的细菌素对真菌棉花黄霉菌、稻瘟病168、稻瘟病NO-1的抑菌圈直径分别为34.2±2.4mm、33.6±3.4mm、23.3±1.8mm；而在pH为12的强碱处理条件下，枯草芽孢杆菌CZ162产生的细菌素对稻瘟病菌168的抑菌圈直径达到了35.5±2.8mm，对其它两种植物致病真菌也保持很高的抑菌活性。表明枯草芽孢杆菌CZ162产生的细菌素有很广的酸碱度适应范围，可用于强酸或强碱条件下抑制农作物致病真菌。
表2 pH对CZ162菌株细菌素抑菌能力的影响
Figure GDA0002957563590000042
注：x±SD：表示抑菌圈大小(mm)的平均值±标准偏差。
实验4 UV-2600全光谱扫描图
全光谱扫描采用UV-2600分光光度计和UVProbe分析软件。将活化的CZ162菌液与不产细菌素枯草芽孢杆菌对照菌液分装于离心管中，12000rpm室温离心5min。使用UV-2600分光光度计和电脑软件UVProbe，分析枯草芽孢杆菌CZ162在200-800nm的活性组分。CZ162菌株在300-400nm处相对于对照组具有4个比较明显的特征峰，可见CZ162能分泌4种细菌素，而且细菌素主要集中200-800nm处(图1)。图1为UV-2600分光光度计扫描CZ162菌株活性成分，其中线条1：不产细菌素枯草芽孢杆菌对照；线条2：枯草芽孢杆菌CZ162菌株。
实验5枯草芽孢杆菌CZ162抗细基因簇分析
(1)枯草芽孢杆菌素subtilosin A基因簇分析
对CZ162菌株进行全基因组测序，并对其序列进行生物信息学分析，发现在菌株CZ162的基因组上存在多种不同的细菌素基因。在菌株CZ162的基因组上存在细菌素subtilosin A基因合成簇(表3)。subtilosin A对很多致病微生物都有抑制作用，如:Gardnerella vaginalis、Listeria monocytogenes和Streptococcus agalactiae。subtilosin A合成是由基因簇控制的，其中albB为Bacillus subtilis自身免疫蛋白。蛋白质albG是subtilosin A合成的调控基因。
表3枯草芽孢杆菌素subtilosin A基因簇分析
Figure GDA0002957563590000051
(2)链霉素合成基因簇
在菌株CZ162的基因组测序中，存在链霉素合成基因族(表4)。一般抗生素是细菌在代谢过程中产生的能抑制或杀死其他种类微生物的化学物质，属于次级代谢产物。
表4基因组中链霉素合成基因簇
Figure GDA0002957563590000052
Figure GDA0002957563590000061
(3)表面活性肽surfactin合成基因簇
表面活性肽(Surfactin)是由枯草芽孢杆菌发酵产生的一系列具有相似基本结构的环状脂肽。与合成的表面活性剂相比，细菌Surfactin具有表面活性大、环境无污染、易生物降解、抑菌作用良好等优异特性，符合现代绿色化学发展理念，在多个领域应用广泛。在菌株CZ162的基因组测序中，存在CZ162-376、CZ162-377、CZ162-378、CZ162-379等表面活性肽合成基因簇(表5)，表明菌株CZ162能够产生脂肽类抗生素。
表5表面活性肽surfactin合成基因簇
Figure GDA0002957563590000062
Figure GDA0002957563590000071
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1529
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
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gacaagcctt ataaaaaatc cgcgcgtatc gttggagaag ttatcgggaa ataccacccg 240
cacggtgatt cagcggtata tgaatccatg gtcagaatgg ctcaggattt caactaccgt 300
tatatgctcg ttgacggtcc cggaaacttc ggttctgttg acggagactc agcggcggcc 360
atgcgttata cagaagcaag aatgtctaaa atctcaatgg agattcttcg cgacatcaca 420
aaagacacaa tcgattacca ggataactat gacgggtcag aaagagaacc tgtcgttatg 480
ccttcaaggt tcccgaatct gctcgtgaac ggtgctgccg gcattgcggt aggtatggca 540
acaaacattc ctccgcacca gctgggagaa atcattgacg gtgtacttgc tgtcagtgag 600
aatccggaca ttacaattcc agagcttatg gaagtcattc cagggcctga tttcccgacc 660
gcgggtcaaa tcttgggacg cagcggtatc cggaaagcat acgaatcagg ccgaggctct 720
atcacgatcc gggcaaaagc tgagatcgaa caaacatctt cgggtaaaga aagaattatc 780
gtacagagtt accttaccaa gtaa 804

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019308，分类学命名Bacillus Subtilis。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株在制备为抑制金黄色葡萄球菌的产物中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株在抑制棉花黄霉菌中的应用。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis CZ162菌株在抑制稻瘟病菌中的应用。
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