JP2001517422A - 単離したおよび組換えによる抗菌ペプチドトロンボシジン−１（ｔｃ−１）およびトロンボシジン−２（ｔｃ−２）またはその変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離したおよび組換えの抗菌ペプチドトロンボシジン−１（ＴＣ−１）およびトロンボシジン−２（ＴＣ−２）またはその変異体に関し、該ペプチドは、図１にＴＣ−１およびＴＣ−２の標記によって示す配列の少なくとも一部を含み、グラム陽性菌およびグラム陰性菌、たとえば、大腸菌、Bacillus subtilis、Streptococcus sanguis、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus epidermis、およびStaphylococcus aureus、および／または真菌、たとえば、Candida albicans、C. glabarata、Cryptococcus neoformans、Aspergillusflavus、A. fumigatus、およびPseudoallescheria種に対して抗菌および抗真菌活性を有する。本発明はさらに、ヒトおよび動物における心内膜炎などの細菌または真菌感染症の治療用医薬の製造のための該ペプチドまたはその変異体の使用、およびヒトおよび動物における細菌または真菌感染症の予防のための放出系における該ペプチドまたはその変異体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、単離した抗菌ペプチドＴＣ−１およびＴＣ−２またはその変異体お
よび組換えにより製造したＴＣ−１およびＴＣ−２またはその変異体に関する。

【０００２】 （背景技術） 抗生物質は、一般に、種々の微生物によって引き起こされる感染性疾患の治療
および／または予防に用いられている。しかしながら、これら抗生物質に対する
細菌の耐性がしばしば生じている。このように、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus）(ＭＲＳＡ)およびメチシリン耐性表皮ブドウ球菌（S
taphylococcus epidermis）(ＭＲＳＥ)は、他の細菌種の中でも、治療するのが 非常に困難な重篤な病院感染症の原因となるよく知られた耐性微生物である。

【０００３】 従来の抗生物質は、細菌のＤＮＡおよびタンパク質の合成または菌体細胞壁（
cell wand）の合成に関与する特定の標的に結合することにより細菌を殺す。耐 性は、抗生物質がこれらタンパク質に結合しないように細菌がこれら標的を修飾
するときに、または細菌が抗生物質を不活化する特定の酵素を産生するときに生
じうる。バンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質はこれら耐性微生物の処置に
用いることができるが、その使用は、これら「殺すかまたは治癒する」（kill o
r cure）療法に対する耐性の発生を予防することに限るべきである。

【０００４】 日常的に使われる抗生物質に対して耐性の細菌が増加するに伴い、他の抗菌剤
に対する緊急の必要性が増大している。 それゆえ、本発明の目的は、微生物が速やかには耐性になることのない新規の
抗菌剤を提供することである。

【０００５】 （発明の要約） この目的は、新規の単離したまたは組換えの、抗菌ペプチドトロンボシジン（
thrombocidin）−１（ＴＣ−１）およびトロンボシジン−２（ＴＣ−２）、また
はＴＣ−１^*などのその変異体を提供することによって本発明により達成され、 これらペプチドまたはその変異体は、少なくともその一部に図１に示す配列を含
み、広い抗菌活性を有する。それゆえ、これらペプチドまたはその変異体は、幾
つかの感染性疾患の治療において抗生物質として有効に用いることができる。こ
れらペプチドは、ヒトおよび動物の両組織から単離できる。

【０００６】 単離したまたは組換えのペプチドの「変異体」とは、ＴＣ−１^*などのように 、ＴＣ−１およびＴＣ−２に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８
０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相
同であり、インビトロで抗菌活性を有するペプチドである。

【０００７】 ヒトおよび動物の血小板は、インビトロで抗菌活性および抗真菌活性を示す因
子を含むことがわかっている。血小板は、トロンビン活性化によりリゾチームお
よび幾つかの他のカチオン性ペプチドを遊離することが知られている。幾つかの
これらの血小板由来ペプチド、たとえば、血小板第４因子、ランテス、結合組織
活性化ペプチド（connective tissue activating peptide）(ＣＴＡＰ−ＩＩＩ)
、血小板塩基性タンパク質（platelet basic protein）(ＰＢＰ)、および好中球
活性化ペプチド（ＮＡＰ−２）などが同定されている。

【０００８】 本発明に導いた研究に際して、新規なペプチドが血小板顆粒から単離され、精
製および特徴付けられた。これらペプチドは小さな強い正の荷電を有するタンパ
ク質であり、トロンボシジン（ＴＣ）と命名した。トロンボシジンの正の荷電が
、おそらくその抗菌活性の原因である。それゆえ、他のカチオン性抗菌タンパク
質と同様にトロンボシジンは細菌膜に孔を形成するものと思われ、その結果、こ
れら細菌は死ぬであろう。トロンボシジンは細菌膜自体に作用し、細菌膜は容易
には修飾することができないので、耐性は速やかには生じないであろう。

