KR19990082383A - 항균성 펩티드 및 이의 사용법 - Google Patents

항균성 펩티드 및 이의 사용법 Download PDF

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KR19990082383A
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마이클 이. 셀스테드
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스티븐슨 린다 에스.
더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 소 및 쥐 호중구로부터 유래된 신규 항균성 펩티드를 제공한다. 소 과립구 펩티드 A (BGP-A) 및 쥐 과립구 펩티드 A (MGP-A) 라 명명된 상기 펩티드는 말초성 혈액 과립구로부터 균질하게 정제된다. BGP-A 및 MGP-A 의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 또한 제공된다. 또한 합성 BGP-A 및 MGP-A 도 제공된다. 정제된 BGP-A 펩티드는 천연 BGP-A 와 구별할 수 없을 정도의 항균 활성을 갖는 것으로 나타났다. 또한 BGP-A 및 MGP-A 의 합성 카르복스아미드화된 유사체 (각각, BGP-A-아미드 및 MGP-A-아미드) 도 제공된다.

Description

항균성 펩티드 및 이의 사용법
본 발명은 미국 국립 위생 연구소가 수여한 승인번호 제 AI22931 호의 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
다형핵백혈구 (호중구, 과립구, PMNs) 의 세포질 과립은 이들 세포들로 하여금 섭취된 미생물 표적을 "산소 독립적" 이라 여겨지는 메카니즘 (Lehrer, R. I.,et al., Blood 76:2169-2181. 1990) 을 통해 불활성화시키도록 하는 항균성 펩티드를 함유한다. 상기 과립 단백질은 디펜신 (defensins) (Selsted, M. E.,et al., Trends in Cell Biology 5:114-119, 1995), β-디펜신 (Selsted, M.E.,et al., J. Biol. Chem. 268:6641-6648, 1993), 인돌리시딘 (Selsted, M.E.,et al., J. Biol. Chem. 267:4292-4295, 1992), 및 파고라이소솜 (phagolysosome) 융합중에 파고솜 (phagosome) 내로 방출되는 기타 광범위한 스펙트럼의 항생성 펩티드를 포함하는 항균성 물질의 집적체를 구성한다. 현재까지, 디펜신류의 구성원이 인간의 호중구 (Ganz, T.,et al., J. Clin. Invest. 76:1427-1435, 1985), 토끼의 호중구 (Selsted, M.E.,et al., J. Biol. Chem. 260:4579-4584, 1985), 쥐의 호중구 (Eisenhauer, P.,et al., Immun. 58:3899-3902, 1990), 및 기니 피그 유래의 호중구 (Selsted, M.E.,et al., Infect. Immun. 55:2281-2286, 1987), 및 가장 최근에는 마우스 소장의 파네트 (Paneth) 세포 (Selsted, M.E.,et al., J. Cell Biol. 118:929-936, 1992) 로부터 분리된 바 있다. β-디펜신은 소 호중구의 거대 과립구 (Selsted, M.E.,et al., J. Biol. Chem. 268:6641-6648, 1993), 소 기관지 상피세포 (Diamond, G.M.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3952-3956, 1991), 및 인간 혈장 (Bensch, K. W.,et al., FEBS Lett. 368:331-335) 으로부터 분리된 바 있으며, 인돌리시딘은 소 PMN 의 거대 과립구의 한 성분이다 (Van Abel, R. J.,et al., Int. J. Peptide Protein 45:401-409, 1995).
반추 과립구의 독특한 특성은, 송아지, 염소, 양, 및 야생 염소 (ibex) 의 호중구는 종래의 아주로필 (azurophil) 및 특정 과립과 구별되는 다수의 매우 큰 세포질 과립을 갖고 있음을 증명한, 게나로 (Gennaro) 및 바기올리니 (Baggiolini)등 (Baggiolini, M.,et al., Lab. Invest. 52:151-158, 1985; Gennaro, R.,et al, J. Cell Biol. 96:1651-1661, 1983) 에 의해 최초로 기재되었다. 계속된 연구는 소 호중구의 대부분의 항박테리아성 펩티드가 상기 독특한 소기관에 들어있음을 입증하였다. 로메오 (Romeo) 및 게나로는 소 호중구의 거대 과립이 디펜신과는 구조적으로 다른 강력한 살균성 펩티드를 함유하고 있음을 증명하였다 (Gennaro, R.,et al., Infect. Immun. 57:3142-3146, 1989; Romeo, D.,et al., J. Biol. Chem. 263:9573-9575, 1988). 상기 펩티드로는 박테네신 (bactenecin) 이라 명명된, 세 개의 아르기닌-풍부한 펩티드가 포함되는데, 이는 시험관내에서 다수의 그람 양성 및 그람 음성 박테리아를 효율적으로 죽인다. 최근, 소 호중구로부터 신규 트리데카펩티드 (tridecapeptide) 아미드인 인돌리시딘이 분리 및 특성화 된 것이 보고된 바 있다 (Selsted, M.E.,et al, J. Biol. Chem. 267:4292-4295, 1992). 상기 양이온성 펩티드는 트립토판이 매우 풍부하며, 이 콜라이 (E. coli)및 S. 아우레우스 (S. aureus) 에 대해 강력한 살균 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 보다 최근에는 상기 펩티드가 디펜신과 공유결합성이 상이한 반면 유사한 입체구조를 갖는 것이 소 호중구로부터의 13 β-디펜신의 분리를 통해 증명되었다 (Selsted, M.E.,et al., J. Biol. Chem. 268:6641-6648, 1993).
발명의 요약
본 발명은 항균제로서 유용한 펩티드를 제공한다. 본 발명은 소 말초성 혈액 과립구로부터 신규 트리데카펩티드의 발견으로부터 유래하였다. 정제된 펩티드 및 이들의 카르복스아미드 유사체는 강력한 항박테리아, 항바이러스, 항원생동물, 및 항진균 활성을 갖는다. BGP-A 및 MGP-A 라 명명된 상기 펩티드는 의학 및/또는 수의학, 또는 예컨데 농업, 식품 과학, 또는 산업적 용도에 사용될 제제로써 효과적인 화합물이다.
