CN106519000B - 一种抗菌肽to2-24及其应用 - Google Patents

一种抗菌肽to2-24及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗菌肽TO2‑24及其应用，具体涉及一种抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的序列如SEQ ID No.1所示。该抗菌肽可有效杀伤海岸弧菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌三种鱼类致病菌。本发明的抗菌肽经实验验证效果优异。

Description

一种抗菌肽TO2-24及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及微生物学领域，具体的说是一种抗菌肽及其应用。
背景技术
随着水产养殖规模的不断扩大和养殖环境的不断恶化，各种病害也随之频繁发生。当前,细菌性感染和细菌性疾病的发生呈上升趋势,细菌耐药性的形成是一个重要的原因，传统抗生素的大量使用造成耐药菌株不断产生,使得许多曾经高度有效的抗生素药物失效,已严重影响到我国水产养殖业的健康发展。因此寻求新型的杀菌物质越来越重要。科研人员正努力寻求新的抗菌策略，其中抗菌肽研究与应用是最有前景的一个领域。抗菌肽几乎是所有生命物种都有的重要免疫分子,具有广谱抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性，并且抗菌肽具有不易产生耐药性、热稳定性强等传统抗生素药物不可替代优势，因而越来越受到人们的关注。最近研究发现，人类组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2)的C末端衍生肽具有广谱抗菌和抗病毒作用；黑猩猩,老鼠,火鸡,家鸡,短吻鳄,海龟,青蛙,鲨鱼和斑马鱼的TFPI-2C末端衍生肽对大肠杆菌和铜绿假单胞菌具显著抗菌活性。目前，尚没有美国红鱼TFPI-2C末端衍生肽的报道。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明一方面提供了一种抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，本发明的另一个方面提供了如上所述的抗菌肽在制备抑制细菌的药物中的应用。
进一步地，所述细菌为鱼类致病菌，优选为海岸弧菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌。
进一步地，本发明的另一个方面提供了如上所述的抗菌肽在制备抗病毒的药物中的应用。
进一步地，所述病毒选自传染性脾肾坏死病毒。
本发明还涉及使用固相树脂合成法制备所述抗菌肽TO2-24的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)将第一个Fmoc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上；
(2)将树脂溶胀，脱保护后与下一个氨基酸进行级联反应；
(3)合成完毕后洗涤、干燥，随后再连接下一个氨基酸，直至连完最后一个氨基酸；
(4)最后脱除N端Fmoc保护的氨基酸上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来，并切除树脂，即得到纯化的抗菌肽TO2-24。
有益效果
本发明的抗菌肽具有高效抑菌作用，可以有效抑制多种致病菌和病毒，因此可以应用于鱼类病害防治。
具体实施方式
图1、TO2-24的抑菌作用。将TO2-24分别与藤黄微球菌(A)、金黄色葡萄球菌(B)和海岸弧菌(C)孵育后拍摄的抑菌圈。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1
本发明的抗菌肽TO2-24为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
序列SEQ ID No.1为：CVKGGKKYKRQGKGHRMRRYRNNH
序列
(a)序列特征：
长度：24
类型：氨基酸序列
链型：单链
拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工合成
本实施例合成的抗菌肽TO2-24按照Fmoc固相多肽合成法，最终得到纯度大于90％的抗菌肽TO2-24。合成时将一个Fmoc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，经过树脂溶胀，脱保护，称料，投料，反应后洗涤，检测，合成完毕后的洗涤和干燥后再连接下一个氨基酸，直至连完最后一个氨基酸，即得到抗菌肽TO2-24的序列，最后脱除N端Fmoc保护的氨基酸上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来，并切除树脂，即得到纯化的抗菌肽TO2-24。经检测，所得抗菌肽的序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2
抗菌肽TO2-24的应用
1)细菌悬液的制备。在LB培养基中培养海岸弧菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌分别至OD600为0.80，然后室温离心(5000g)10min，收集菌体，将其悬浮于LB中至终浓度为2×105CFU/ml。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％，Na2HPO4.12H2O，0.024％NaH2PO4。
2)抗菌肽TO2-24的杀菌活性。将50μl上述步骤1)的菌液加入96孔细胞培养板中，与倍比稀释的TO2-24或PBS混合，28℃培养24h。结果发现，TO2-24对海岸弧菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为：11μM，3μM和6μM，而PBS组则完全不能抑制细菌生长。
3)抗菌肽TO2-24的抗病毒活性。将100μM的TO2-24或PBS与1ml传染性脾肾坏死病毒(2×108CFU/ml)的PBS悬液混合，室温放置4h。将实验用鱼美国红鱼分成两组，每组15条，然后将传染性脾肾坏死病毒与TO2-24(实验组)或PBS(对照组)的混合物腹腔注射美国红鱼，在注射后3d和5d分别在无菌条件下取鱼的脾脏，提取基因组DNA，利用绝对荧光定量PCR检测病毒拷贝数。结果发现，与对照组相比，实验组病毒的拷贝数在感染后3d和5d分别下降了6倍和82倍。说明TO2-24对传染性脾肾坏死病毒具有显著的杀伤作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 一种抗菌肽TO2-24及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Cys Val Lys Gly Gly Lys Lys Tyr Lys Arg Gln Gly Lys Gly His Arg
1 5 10 15
Met Arg Arg Tyr Arg Asn Asn His
20

Claims (1)

1.一种抗菌肽在制备抗病毒的药物中的应用，所述抗菌肽的序列如SEQ ID No.1所示，所述病毒是传染性脾肾坏死病毒。
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Kasetty et al;Kasetty et al;《BMC Microbiology》;20160627;第16卷(第129期);第2页最后1段-第3页第1段、图2,-3，表1，摘要部分

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