【０００９】 トロンボシジンは血小板のアルファ顆粒中に貯蔵され、トロンビン活性化に引
き続き遊離される。最も活性のあるトロンボシジンであるＴＣ−１およびＴＣ−
２およびＴＣ−１^*などのその変異体は、以下の実施例に詳細に記載するように 、単離、精製および特徴付けられている。手短にいうと、トロンボシジンはヒト
血小板の大きなバッチから単離した。第一の工程は、トロンボシジンが存在する
血小板顆粒を単離することであった。その後、これら血小板顆粒を破砕し、タン
パク質含量をさらに精製するために回収した。トロンボシジンを分子サイズ、極
性および電荷に基づいて他のタンパク質から分離した。

【００１０】 本発明の新規なペプチドは、ＮＡＰ−２およびＣＴＡＰ−ＩＩＩの誘導体であ
ると思われる。ＮＡＰ−２自体は、ＣＴＡＰ−ＩＩＩのＮ−末端開裂産物である
。ＴＣ−１は、ＮＡＰ−２のＣ末端の先端切断（truncation）産物の混合物であ
ることが示されており、そのうち２つのＣ末端アミノ酸を欠く７４３６Ｄａペプ
チドが主要な成分である（変異体ＴＣ−１^*を参照；図１、表１）。Ｎ−末端チ ロシンが付加した形態のＮＡＰ−２もまた少量成分として存在した。ＴＣ−２は
、最後の２つのＣ末端アミノ酸を欠くＣＴＡＰ−ＩＩＩのＣ末端の先端切断産物
として同定されており、分子量は９１００である（図１Ａ、表１）。このように
してこれまで同定されたトロンボシジンを、ＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびＮＡＰ−２
の公知の配列とともに図１Ａに示す（図１）。

【００１１】 上記で記載したように、トロンボシジンはＮＡＰ−２およびＣＴＡＰ−ＩＩＩ
のＣ末端の先端切断産物であるが、ＮＡＰ−２およびＣＴＡＰ−ＩＩＩはともに
ＣＸＣファミリーのケモカインである。これらケモカインは特定の配置および４
つのシステイン残基のジスルフィド結合を有し、該分子に特徴的な三次元構造を
与えている（図１３）。それゆえ、他のケモカインまたはケモカイン様分子もま
たトロンボシジンのような抗菌活性を有することは充分に考えられる。

【００１２】 天然タンパク質のアミノ酸配列に基づき、ＴＣ−１、ＮＡＰ−２およびＣＴＡ
Ｐ−ＩＩＩをコードするＤＮＡをクローニングし、一層大量に得るためにこれら
タンパク質を組換えにより産生するために用いた。この点に関して、コードＤＮ
Ａをヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより増幅させ、ＮｄｅＩ／Ｂａ
ｍＨＩ消化したｐＥＴ９ａまたはｐＥＴ１６ｂ発現ベクター中にクローニングし
た。構築物を大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ＬｙｓＳ細胞に形質転換し、増殖培地にＩＰ
ＴＧを添加して遺伝子発現を誘発させた。菌体を回収し、グアニジン中で溶解し
、組換えタンパク質を均質になるまで２工程精製にて精製した。精製した組換え
タンパク質の配列を図２に示す。組換えトロンボシジンはまた、動物の乳中でも
産生させた。

【００１３】 抗菌タンパク質の幾つかのクラスは、ジスルフィド結合を含む。調べた限りで
は、これらジスルフィド結合の存在は、ＨＮＰ−２（SelstedおよびHarwig、１ ９８９）、ＧＮＣＰｓ（Yomogidaら、１９９５）の抗菌活性にとって必須であり
、プロテグリン（protegrins）(Harwigら、１９９６)の活性には有利であること
がわかっている。ジスルフィド結合の形成が抗菌活性にとって決定的であるため
、原核細胞系はこれらタンパク質を組換えにより産生するための明白な方法では
ない。ＨＮＰは組換えにより大腸菌で産生されているが、実際にはこの産物は、
おそらくタンパク質の折り畳みミスのために抗菌活性を有しなかった（Piersら 、１９９３）。ＮＡＰ−２、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ（Proudfootら、１９９７）およ びＩＬ−８（Lindleyら、１９８８）などのケモカインは大腸菌で産生されてい るが、これらタンパク質は精製後に再度折り畳まれる必要があった。この手順は
、組換えトロンボシジンの抗菌活性を観察するには必要とされなかった。

【００１４】 ＴＣ−１^*およびＴＣ−２の抗菌活性は、Streptococcus sanguis、黄色ブドウ
球菌（Staphylococcus epidermis）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）および枯草菌（Bacillus subtilis）などの幾つかのグラム陽性菌、および大 腸菌（Escherichia coli）などのグラム陰性菌（これらは広く様々な感染症にお
いて見出されている）に対して確認されている。

【００１５】 本発明のペプチドを用いることのできる感染症の一例は、心内膜炎である。心
内膜炎は高い罹病率および死亡率の重篤な感染性心臓疾患であり、心臓内皮およ
び心臓弁の異常を伴う。これら異常による病変は、血小板の付着および活性化を
もたらす。これら血小板は他の血液タンパク質と一緒になって病変を覆う密な網
細工（meshwork）を形成し、これに血流中に侵入した細菌が付着されるであろう
。今度は、これら細菌に血小板が付着し「クロット」が成長するにつれ、最終的
に弁の機能不全を引き起こし、その結果、弁の置換が必要となる。S. sanguisは
、天然の弁膜性心内膜炎において広く分布する微生物の一つである。しかしなが
ら、他の細菌、または真菌微生物もまた認められる。