본 발명의 바람직한 구현예의 세부 사항은 첨부된 도면 및 하기의 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 세부 사항이 공지되고 나면, 당 분야의 숙련자에게는 여러가지 추가적인 고안 및 변형이 명백해질 것이다.
본 발명은 전반적으로 항균성 펩티드, 및, 보다 구체적으로, 소 과립구 펩티드-A (BGP-A), 소 과립구 펩티드-A-아미드 (BGP-A-아미드), 쥐 과립구 펩티드-A (MGP-A) 및 쥐 과립구 펩티드-A-아미드 (MGP-A-아미드) 로 명명된 펩티드 및 이들의 사용법에 관한 것이다.
도 1 은 BGP-A 정제의 크로마토그래프를 나타낸다. 도 1a 는 소 호중구 과립 추출물의 겔 여과 크로마토그래피를 나타낸다. 도 1b 는 피이크 E 분획의 역상 HPLC 를 나타낸다.
도 2 는 정제된 BGP-A 의 분석 결과를 나타낸다. 도 2a 는 분석 RP-HPLC 를 나타낸다. 도 2b 는 정제된 BGP-A 의 산-요소 겔을 나타낸다.
도 3 은 정제된 BGP-A 및 BGP-A-아미드의 산-요소 PAGE 를 나타낸다.
도 4 는 BGP-A 의 cDNA 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 2) 및 추정된 전구체 아미노산 펩티드 서열 (서열 번호: 3) 을 나타낸다.
도 5 는 MGP-A 의 cDNA 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 4) 및 추정된 전구체 아미노산 펩티드 서열 (서열 번호: 5) 을 나타낸다.
도 6 은 숙성한 BGP-A (서열 번호: 6) 및 MGP-A (서열 번호: 7) 아미노산 서열을 나타낸다. 빗금친 부분은 BGP-A 및 MGP-A 간의 보존된 동일한 아미노산을 나타낸다. 공통 펩티드 아미노산 서열은 서열 번호: 1 이라 명명된다.
도 7 은 천연 및 합성 BGP-A 및 합성 BGP-A-아미드의 살균 활성을 나타낸다.
본 발명의 핵산 및 아미노산 서열, 조성물, 시약 및 방법 및 이들의 용도를 기재하기에 앞서, 상기 조성물, 시약, 서열 및 방법은 가변적일 수 있으므로 본 발명이 본문에 기재된 특정 조성물, 시약, 서열 및 방법에 국한되지 않는다는 것을 숙지해야 한다. 또한 본문에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하려는 목적으로 사용되었고, 본문에 사용된 용어는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니라는 것을 숙지해야 한다.
본문 및 첨부된 청구항에 사용된 바에 따르면, 단수형으로 표시된 용어는 별도의 명확한 지시가 없는한 언급 대상의 복수형도 포함한다. 따라서, 예컨데 "시약" 에 대한 언급은 하나 또는 그 이상의 상이한 시약을 포함하고, "항체" 에 대한 언급은 하나 또는 그 이상의 상이한 항체를 포함하며, "방법" 에 대한 언급은 본문에 기재된 방법을 변형 또는 대체할 수 있는, 당 분야의 숙련자에게 공지된 동등한 단계 및 방법들을 포함한다.
별도로 정의되지 않은 한, 본문에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 적용되는 분야의 숙련자가 일반적으로 숙지하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본문에 기재된 것들과 유사 또는 동등한 어떠한 방법, 조성물, 시약, 서열도 실제로 또는 본 발명을 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 본문에 기재되어 있다. 본문에 언급된 모든 문헌은, 인용된 참고 문헌과 관련한 특정 정보를 기재 및 개시하기 위해, 모든 도면, 그래프, 식, 실례, 및 그림을 포함해, 본문에 반영되었다.
상기 기재된 문헌은 본 특허의 출원일 전에 개시된 것만 제공되었다. 본문의 어떠한 내용도 종래 발명으로 인해 상기 개시를 앞서지 않는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 기재된 바람직한 구현예 및 실시예는 본 발명의 한정이라기 보다는 실례로서 받아들여야 한다.
소 과립구 β-디펜신의 정제 도중, 종래에 특성화된 어떠한 것과도 상이한, 작은 펩티드와 관련된 항균 활성이 검출되었다. 본문에 소 과립구에서 발현되는 13 잔기로 이루어진 펩티드 항생물질인 BGP-A 의 정제, 서열분석, 합성, cDNA 분리, 및 항균 특성이 기재되어 있다. 또한 마우스 골수로부터 분리되고 MGP-A 라 명명된, BGP-A 의 마우스 상동체에 대한 cDNA 도 기재되어 있다. 추정된 MGP-A 전구체는 BGP-A 의 것과 매우 유사하다. 또한 본 발명은, 각각 BGP-A 및 MGP-A 의 유사체인, BGP-A-아미드 및 MGP-A-아미드의 합성 및 항균 특성을 알려준다.