【００１６】 血小板クロットにおいて、食作用細胞は密な血小板網細工の内部へ侵入できず
、細菌はこれら食作用細胞から保護される。対照的に、血小板由来のトロンボシ
ジンは該クロット中に侵入することができ、それゆえ細菌の増殖を有効に防ぐこ
とができる。 本発明のペプチドが有効な真菌としては、たとえば、Candida albicans、C. g
labrata、Cryptococcus neoformans、Aspergillus flavus、A. fumigatus、およ
びPseudoallescheria種が挙げられる。

【００１７】 それゆえ、本発明は、新規な単離したまたは組換えにより調製したペプチドＴ
Ｃ−１およびＴＣ−２、またはＴＣ−１^*などのその変異体（図１および図２） を提供するものであり、これらペプチドまたはその変異体は抗菌活性および／ま
たは抗真菌活性を示し、ヒトおよび動物における感染症の治療に用いることがで
きる。さらに、本発明のペプチドまたはその変異体は、細菌性および／または真
菌性の感染症の治療用医薬の製造のために用いることができる。

【００１８】 本発明を下記実施例および図面によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれ
ら実施例および図面に限られるものではない。 実施例１ＴＣ−１およびＴＣ−２の単離、精製および特徴付け Ａ．血小板からの顆粒タンパク質の単離 健常な被験者からのヒト血液のバフィーコートを、中央輸血研究所（Central
Laboratory for Bloodtransfusion）（アムステルダム、オランダ）から入手し た。８つのバフィーコートを輸送バッグ（ＮＰＢＩ、Emmer-Compascuum、オラン
ダ）（約５００ｍｌ）中にプールし、２００ｍｌのＰＢＳ＋０.３％トリス−ク エン酸ナトリウム（ｗ／ｖ）を加えた。バッグに空気を緊密に吹き込み、６００
ｇで２０℃にて５分間遠心した。主として血小板を含む上相を新たな輸送バッグ
に移した。この血小板濃縮物に１／９容量のクエン酸溶液（７５ｍＭクエン酸三
ナトリウム；３８ｍＭクエン酸）を加えた。バッグに再び緊密に吹き込み、１７
５０ｇ（２０℃）にて１０分間遠心して血小板をペレット化した。ペレットを同
バッグ中で穏やかなマッサージ（massage）によりトリス−クエン酸（６３ｍＭ トリス−ＨＣｌ；９５ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ ６.８）に再浮遊させ、２２℃で一夜振盪を続けた。ついで、血小板をシリコン 処理（siliconized）フラスコ中に回収し、輸送バッグをトリス−クエン酸で洗 浄した。４８のバフィーコートの処理により、＜０.０５％の残留白血球を含む 高濃縮血小板浮遊液（約７５ｍｌ）が通常の操作により得られた。

【００１９】 血小板顆粒を単離するため、血小板濃縮物を６０気圧の窒素下、パールキャビ
テーションチャンバ（Parr cavitation chamber）中で３回キャビテーションし （cavitated）、キャビテートをシリコン処理５０ｍｌ容チューブ（Falcon）に 回収した。この結果、コールターカウントにより決定されるように、約９０％の
均質化の血小板が得られた。キャビテートを５０００ｇにて２０分間遠心するこ
とにより完全な血小板および血小板ゴーストを除去した。上澄み液を回収し、１
２０００ｇで２０分間遠心して顆粒をペレットとして得た。このペレットを５％
酢酸に再浮遊し、氷上で３０秒間（パルスにて）超音波処理して顆粒を破砕した
。超音波処理物を４℃にて２４時間保持し、その後、１２５０００ｇにて遠心し
た。顆粒タンパク質を含有する上澄み液を５％酢酸に対して透析した。

【００２０】 Ｂ．トロンボシジン−１およびトロンボシジン−２の精製 血小板顆粒タンパク質からＴＣ−１およびＴＣ−２を精製するために迅速な２
工程精製プロトコール：（i）陽イオン交換クロマトグラフィー、および（ii） 分取酸性尿素ポリアクリルアミドゲルクロマトグラフィー（ＡＵ−ＰＡＧＥ）を
開発し、高度に精製したタンパク質調製物を得た。

【００２１】（i）陽イオン交換クロマトグラフィー イオン交換マトリックス、ＣＭ−セファロース２５（Pharmacia）を用いた； リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７.０）を移動相として用いた。約４０のバフィ ーコートからの３.５ｍｇ／ｍｌの顆粒タンパク質を含有する２５ｍｌ試料を０.
８ｍｌ／分にて負荷した。その後、カラムをリン酸緩衝液で洗浄し、タンパク質
を０〜１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配で溶出した。フラクションを回収し、透析し、２ つの別個の酸性尿素ゲルを平行して処理することにより抗菌タンパク質の存在に
ついてアッセイした。一つのゲルを銀染色し（図３）、他のゲルを重層アッセイ
に用いて抗菌活性を検出した（図４）。大腸菌ＭＬ３５を被験生物として用いた
。選択したフラクションをトリシンゲル電気泳動により分析して（部分）精製し
たタンパク質の分子量を推定した（図５）。出発物質（図３、ｃａｖ）中に存在
する活性はフラクション３５〜７５に溶出される。主要な抗菌活性は、２つのタ
ンパク質によるものとすることができ、最もカチオン性の強いタンパク質をトロ
ンボシジン−１（ＴＣ−１）と称し、わずかにカチオン性の低いタンパク質をト
ロンボシジン−２（ＴＣ−２）と称する。これらタンパク質は、それぞれ５.５ および６.５ｋＤの分子量を有するタンパク質としてＳＤＳゲル中を移動する（ 図５）。

【００２２】（ii）連続ＡＵ−ＰＡＧＥ 抗菌タンパク質を含有するＣＭ−セファロースカラムから溶出したフラクショ
ン（３０〜７５）をプールし、凍結乾燥し、ついで連続ゲル電気泳動を用いた第
二の精製工程に供した。円筒状ゲル（３.７×６ｃｍ、１２.５％アクリルアミド
、３Ｍ尿素、５％酢酸）をモデル４９１プレップセル（Prep Cell）（BioRad、 ベーネンダール、オランダ）中に注ぎ、３７℃で重合させた。前処理（prerunni
ng）を２００Ｖで２時間行った。試料（最大４５０ｍｌ）を４０ｍＡにて電気泳
動した。タンパク質を５％酢酸中で１ｍｌ／分にて溶出し、５ｍｌフラクション
として回収した。再び、フラクションを２つの尿素ゲル処理で平行して分析し、
ついで染色するかまたは抗菌活性についてアッセイした（図６）。ＴＣ−１およ
びＴＣ−２は有効に分離することができた（図６ａ）。両タンパク質とも大腸菌
ＭＬ３５に対して相当の活性を有していた（図６ｂ）。精製したＴＣ−１および
ＴＣ−２を凍結乾燥し、０.０１％酢酸中に再溶解し、さらなる分析まで−２０ ℃にて貯蔵した。

【００２３】 Ｃ．トロンボシジン−１およびトロンボシジン−２の構造 ヒト血液の血小板から精製した抗菌タンパク質トロンボシジン−１およびトロ
ンボシジン−２をＭＡＬＤＩおよび電子スプレー（electrospray）（ＥＳ）質量
分析により分析した。ＴＣ−１のＥＳ分析（図７ａ）は、７４３６.３±１.３Ｄ
ａの分子量を与えた。ＭＡＬＤＩによる分析（図８）もまた、Ｍ＋１が７１０７
.２、７２２７.７および７６０２.０Ｄａのピークの次にこのサイズのピークを 明らかにした。これらタンパク質の分子量は、これらタンパク質がＮＡＰ−２の
Ｃ末端の先端切断産物であると推定することにより説明することができる；計算
した分子量は実験的に決定した値とよく呼応する（表１）。これらデータは、Ｔ
Ｃ−１がＮＡＰ−２のＣ末端での先端切断産物の混合物であることを示唆してい
る。７４３６Ｄａのタンパク質が主要な成分であると思われる。本発明者らは、
このタンパク質をＴＣ−１^*と称した。

【００２４】 ＴＣ−２のＥＳ質量分析（図７ｂ）は、９１００.５±１.３の分子量を与えた
。この値はＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ質量分析により確認された。ＴＣ−２に加えて、
わずかな不純物が一つだけ存在した（１００８１Ｄａ、図９）。ＴＣ−２の部分
シークエンシングは、ＴＣ−２のＮ末端がＣＴＡＰ−ＩＩＩのＮ末端と同一であ
ることを示した（図７ｂおよび図９）。しかしながら、実験的にわかった質量は
ＣＴＡＰ−ＩＩＩの質量よりも小さかったと思われる（表１）。このことは、Ｔ
Ｃ−２がＣ末端側で先端が切断され、ＣＴＡＰ−ＩＩＩに比べて２アミノ酸だけ
少ないと推定することにより説明することができる。これまでに同定されたトロ
ンボシジンをＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびＮＡＰ−２の配列とともに図１に示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】 実施例２組換え(ｒ)ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、ｒＮＡＰ−２、ｒＴＣ−１、ｒＴＣ−１^*および ｒＴＣ−２の製造 ヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリー（Clontech、パロ・アルト、米国）から、ＰＢ
ＰをコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅させた。

【数１】 および

【数２】 をそれぞれフォアウォード（forward）プライマーおよびリバース（reverse）プ
ライマーとして用いた。ＢａｍＨＩ制限部位（下線部）を加えて適当なベクター
中へクローニングできるようにした。停止配列（太字）を含めることにより、タ
ンパク質発現の段階で適切な転写停止ができるようにした。このＰＣＲは、２ｎ
ｇの鋳型ＤＮＡおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プルーフリーディング能を 有する）を用いて行った。得られた生成物は予期したサイズ（４００ｂｐ）を有
していた。この生成物は第二のＰＣＲでは鋳型として働き、ＴＣ−１、ＴＣ−２
、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、ＮＡＰ−２およびＴＣ−１^*（Ｃ末端側の２つのアミノ酸 （Ａｌａ−Ａｓｐ）を欠き、Ｎ末端側に追加の２つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｇｌｕ
）を有するＴＣ−１の変異体）のコードＤＮＡを産生した（図２）。これらＰＣ
Ｒ産物を発現ベクターにクローニングした。ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、ＮＡＰ−２およ
びＴＣ−１に関しては、リバースプライマーは上記リバースプライマーと同じで
あった。フォアウォードプライマーは以下のとおりであった： ＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびＴＣ−２については：