본 발명은 광범위한 항균 활성 및 항원생동물 활성을 나타내며, 따라서 효과적인 항균제인 소 과립구 펩티드 -A (BGP-A) 및 마우스 과립구 펩티드 -A (MGP-A) 라 명명된 펩티드 분자, 및 BGP-A-아미드 및 MGP-A-아미드라 명명된 그들의 합성 카르복사미드를 제공한다. BGP-A 및 MGP-A 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 항균성 펩티드 유전자의 새로운 부류를 대표한다. 반추류 및 설치류에서의 전구체 구조의 높은 보존도에 의해 증명된 바와 같이, 상기 유전자 족은 보존도가 매우 높은 것으로 나타난다. 인돌리시딘의 형성 (Selsted, M.E.,et al., Peptides: Chemistry and Biology, ESCOMJ.A. Smith and J.E. Rivier, 1992, pp. 905-907) 과 유사한 방식으로, 펩티드는 거대한 프레프로펩티드 형태로 합성된 후 단백질 분해 가공의 숙성 생성물로서 과립 형태로 포장된다. BGP-A 및 MGP-A 펩티드의 분리 및 정제에 사용되는 방법은 종래에 디펜신과 유사한 펩티드에 사용된 것과 유사하며; 상기 방법은, 본문에서 참고 문헌으로서 전체가 반영된, 미국 특허 제 4,453,252 호, 제 4,659,692 호, 제 4,705,777 호 및 제 5,242,902 호에 기재되어 있다.
본문에 사용된 바에 따르면, "항균 활성" 이란 용어는 미생물의 증식을 억제 또는 비가역적으로 예방하는 화합물의 능력을 가리킨다. 상기 억제 또는 예방은 살균 작용 또는 미생물 증식 억제를 통해 이루어질 수 있다. 따라서, 본문에 사용된 "살균 억제" 또는 "미생물 증식의 억제" 란 용어는 표적 유기체를 죽이거나 결정적으로 손상시킬 수 있는 항균성 펩티드의 능력을 가리킨다. 본문에 사용된 "미생물 증식 억제" 라는 용어는 표적 유기체가 죽지않고 증식하는 것을 억제하는 것을 가리킨다. 살균 또는 미생물 증식 억제는 현재 미생물 증식이 일어나는 환경 (즉, 치료) 또는 상기 증식을 유지하거나 지원할 위험이 있는 환경 (즉, 예방 또는 예방조처) 에 적용될 수 있다.
본문에 사용된 바에 따르면, "미생물 증식을 유지 또는 지원할 수 있는 환경" 이란 용어는 미생물 증식이 일어날 수 있거나 또는 미생물이 존재할 수 있는 유동체, 조직, 공간, 기관, 지표면 물질 또는 유기체를 가리킨다. 상기 환경은, 예컨데, 동물 조직; 가죽 또는 체액, 물 및 기타 액체, 식품, 식료품 또는 식품 추출물, 지표면, 곡물 및 특정 무생물일 수 있다. 환경이 미생물의 증식을 촉진할 필요는 없고, 다만 미생물의 생존을 허용하기만 하면 된다.
BGP-A 또는 MGP-A 의 항균, 또는 항박테리아 활성은 다양한 병원체에 대해 당 분야의 통상적인 기법을 이용해 측정될 수 있다. 미생물을 적절한 농도로 증식시키고, 아가로세트립티카제 소이 (agarosetrypticase soy) 배지와 같은 적절한 배지와 혼합하여, BGP-A 또는 MGP-A 와 접촉시킨다. 적절한 항온배양 후, 항균 활성은 항박테리아성 시료 둘레의 투명한 영역을 통해 분명하게 나타난다. 투명한 영역은 펩티드의 농도에 따라 달라진다. 항균 활성을 측정하는 그 외의 방법들이 실시예 5 및 본문의 "재료 및 방법" 이란 제목의 섹션에 제시되어 있으며, 당 분야의 숙련자들에게 일반적으로 공지되어 있다.
더욱이, 항균 활성을 나타내는 BGP-A 또는 MGP-A 의 최소 억제 농도 (MIC) 는 표준 기법에 따라 많은 상이한 미생물에 대해 측정될 수 있다. 요약하자면, 세포를 적절한 박테리아성 배지에서 하룻밤동안 약 37℃ 에서 증식시키고, 동일한 배지중에 희석시켜 약 104내지 105CFU/ml 의 농도가 되게 한다. 배양액 희석은, 예컨데, 계단 희석된 미생물 및 펩티드의 조합을 혼합하며, 96 웰 마이크로티터 플레이트에서 실시된다. 계단 희석된 박테리아, 또는 계단 희석된 펩티드 농도를 갖는 기타 미생물의 첨가 후, 플레이트를 약 37℃ 에서 하룻밤동안 항온배양한다. 다음날 웰 내의 미생물 증식의 존재 또는 부재에 대해 플레이트를 채점하고, 상기 채점으로부터 MIC 를 측정한다.
본문에 사용된 바에 따르면, BGP-A, BGP-A-아미드, MGP-A 및 MGP-A-아미드란 용어는 일반적으로 약 8 내지 20 개의 아미노산을 가지며 최종적으로 양전하를 갖는 사슬을 이루는 펩티드 또는 펩티도미메틱 (peptidomimetics) 을 가리킨다. 다시 말해서, 이들은 양이온성 펩티드이다. 본 발명의 펩티드는 바람직하게 하나 또는 그 이상의 방향족 아미노산을 갖는다. 예시적인 펩티드 서열이 도 4-6 에 나와 있으며 서열 번호: 1, 3, 5, 6 및 7 에 기재된 바와 같다.
BGP-A cDNA 의 전체 길이는 688 뉴클레오티드 (서열 번호: 2) 이며 190 잔기 (서열 번호: 3) 로 이루어진 21 kD 의 전구체 단백질을 나타낸다. 전구체 펩티드 내의, 처음 21 잔기중 11 개는 소수성이므로 시그날 펩티드를 나타낸다. 시그날 펩티드 영역 다음에 156 잔기를 함유하는 개재 프로펩티드 영역이 뒤따른다. 전구체의 마지막 13 개의 잔기는 숙성한 BGP-A 펩티드 서열, YKIIQQWPHYRRV (서열 번호: 6) 에 해당한다.