【数３】 ＮＡＰ−２およびＴＣ−１^*については：

【数４】 ＴＣ−１については：

【数５】

【００２７】 ＮｄｅＩ制限部位（下線部）を含めてベクター中へクローニングできるように
した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ
で線状化したｐＥＴ９ａ（ＴＣ−２、ＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびＴＣ−１^*）かま たはｐＥＴ１６ｂベクター（ＮＡＰ−２およびＴＣ−１）中にライゲートした。
ｐＥＴ９ａベクターを用いて産生された組換えタンパク質はＮ末端にメチオニン
が付加しており、それゆえ、ｒＭＴＣ−１^*およびｒＭＴＣ−２およびｒＭＣＴ ＡＰと称した。ｐＥＴ１６ベクターを用いて産生された組換えタンパク質は、Ｎ
末端のＨｉｓ−タグとチロシン（Ｙ）残基とを有しており、それゆえｒＹＴＣ−
１およびｒＹＮＡＰと称した。構築物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ／カ
ナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）(ｐＥＴ９ａ)プレートまたはＬＢ／アンピリシン
（５０μｇ／ｍｌ）(ｐＥＴ１６ｂ)プレート上にプレーティングした。クローニ
ングＤＮＡのシークエンシングは、構築物中の正しい配列を確認した。正しい挿
入物を含むプラスミドを単離し、ＢＬ２１(ＤＥ３)ｌｙｓＥ細胞に形質転換し、
適切な抗生物質を添加したＬＢプレート上にプレーティングした。各プレートか
ら単一のコロニーを採り、増殖させ、さらに使用するときまで７０℃にてグリセ
リンブロス中で貯蔵した。ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、ＮＡＰ−２、ＴＣ−１またはＴＣ
−１^*遺伝子を含有するｐＥＴ発現ベクターで形質転換したＢＬ２１(ｌｙｓＥ) 細胞の培養物を、適切な抗生物質を添加したＬＢ培地中で増殖させた。ＯＤ₆₆₀ が０.３の増殖培養物をＩＰＴＧ（１ｍＭ最終濃度）で誘発した。３時間誘発し た後、菌体を遠心（５分、５０００ｇ）により回収し、６ＭグアニジンＨＣｌを
含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.２）中で溶解させた。菌体破砕物を遠 心により除去した。ｒＭＣＴＡＰおよびｒ−ＭＴＣを産生する菌体の上澄み液を
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に対して透析した。

【００２８】 ｒＭＴＣ−１^*、ｒＭＴＣ−２およびｒＭＣＴＡＰを、実施例１にＴＣ−１^*お
よびＴＣ−２について記載したようにして、ＣＭセファロース陽イオン交換クロ
マトグラフィーおよび連続酸性尿素ゲル電気泳動により精製した。ｒＹＴＣ−１
およびｒＹＮＡＰ中のＮ末端Ｈｉｓ−タグは、Ｈｉｓ結合樹脂（Novagen）を用 いてこれらタンパク質を精製することを可能にした。最終的な精製は、連続ＡＵ
ＰＡＧＥにより行った。精製した組換えタンパク質の構造をＭＡＬＤＩおよび ＥＳ質量分析により確認した。

【００２９】 実施例３抗菌活性 トロンボシジンの抗菌活性を試験するための実験手順は以下の通りであった：
血液寒天プレートからの細菌をトリプシンダイズブロス（tryptic soy broth） （ＴＳＢ）中で一夜増殖させ、新たなＴＳＢに植え継ぎ、対数期まで２〜３時間
増殖させた。細菌をペレット化し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）＋１％ ＴＳＢ（ｖ／ｖ）で一度洗浄し、同培地中に再浮遊させて０.１のＯＤ₆₂₀とした
。この浮遊液をさらに２００倍（B. subtilis）または５００倍（大腸菌およびS
. aureus）に希釈して、０.５〜１×１０⁵のコロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ
を含有する浮遊液を得た。ポリプロピレンマイクロタイタープレート中にて、試
験すべきタンパク質の系列希釈を０.０１％酢酸中で調製した。各試料（５μｌ ）に４５μｌの細菌浮遊液（０.５〜１×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌ）を加えた。プレー
トをロータリーシェーカー（４００ｒｐｍ）上、３７℃でインキュベートした。
２時間後、０.５および１０μｌの試料を血液寒天プレート上にプレーティング した。殺菌活性をコロニーカウンティングの翌日に計算した。実験はすべて２回
ずつ行った。

【００３０】 ＴＣ−１^*およびＴＣ−２の殺菌活性を、大腸菌ＭＬ３５、S. aureus 42Dおよ
びB. subtilis ATCC6633に対して殺菌アッセイ（killing assays）にて決定した
（図１０）。 図１０において、ＴＣ−１^*およびＴＣ−２は試験した３つのすべての細菌に 対して殺菌作用を有すること、およびＴＣ−１^*が一層活性な成分であることわ かる。

【００３１】 ＴＣ−２の殺菌活性は、他の細菌種のパネルに対して試験した。リン酸緩衝液
＋ＴＳＢの代わりに脳−心インフュージョン（ＢＨＩ）（水中にｖ／ｖ）を試験
培地として用い、試験したＴＣ−２の一つの濃度が１００μｇ／ｍｌであった他
は上記と同じ方法を用いた。試験した細菌は、大腸菌ＭＬ３５、野生型大腸菌、
S. aureus 42D、多耐性S. aureus（ＭＲＳＡ）、多耐性S. epidermis（ＭＲＳＥ
）、およびS. sanguis J30であった（図１１）。ＭＲＳＡおよびＭＲＳＥはS. a
ureus 42Dと同じくらいＴＣ−２に対して感受性であったが、S. sanguis J30は わずかに感受性が低いように思われた。

【００３２】 非還元トリシンゲル中でのＴＣ−１およびＴＣ−２の分析は、両ペプチドの移
動がその還元形に比べて遅くなることを明らかにした。このことは、ＴＣ−１お
よびＴＣ−２がジスルフィド架橋を含むことを示していた。これらジスルフィド
架橋の破壊が抗菌活性に影響を及ぼすか否かを調べるため、還元ＴＣ−２、還元
しアルキル化したＴＣ−２および非還元ＴＣ−２の抗菌活性を酸性尿素ゲル重層
系を用いて分析した。ＴＣ−２の３つの形態すべてが等しく活性であり（図１２
）、ジスルフィド架橋はＴＣ−２の抗菌活性には必要でないことが示された。Ｔ
Ｃ−１を同様に処理し、同様の結果が得られた。

【００３３】 一般には、カチオン性の抗菌タンパク質のジスルフィド結合は、その抗菌活性
に必須であると考えられている（SelstedおよびHarwig、１９８９、Yomogidaら 、１９９５、Harwigら、１９９６、Piersら、１９９３、Proudfootら、１９９７
およびLindleyら、１９８８）。ＴＣ−１およびＴＣ−２ではジスルフィド結合 が抗菌活性のために必要でないという事実は、予期しない知見である。

【００３４】 ｒＭＴＣ−１^*、ｒＭＴＣ−２およびｒＭＣＴＡＰのＭＢＣを幾つかの生物に ついて決定した（表２）。ｒＭＴＣ−１^*およびｒＭＴＣ−２は、ＭＢＣが天然 のタンパク質に比べて若干高いが、B. subtilisに対して殺菌作用を有する（図 １０）。大腸菌に対するｒＭＴＣ−１^*のＭＢＣ（３.８μＭ）は、天然タンパク
質ＴＣ−１^*のＭＢＣと同じであり、一方、S. aureusに対するｒＭＴＣ−１^*の ＭＢＣ（１５μＭ）はＴＣ−１^*のＭＢＣよりも約２倍高い（図１０）。これと 対照的に、ｒＭＣＴＡＰは大腸菌、B. subtilisおよびS. aureus４０μＭまでの
濃度で殺菌作用を示さなかった。組換えＮＡＰ−２（Bachem、スイスから入手）
を７μＭまでS. subtilisに対して試験したが、殺菌は観察されなかった。

【００３５】

【表２】

【００３６】 ｒＹＴＣ−１の殺菌活性を、天然のＴＣについて行ったように液体アッセイに
て試験した。天然のトロンボシジンＴＣ−１^*およびＴＣ−２と比較して、ｒＹ ＴＣ−１はB. subtilisに対して同等の活性を示したが、S. aureus 42Dおよび大
腸菌ＭＬ３５に対して一層強い活性を示した（表３、図１０）。追加の試験は、
ｒＹＴＣ−１が多数の細菌種およびCryptococcus neoformansに対して強い活性 を有することを示した（表３）。

【００３７】

【表３】

【００３８】 S. aureus、大腸菌およびB. subtilisに対するｒＭＴＣ−１^*の殺菌活性はｒ ＹＴＣ−１の殺菌活性に比べて有意に低かった（表２および表３）。ｒＭＴＣ−
１^*とｒＮＡＰ−２、およびｒＭＴＣ−２とｒＭＣＴＡＰとの間での殺菌活性の 顕著な差異（表３）は、ｒＮＡＰ−２およびｒＭＣＴＡＰに存在するＣ末端側の
２つのアミノ酸、アラニン（Ａ）およびアスパラギン酸（Ｄ）の付加が殺菌活性
を大きく低減させることを示している。これらＣ末端アミノ酸はまたｒＹＴＣ−
１にも存在するが、このタンパク質はｒＭＴＣ−１^*（これら２つのＣ末端アミ ノ酸を欠く）よりも一層活性が強い。実際、ｒＹＴＣ−１は上記天然または組換
えタンパク質のいずれよりも強力な抗菌活性を有し、ｒＹＴＣ−１はまたCrypto
coccus neoformansに対してｒＭＴＣ−１^*（ＭＢＣ ７.５μＭ）およびｒＭＴＣ
−２（ＭＢＣ １５μＭ）よりも活性が高かった（ＭＢＣ ０.４μＭ）。このこ とは、ｒＹＴＣ−１のＮ末端のＨｉｓ−タグ含有配列が高い抗菌活性に関与して
いることを示しており、これはこれまでに示されたことがないものである。