MGP-A cDNA 의 전체 길이는 679 뉴클레오티드 (서열 번호: 4) 이며, BGP-A 에 대해 기재된 것과 유사한 시그날 프로펩티드 영역 (도 5) 을 함유하는 전구체 펩티드 (서열 번호: 4) 를 나타낸다. 쥐 MGP-A cDNA 를 통해 예측된 숙성한 펩티드 서열은 BGP-A 의 13 잔기중 7 개와 동일하다 (YQVIQSWEHYRE) (도 6; 서열 번호: 7). 숙성한 BGP 및 MGP 펩티드간의 공통 서열이 도 6 에 기재되어 있으며, 빗금친 부분은 BGP-A 및 MGP-A 사이 및 아미노산 서열 YXXIQXWXHYR (이중 X 는 임의의 아미노산) 을 갖는 서열 번호: 1 에 있어서 보존된 동일한 아미노산을 나타낸다. 본 발명의 펩티드는 서열 번호: 1 공통 서열을 포함한다. 특정 이론에 얽매이지 않길 바라며, C-말단은 최종적으로 양전하를 띠어야 분자가 활성을 유지할 수 있는 것으로 여겨진다. 예컨데, 서열 번호: 1, 6 및 7 은 모두 아르기닌 (R) 잔기로 끝나며, 서열 번호: 6 은 아르기닌 (R) 및 발린 (V) 으로 끝나고, 서열 번호: 7 은 글루탐산 (E) 잔기로 끝난다. 본 발명이 마우스 및 소 간의 공통 서열 및 본 발명의 펩티드를 코딩하는 각각의 DNA 서열을 제공한다는 전제하에, 일반 숙련자가 본문에 기재된 내용 및 당 분야의 통상적인 방법 (Maniatis,et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, current edition, 본문에 참고용으로 인용됨) 을 사용해 인간, 돼지, 양 등을 비롯한 다른 종으로부터 상동 BGP/MGP 서열을 분리하는데는 과다한 실험이 필요치 않을 것이다.
펩티드의 항균 활성을 감소시키지 않은채 BGP-A 또는 MGP-A 아미노산 서열을 다양하게 변형시킬 수 있다는 것을 다행으로 여겨야 한다. 아미노산 첨가, 결실 또는 치환을 포함한 상기 변형을 보이는 BGP-A 또는 MGP-A 의 펩티드 또는 펩티도미메틱이 본 발명의 범위내에 들도록 의도되었다. 본문에 사용된 바에 따르면, "실질적으로 동일한 서열" 이란 용어는, 예컨데, 도 4, 5, 및 6 및 서열 번호: 1, 3, 5, 6 및 7 에 나와 있는 BGP-A 또는 MGP-A 서열과 동일하거나, 또는 상당한 상동성을 갖는 펩티드 서열을 가리킨다. 강화된 기능의 결과를 가져오는 제한된 변형이 펩티드에 주어질 수 있음을 숙지해야 한다. 마찬가지로, 펩티드의 생물학적 기능을 파괴하지 않은채 제한된 변형을 줄 수 있으며 전체적인 1차 구조중 일부만이 활성에 영향을 미치는데 필요하다는 것 또한 숙지해야 한다. 예컨데, 활성을 완전히 파괴시키지 않는 상기 서열의 미미한 변형 또한 상기 정의 및 상기와 같이 청구된 화합물의 정의에 속한다. 변형에는, 예컨데, 아미노산 잔기의 첨가, 결실, 또는 치환, 아미노산 구조 또는 기능을 모방하는 화합물로의 치환 뿐만 아니라 아미노 및 아세틸기와 같은 화학적 부분의 첨가가 포함될 수 있다. 변형은 계획적이거나, 또는 항균 활성을 나타내는 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드를 생성하는 숙주내의 변이를 통해 일어나는 경우와 같이 우발적일 수 있다. 상기 모든 변형은 펩티드가 항균 활성을 유지하는한 포함된다.
어떤 경우엔, 하나 또는 그 이상의 비천연 아미노산을 본 발명의 합성 펩티드에 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 비천연 아미노산은 통상적으로 하나 이상의 N-말단 및 C-말단을 가질 것이며 천연 아미노산 카운터파트와 동일하거나 화학적으로 변형 또는 치환된 측쇄를 가질 것이다. 비천연 아미노산의 예로 자연-발생적 L-아미노산의 광학 이성질체가 있다. 모든 펩티드가 L-아미노산을 이용해 합성되지만, 펩티드의 모든 D 형은 합성하여 제조될 수 있다. 더욱이, C-말단 메틸 에스테르와 같은 C-말단 유도체를 제조하여 본 발명의 펩티드의 항균 활성을 증가시킬 수 있다. 수많은 변형을 본 발명에 따라 기대할 수 있다. 천연 서열의 특정 잔기를 대체시키는 명백한 시도외에, 대안이 되는 구현예로는 D-아미노산으로부터 펩티드를 합성함으로써 단백질분해효소에 의한 잠재적인 비활성화를 감소시키는 것이 포함된다. 상기 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (예컨데, Wadeet al., PNAS, USA 87:4761-4765, 1990 참고). 화학적 변형 또는 치환의 예로는 천연 아미노산내의 C-H 결합의 히드록실화 또는 플루오르화가 포함될 수 있다. 상기 기법은 생물학적 화합물의 약물 유사체의 제조에 사용되며 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 펩티드의 변형은 카르복시 말단 아미드에 의한 변형으로 이루어진다. 당 분야의 숙련자는 유사한 치환을 통해 보다 높은 항균 활성 및 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 펩티드를 수득할 수 있다. 예컨데, 본 발명은, 펩티드의 항균 활성이 유지되는 한, 서열 번호: 1, 3, 5, 6 및 7 에 기재된 펩티드 뿐만 아니라, 그의 유사체, 유도체 또는 기능성 단편들도 포함한다. 본 발명의 펩티드의 1 차 아미노산 서열의 미미한 변형은 본문에 기재된 서열 번호: 1, 3, 5, 6 및 7 에 기재된 특정 펩티드와 비교해 실질적으로 동등한 항균 활성을 갖는 펩티드를 생성시킬 수 있다. 상기 변형은 특정 부위의 돌연변이 유발과 같이 계획적이거나, 또는 자발적일 수 있다. 상기 변형에 의해 생성된 모든 펩티드는 원형 펩티드의 항균 생물학적 활성이 존재하는 한 본문에 포함된다. 본 발명의 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드에는 또한, BGP-A 또는 MGP-A 활성이 유지되는 한, 펩티드의 기능성 단편 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 기능성 단편도 포함된다. 또한 BGP-A 또는 MGP-A 의 생물학적 활성을 함유하는 더 작은 펩티드, 및 펩티드 전체 또는 기능성 단편을 코딩하는 작은 핵산 서열도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 펩티드 기능성 단편 또는 펩티드 기능성 단편을 코딩하는 핵산 서열의 상대적 효능은 당 분야의 숙련자에 의해 펩티드 단편에 대한 미생물의 민감성을 입증함으로써 쉽게 측정될 수 있다. 펩티드 기능성 단편의 효능은, 각각 서열 번호: 6 또는 7 의 BGP-A 또는 MGP-A 의 살균력을 기준으로 측정되는, 단편 또는 상기 단편을 코딩하는 핵산 서열의 잠재적인 살균 활성 또는 미생물 증식 억제 활성을 측정함으로써 산정된다. 테스팅은 본문의 재료 및 방법 섹션내의 "항균성 검정" 이란 표제의 섹션 및 본 발명의 실시예 5 에 기재된 바대로, 또는 당 분야의 숙련자에게 통상적으로 공지된 기타 표준 항균 테스트 (예컨데, MIC) 를 통해 수행된다.