【００３９】参照文献 Harwig, SSL、A Waring、HJ Yang、Y Cho、L Tan、RI Lehrer (1996)： 細胞内ジスルフィド結合は生理学的塩化ナトリウム濃度にてプロテグリンの抗菌
活性および溶解活性を促進する、Eur J. Bioch. 240: 352-357 Lindley, I、H Aschauer、J Seifer、C Lam、W Brunowsky、E Kownatzki、M T
helen、P Peveri、B Dewald、V von Tscharner、A Walz、M Baggiolini (1988) ： 単球由来の好中球活性化因子をコードする遺伝子の大腸菌における合成および発
現：天然および組換え好中球活性化因子間の生物学的同等性、Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 85: 9199-9203 Piers, KL、MH Brown、REW Hancock (1993)： 小さな抗菌カチオン性ペプチドを細菌中で製造するための組換えＤＮＡ法、Gene
137: 7-13 Proudfoot、AEI、MC Peitsch、CA Power、B Allet、J Mermod、K Baconおよび
NC Wells (1997)： 組換えヒトＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびＮＡＰ−２の構造および生物学的活性、J. P
rotein Sci. 16: 37-49 Selsted、ME、およびSSL Harwig (1989)： ヒトデフェンシンＨＮＰ−２におけるジスルフィドアレイの決定、共有結合環化
ペプチド、J. Biol. Chem. 264: 4003-4007 Yomogida S，I Nagaoka，T Yamashita (1995)： モルモット好中カチオン性ペプチドの生物学的活性断片におけるシステイン残基
の関与、Infect. Immun 63: 2344-2346

【図面の簡単な説明】

【図１】 トロンボシジンおよび関連タンパク質の配列を示す。

【図２】 製造した組換えタンパク質を示す。囲んだ部分は抗菌活性を促進
する配列（Ｈｉｓタグ）を示す。

【図３】 ＣＭ−セファロース精製した血小板顆粒抗菌タンパク質の分析を
示す。選択したフラクション（示したもの）をＡＵ−ゲル上で処理し、ついで銀
染色した。 ｃａｖ：粗製の顆粒抽出物（キャビテート）、精製の出発物質。

【図４】 ＣＭ−セファロース精製した血小板顆粒抗菌タンパク質の分析を
示す。選択したフラクション（示したもの）をＡＵ−ゲル上で処理し、ついで被
験生物として大腸菌を用いた重層により処理した。 ｃａｖ：粗製の顆粒抽出物（キャビテート）、精製の出発物質。

【図５】 ＣＭ−セファロース精製した血小板顆粒抗菌タンパク質のトリシ
ンＳＤＳ−電気泳動による分析を示す。銀染色したゲル。選択したフラクション
（図３と比較）を分析した。

【図６】 ＡＵ−ＰＡＧＥ精製した血小板顆粒抗菌タンパク質の分析を示す
。選択したフラクション（示したもの）をＡＵ−ゲル上で処理し、ついで銀染色
するか（Ａ）またはついで被験生物として大腸菌を用いた重層により処理した（
Ｂ）。 ｃａｖ：粗製の顆粒抽出物（キャビテート）；ＣＭ：ＣＭ−セファロースカラム
から溶出したプールした活性フラクション（３０〜７５）。

【図７】 ＴＣ−１（Ａ）およびＴＣ−２（Ｂ）の電子スプレー質量分析を
示す。

【図８】 ＴＣ−１のＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ質量分析を示す。

【図９】 ＴＣ−２のＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ質量分析を示す。

【図１０】 系列希釈したＴＣ（濃度は示してある）の存在下でインキュベ
ートした大腸菌ＭＬ３５、S. aureus 42D、およびB. subtilis ATCC6633（０.５
〜１×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌ）に対するＴＣ−１（上部パネル）およびＴＣ−２（ 下部パネル）の抗菌活性を示す。インキュベーションの２時間後、細菌をプレー
ティングし、生存をコロニーカウンティングにより決定した。培地：１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７.０）＋１％ＴＢＳ。ＴＣ−２については０.３および０.７ μＭはS. aureusおよび大腸菌に対して試験しなかった。

【図１１】 ２時間インキュベーション後のＴＣ−２による細菌（１〜２×
１０⁵ｃｆｕ／ｍｌ）の殺菌を示す。

【図１２】 ＴＣ−２および還元ＴＣ−２の抗菌活性を示す。パネルＡ：銀
染色した酸性尿素ゲル。パネルＢ：酸性尿素ゲルの重層（被験生物：大腸菌）。
レーン１：ＴＣ−２；レーン２：還元しカルボキシメチル化したＴＣ−２；レー
ン３：β−メルカプトエタノール処理により還元したＴＣ−２。各レーンは約３
μｇのタンパク質を含む。