더욱이, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실 또한, 생물학적 활성은 변화시키지 않은채, 생성된 펩티드의 구조 변형을 일으킬 수 있다. 이는 유용한 작은 활성 펩티드의 개발을 유도할 수 있다. 예컨데, 특정 펩티드의 생물학적 활성에 필요하지 않은 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산은 제거될 수 있다. 본 발명의 펩티드에는, 본문에 기재된 생물활성이 유지되는 한, 본 발명에서 개시된 펩티드의 어떠한 유사체, 상동체, 변이체, 이성질체 또는 유도체도 포함된다. 본 발명의 방법 및 조성물 또한 BGP-A, MGP-A, BGP-A-아미드, 또는 MGP-A-아미드에 기능적으로 상응하는 생물학적 활성을 갖는 합성 비펩티드성 조성물을 사용할 수 있다. "기능적으로 상응하는" 이란, 비펩티드성 분자의 형태, 크기, 유연성, 및 전자 배치가 상기 분자의 생물학적 활성이 BGP-A, MGP-A, BGP-A-아미드, 또는 MGP-A-아미드 펩티드와 유사하도록 되는 것을 의미한다. 특히, 비펩티드성 분자는 상응하는 항균 활성을 나타내야 한다. 상기 비펩티드성 분자는 약 100 내지 1000 달톤 범위내의 분자량을 가진 작은 분자일 수 있다. 상기 작은 분자의 사용은 약리학적 조성물의 제조에 있어서 유리하다.
상기 비펩티드성 유사체 분자의 확인은 약제 설계 분야에 공지된 기법을 사용해 수행될 수 있다. 상기 기법에는, 모두 과학적 문헌에 자세히 기재되어 있는, 자가-조화성 필드 (SCF) 분석, 콘피겨레이션 상호작용 (CF) 분석, 및 노말 모드 다이나믹 (normal mode dynamics) 컴퓨터 분석이 포함되지만, 이들에 국한되지는 않는다. (예컨데, Rein et al.,Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions,Alan Liss, N.Y., (1989) 참고). 확인된 화합물의 제조는 화합물의 목적하는 특성에 따라 달라질 것이며 표준 화학적 합성 기법을 수반할 것이다 (Cary et al.,Advanced Organic Chemistry,part B, Plenum Press, New York (1983) 참고).
본문에 사용된 "보존형 변이" 라는 용어는 또다른, 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 아미노산 잔기가 교체되는 것을 의미한다. 보존형 변이의 예로는 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌과 같은 소수성 잔기의 또다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 라이신에 대한 아르기닌으로의 치환, 아스파르트산에 대한 글루탐산으로의 치환, 또는 아스파라긴에 대한 글루타민으로의 치환 등과 같은 극성 잔기의 또다른 극성 잔기로의 치환이 포함된다. 또한 "보존형 변이" 라는 용어는 치환된 펩티드에 대한 항체가 비치환된 펩티드와도 면역반응한다는 전제하에 비치환된 모 아미노산 대신 치환된 아미노산을 사용하는 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드는, 자동 펩티드 합성기의 사용, 재조합 방법 또는 공지된 펩티드 수동 합성법과 같은, 당 분야에 널리 공지된 방법들에 의해 합성될 수 있다. 또한, 백혈구 및 척추 동물의 골수, 바람직하게는 포유류의 골수와 같은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다. 상기 세포 또는 조직은 당 분야의 숙련자에게 널리 알려진 방법을 통해 수득될 수 있다.