【図１３】 ＣＸＣケモカインの三次元構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 ネーデルランツェ・オルガニザーティ・フ ォール・ウェテンスハペレイク・オンデル ズーク オランダ、エヌエル−2593ベーエム、ザ・ ハーグ、ラーン・ファン・ニーウ・オース ト・インディア131番 (72)発明者 イェルーン・クレイフスフェルト オランダ、エヌエル−1091セーゼット・ア ムステルダム、ブラシウスストラート130 ／１番 (72)発明者 セバスティアヌス・アントニウス・ヨハネ ス・ザート オランダ、エヌエル−1181エヌヘー・アム ステルフェーン、ブルフェメースター・ハ スペルスラーン352番 (72)発明者 ヤコブ・ダンケルト オランダ、エヌエル−1396カーヘー・バー ムブルフェ、ドルプスストラート27番 (72)発明者 アルマ・ヨハナ・クエイペルス オランダ、エヌエル−7511ペーテー・エン スヘデ、ブレーヘルマンスガールデ134番 (72)発明者 ヘラルドゥス・ヘンリクス・マリア・エン エングベルス オランダ、エヌエル−7577エムベー・オル デンザール、フラーンデレンラーン３番 (72)発明者 ヤン・フェエイェン オランダ、エヌエル−7552ヘーデー・ヘン ゲロ、オーデ・フレンスウェッヒ96番

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特定の配置および４つのシステイン残基のジスルフィド結合
   を有する抗菌ペプチド。
2. 【請求項２】 図１３に示す三次元構造を有する、請求項１に記載の抗菌ペ
   プチド。
3. 【請求項３】 ＣＸＣケモカインである、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
4. 【請求項４】 図１Ａに標記ＴＣ−１により表示して示す配列の少なくとも
   一部を含み抗菌活性を有するトロンボシジン−１（ＴＣ−１）またはその変異体
   である、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
5. 【請求項５】 図１Ａに標記ＴＣ−２により表示して示す配列の少なくとも
   一部を含み抗菌活性を有するトロンボシジン−２（ＴＣ−２）またはその変異体
   である、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
6. 【請求項６】 組換えにより製造したものである、請求項１ないし５のいず
   れかに記載のペプチドまたはその変異体。
7. 【請求項７】 グラム陽性菌またはグラム陰性菌、たとえば、大腸菌（Esch
   erichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、Streptococcus sanguis、Stre
   ptococcus pneumoniae、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、および
   黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対して抗菌活性を示す、請求項１ ないし６のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体。
8. 【請求項８】 真菌、たとえば、Candida albicans、C. glabarata、Crypto
   coccus neoformans、Aspergillus flavus、A. fumigatus、およびPseudoallesch
   eria種に対して抗真菌活性を示す、請求項１ないし６のいずれかに記載のペプチ
   ドまたはその変異体。
9. 【請求項９】 該ペプチドの該変異体が、該ペプチドに対して少なくとも７
   ０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も
   好ましくは少なくとも９５％相同であり、抗菌活性を有する、請求項１ないし８
   のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体。
10. 【請求項１０】 Ｎ末端に追加のＨｉｓタグ配列を含み、Ｎ末端Ｈｉｓタグ
    を有しない同ペプチドに比べて一層強い抗菌活性を有する、請求項１ないし９の
    いずれかに記載のペプチドまたはその変異体。
11. 【請求項１１】 ヒトおよび動物における細菌感染症の治療に使用する、請
    求項１ないし１０のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体。
12. 【請求項１２】 細菌感染症が心内膜炎である、請求項１１に記載のペプチ
    ドまたはその変異体。
13. 【請求項１３】 ヒトおよび動物における細菌感染症の治療用医薬の製造の
    ための請求項１ないし１２のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体の使用
    。
14. 【請求項１４】 ヒトおよび動物における細菌感染症の予防のための放出系
    における請求項１ないし１２のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体の使
    用。
15. 【請求項１５】 細菌感染症が心内膜炎である、請求項１３または１４に記
    載のペプチドまたはその変異体の使用。
16. 【請求項１６】 ヒトおよび動物における真菌感染症の治療に使用するため
    の請求項１ないし１２のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体。
17. 【請求項１７】 真菌感染症が心内膜炎である、請求項１６に記載のペプチ
    ドまたはその変異体。
18. 【請求項１８】 ヒトおよび動物における真菌感染症の治療用医薬の製造の
    ための請求項１ないし１２のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体の使用
    。
19. 【請求項１９】 ヒトおよび動物における真菌感染症の予防のための放出系
    における請求項１ないし１２のいずれかに記載のペプチドまたはその変異体の使
    用。
20. 【請求項２０】 真菌感染症が心内膜炎である、請求項１８または１９に記
    載のペプチドまたはその変異体の使用。
21. 【請求項２１】 追加のＨｉｓタグ配列を有しない同ペプチドに比べて一層
    強い抗菌活性を有する抗菌ペプチドの製造のためのＨｉｓタグ配列の使用。