본문에 사용된 "실질적으로 순수한" 이라는 용어는 자연적으로 결합된 기타 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질로부터 실질적으로 유리된 BGP-A 또는 MGP-A 핵산 또는 단백질을 가리키거나, 또는 상기 펩티드 또는 단백질이 생체내 세포 환경으로부터 분리된 것을 의미한다. 분리 및 정제로 인해, 실질적으로 순수한 펩티드 및 단백질은 분리되지 않은 불순한 펩티드 또는 단백질과는 달리 유용하다. 당 분야의 숙련자는 표준 단백질 정제 기법을 사용해 BGP-A 또는 MGP-A 를 정제할 수 있다. 실질적으로 순수한 펩티드는 산-요소 겔상에 하나의 주된 밴드로 나타날 것이다. 또한 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드의 순도는 아미노-말단 아미노산 서열 분석 및 분석 RP-HPLC 에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 BGP-A 또는 MGP-A 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드에는 BGP-A 또는 MGP-A 를 코딩하는 DNA, cDNA 및 RNA 서열이 포함된다. 또한, BGP-A 또는 MGP-A 의 전부 또는 일부를 코딩하는 모든 폴리뉴클레오티드도, BGP-A 또는 MGP-A 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 한, 여기에 포함된다는 것을 숙지해야 한다. 상기 폴리뉴클레오티드에는 자연 발생적, 합성, 및 의도적으로 조작된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 예컨데, BGP-A 또는 MGP-A 폴리뉴클레오티드에 특정 부위 변이유발을 실시할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 결과로 축퇴된 서열을 포함한다. 20 개의 천연 아미노산이 존재하며, 이들 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 따라서, 축퇴된 모든 뉴클레오티드 서열은, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드의 아미노산 서열의 기능이 변하지 않는한, 본 발명에 포함된다. BGP-A 또는 MGP-A 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 도 4 및 5 (서열 번호: 2 및 4) 의 뉴클레오티드 서열, 및 상보 핵산 서열을 포함한다. 상보 서열은 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 서열이 RNA 인 경우, 서열 번호: 2 및 4 의 디옥시뉴클레오티드 A, G, C, 및 T 가 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C, 및 U 에 의해 교체된다. 또한 상기 기재된 핵산 서열의 단편으로서, 생리적 조건하에, 도 4 및 5 (서열 번호: 3 및 5) 의 단백질을 코딩하는 DNA (서열 번호: 2 및 4) 에 선택적으로 혼성화 되기에 충분한, 15 염기 이상의 길이를 갖는 단편도 본 발명에 포함된다.
또한, BGP-A 또는 MGP-A 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 이들을 함유하는 벡터 및 숙주 세포 및 재조합에 의해 생성된 펩티드를 제공하기 위한 발현 방법도 본 발명에 의해 제공된다. 상기 방법은 펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를, 핵산을 전달 및/또는 번역하는데 적합한 조건하에서, 증식시키고 이렇게 생성된 펩티드를 분리하는 것으로 구성된다.
본 발명의 펩티드가 분리된 후, 펩티드를 코딩하는 핵산은 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 분리된다. 상기 분리된 핵산은 벡터에 결찰되고 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 도입된다. 세포내 핵산의 결찰 및 발현 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (Maniatis,et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, current edition 참고).
BGP-A 또는 MGP-A 코딩 서열의 활성 부위를 함유하는 cDNA 서열이 본문에 구체적으로 개시되어 있다. 당 분야의 숙련자는 상기 서열을 이용해 다른 완전한 길이의 클론을 분리할 수 있다. 완전한 길이의 BGP-A cDNA 는 길이가 688 뉴클레오티드 (서열 번호: 2) 이며, 190 잔기로 이루어진 21 kD 전구체 (도 4; 서열 번호: 3) 가 예상되어진다. BGP-A 전구체내, 최초의 21 잔기 중 11 개는 소수성으로 시그날 펩티드인 것이 예측되어진다 (Von Heijne, G.,Eur. J. Biochem. 133:17-21, 1983). 시그날 펩티드 영역에 156 잔기를 함유하는 개재 프로펩티드 영역이 뒤따른다. 전구체의 최종 13 잔기는 숙성한 BGP-A 펩티드 서열 (서열 번호: 6) 에 해당한다. 완전한 길이의 MGP-A cDNA 는 길이가 679 뉴클레오티드 (서열 번호: 4) 이며, BGP-A 에 대해 기재된 것 (도 5; 서열 번호: 5) 과 유사한 시그날 프로펩티드 영역으로 구성된 전구체가 예측되어진다. 상기 유사성을 근거로, 쥐 골수 cDNA 로부터 분리된 상기 서열은 쥐 호중구 펩티드 A (MGP-A; 도 5; 서열 번호: 5 및 7) 라 명명된다. 쥐 cDNA 에 의해 예측되어지는 숙성한 펩티드 서열은 13 잔기 중 7 잔기가 BGP-A 와 동일하다 (도 6; 서열 번호: 7). 도 6 의 빗금친 부분은 BGP-A 및 MGP-A 간에 보존된 동일한 아미노산을 나타낸다. 공통 펩티드 아미노산 서열은 YXXIQXWXHYR (서열 번호: 1) 이며, 이중 X 는 임의의 아미노산이다.
본 발명의 DNA 서열은 몇몇 방법을 통해 수득될 수 있다. 예컨데, DNA 는 당 분야에 널리 공지된 혼성화 기법을 이용해 분리될 수 있다. 상기 기법에는 하기가 포함되지만, 이들에 국한되지는 않는다: 1) 상동 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 게놈성 또는 cDNA 라이브러리와 탐침간의 혼성화, 2) 목적 DNA 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 사용한 게놈성 DNA 또는 cDNA 에 대한 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 및 3) 공통된 구조적 특징을 갖는 클론된 DNA 단편을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝. 핵산 분자 한 쌍 (또는 단일 핵산 분자내의 두 영역) 의 서열은, 같은 쪽의 뉴클레오티드간 및 다른 쪽의 뉴클레오티드간에 염기쌍 상호작용이 일어날 수 있는 경우, 서로 "상보적" 이라 말한다. 핵산 분자 한 쌍 (또는 단일 핵산 분자내의 두 영역) 은, 서로간의 염기쌍 상호작용에 의해 2 사슬 분자가 형성될 경우, 서로 "혼성화" 되었다고 한다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 핵산 쌍간의 혼성화는 혼성화 영역간의 완전한 상보성을 필요로 하지는 않고, 다만 사용되는 혼성화 조건하에서 2 사슬 분자를 유지하기에 충분한 염기쌍 수준만이 필요하다.
혼성화 반응은, 특정 및 몇몇 비특정 상호작용이 일어날 수 있는, 낮거나 보통의 엄격한 조건하에서 전형적으로 수행된다. 혼성화 후, 보통 또는 높은 엄격한 조건하에서 세척을 수행하여 비특정 결합을 제거할 수 있다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 최상의 세척 조건은, 예컨데, 엄격함을 점차 증가시킴으로써, 실험적으로 측정할 수 있다. 변화시키므로써 엄격함에 영향을 줄 수 있는 조건 매개변수에는, 예컨데, 온도 및 염 농도가 포함된다. 일반적으로, 염 농도가 낮고 온도가 높을수록, 엄격함이 높아진다. 예컨데, 혼성화 용액과 동일하거나 그보다 낮은 염 농도를 함유하는 용액을 사용해 낮은 온도 (예컨데, 상온) 에서 세척을 개시할 수 있다. 그 후의 세척은 동일한 염 농도의 점진적으로 보다 따뜻한 용액을 사용해 수행될 수 있다. 이와는 달리, 세척 단계에서 염 농도를 낮추고 온도를 유지하거나, 또는 염 농도를 낮추고 온도를 증가시킬 수도 있다. 예컨데, 포름아미드와 같은 불안정화제의 사용을 비롯한 별도의 매개변수를 변화시켜 엄격함에 영향을 줄 수도 있다.
핵산 혼성화 반응에서, 특정 수준의 엄격함을 달성하기 위해 사용되는 조건은, 혼성화 대상 핵산의 성질에 따라, 달라질 것이다. 혼성화 조건을 선택하는데 있어서, 예컨데, 핵산의 혼성화 영역의 길이, 상보성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성 (예컨데, GC v. AT 함량), 및 핵산 타입 (예컨데, RNA v. DNA) 이 고려될 수 있다. 추가적으로 고려해야할 사항은 핵산 중 하나가, 예컨데, 필터에 고정되는지의 여부이다.
점진적으로 높아지는 엄격함 조건의 예는 다음과 같다: 상온에서 2 x SSC/0.1% SDS (혼성화 조건); 상온에서 0.2 x SSC/0.1% SDS (낮은 엄격함 조건); 약 42℃ 에서 0.2 x SSC/0.1% SDS (보통의 엄격함 조건); 및 약 68℃ 에서 0.1 x SSC (높은 엄격함 조건). 상기 조건 중 단 하나, 예컨데, 높은 엄격함 조건만을 사용하거나, 또는 각각의 조건을, 예컨데 10 - 15 분씩, 상기 기재된 순서대로 사용해, 기재된 단계의 일부 또는 전부를 반복함으로써 세척을 수행할 수 있다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 최상의 조건은, 수반되는 특정 혼성화 반응에 따라, 달라질 것이며 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 BGP-A 또는 MGP-A 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 포유류, 및 가장 바람직하게는 마우스, 소, 또는 인간으로부터 유래된다. 핵산 혼성화에 의존하는 스크리닝 방법은, 적절한 탐침만 있다면, 어떠한 유기체의 어떠한 유전자 서열도 분리할 수 있게 한다. 목적하는 단백질을 코딩하는 서열 일부에 해당하는 올리고뉴클레오티드 탐침은 화학적으로 합성될 수 있다. 상기 과정은 아미노산 서열의 짧은, 올리고펩티드 서열이 공지되어야만 가능하다. 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 유전 암호로부터 추정될 수 있지만, 암호의 축퇴를 감안해야 한다. 서열이 축퇴된 경우, 혼합 첨가 반응을 수행할 수 있다. 변성된 이중-사슬 DNA 의 비균질성 혼합물이 여기에 포함된다. 상기 스크리닝을 위해, 혼성화가 바람직하게 단일사슬 DNA 또는 변성된 이중사슬 DNA 상에서 수행된다. 혼성화는 목적하는 펩티드와 관련된 mRNA 서열의 양이 현저히 낮은 공급원으로부터 유도된 cDNA 클론을 검출하는데 특히 유용하다. 다시 말해서, 비특정 결합을 피하기 위해 의도된 엄격한 혼성화 조건을 사용함으로써, 예컨데, 표적 DNA 를 그의 완전한 보체인 혼합물중의 단일 탐침과 혼성화시켜 특정 cDNA 클론의 오토라디오그래픽 시각화가 가능해진다 (Wallace,et al., Nucl. Acid Res.,9:879, 1981).
따라서, 목적하는 BGP-A 또는 MGP-A 유전자의 부분 DNA 서열이 주어지면, 당 분야의 숙련자는, 과다한 실험을 하지않고도, 완전한 길이의 cDNA 클론을 분리하기 위한 탐침을 제조할 수 있게 된다 (예컨데, Ausubel,et al., Current Protocols in Molecular Biology, Units 6.3-6.4, Greene Publ., 1994; Maniatis,et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, current edition 참고).
BGP-A 또는 MGP-A 를 코딩하는 특정 DNA 서열의 보체는 또한 하기를 통해 수득될 수 있다: 1) 게놈성 DNA 로부터 이중사슬 DNA 서열의 분리; 2) 목적 펩티드에 대한 필요한 코돈을 제공하기 위한 DNA 서열의 화학적 제조; 및 3) 진핵 공여 세포로부터 분리된 mRNA 의 역전사에 의한 이중사슬 DNA 서열의 생체외 합성. 후자의 경우, 일반적으로 cDNA 라 불리는, mRNA 의 이중사슬 DNA 보체가 궁극적으로 형성된다. 재조합법에 사용되는 특정 DNA 서열을 개발하는 상기 언급된 세가지 방법 중, 게놈성 DNA 분리물의 분리가 가장 드물게 사용된다. 이는 인트론의 존재로 인하여 포유류 펩티드를 미생물 발현시키고자 하는 경우 특히 그러하다.
목적하는 펩티드 생성물의 아미노산 잔기의 전체 서열이 공지된 경우, DNA 서열의 합성법이 가장 흔히 선택되는 방법이다. 목적 펩티드의 아미노산 잔기의 전체 서열이 공지되지 않은 경우, DNA 서열의 직접 합성은 불가능하고 cDNA 서열의 합성법을 선택해야 한다. 목적하는 cDNA 서열을 분리하는 일반적인 방법 중, 유전적 발현도가 높은 공여 세포에서 풍부한 mRNA 의 역전사로부터 유도되는, 플라스미드- 또는 파지-수반 cDNA 라이브러리를 형성하는 방법이 있다. 중합 효소 연쇄 반응 기법과 공동으로 사용될 경우, 희귀한 발현 생성물까지도 클론될 수 있다. 펩티드의 아미노산 서열의 상당 부분이 공지된 경우, 표적 cDNA 에 추정상 존재하는 서열을 복제하는, 표식된 단일 또는 이중사슬 DNA 또는 RNA 탐침 서열의 제조를, 단일사슬 형태로 변성된 cDNA 의 클론된 카피상에서 수행되는 DNA/DNA 혼성화 방법에 사용할 수 있다 (Jay,et al., Nucl. Acid,11:2325, 1983).
서너개의 벡터 타입, 예컨데, 플라스미드, DNA 및 RNA 바이러스성 벡터, 바큐로바이러스성 벡터, 및 효모에 사용되는 벡터가 유용하며 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 벡터가 플라스미드인 경우, 벡터는 일반적으로 프로모터, 시그날 서열, 표현형 선별 유전자, 복제 개시점, 및 당 분야의 숙련자에게 공지된 기타 필수 성분을 비롯한 다양한 성분을 포함한다.
원핵 벡터에 가장 흔히 사용되는 프로모터에는 lac Z 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타아제 pho A 프로모터, 박테리오파지 λPL 프로모터 (온도 민감성 프로모터), tac 프로모터 (지체 억제인자에 의해 조절되는 혼성 trp-lac 프로모터), 트립토판 프로모터, 및 박테리오파지 T7 프로모터가 포함된다.
본 발명을 수행하는데 사용되는 벡터의 또다른 유용한 성분은 시그날 서열이다. 상기 서열은 펩티드를 코딩하는 핵산의 5' 쪽에서 통상적으로 발견되며, 따라서 융합 단백질의 아미노 말단에 전사될 것이다. 그러나, 특정한 경우, 시그날 서열이 분비될 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 쪽 이외의 위치에 존재하는 것이 증명된 바 있다. 상기 서열은 그것이 박테리아 세포의 세포막 간을 접합되는 단백질을 표적으로 한다. 시그날 서열을 코딩하는 DNA 는 시그날 서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 임의의 핵산으로부터 제한 엔도뉴클레아제 단편으로써 수득될 수 있다. 적합한 진핵 시그날 서열은, 예컨데 Lamb 또는 OmpF (Wong,et al, Gene 68:193, 1983), MalE, PhoA, OmpA 및 기타 유전자를 코드하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 본 발명을 수행하는데 있어서 바람직한 진핵 시그날 서열은 문헌 [Chang,et al, Gene 55:189, 1987] 에 기재된 이 콜라이 (E.coli) 열안정성 엔테로톡신 II (STII) 시그날 서열이다.
본 발명을 수행하는데 사용되는 벡터의 또다른 유용한 성분은 표현형 선별 유전자이다. 전형적인 표현형 선별 유전자로는 숙주 세포에 항생물질 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자가 있다. 한 예로써, 앰피실린 내성 유전자 (amp) 및 테트라사이클린 내성 유전자 (tet) 가 상기 목적으로 사용될 수 있다.
상기 언급된 성분들 뿐만 아니라 목적 펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하는 적합한 벡터의 구축은 표준 재조합 DNA 방법을 사용해 이루어진다. 벡터를 형성하기 위해 합체되는 분리된 DNA 단편은 개열되고, 손질되고, 특정한 순서 및 방향으로 서로 결찰되어 목적하는 벡터를 생성한다.
DNA 는 일반적인 방법 (Maniatis,et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, current edition 참고) 에 따라 제조된다. DNA 단편이 벡터내로 결찰되어야 하는 경우, 벡터는 일차적으로 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 선형화 된다. 선형화된 벡터는 이어서 알칼린 포스파타아제 또는 송아지 장내 포스파타아제로 처리된다. 포스파타징은 결찰 과정중 벡터의 자가-결찰을 방지한다.
결찰 후, 이질성 유전자가 삽입된 벡터는 적합한 숙주 세포로 형질전환된다. 적합한 원핵 숙주 세포에는 이 콜라이 균주 JM101, 이 콜라이 K12 균주 294 (ATCC 번호 31,446), 이 콜라이 균주 W3110 (ATCC 번호 27,325), 이 콜라이 X1776 (ATCC 번호 31,537), 이 콜라이 XL-1Blue (Stratagene), 및 이 콜라이 B 가 포함되지만; HB101, NM522, NM538, NM539 와 같은 다수의 기타 이 콜라이 균주 및 다수의 기타 종 및 속의 원핵생물이 또한 사용될 수 있다. 상기 언급된 이 콜라이 균주 외에, 박실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 간균, 살모넬라 티피무니움 (Salmonella typhimunium)또는 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesans)와 같은 기타 장내세균 및 각종 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 또한 숙주로써 사용될 수 있다.
원핵 세포의 형질전환은 염화 칼슘 또는 당 분야의 숙련자에게 널리 공지된 기타 방법들을 사용해 용이하게 수행될 수 있다. 또한 전기천공 (Neumann,et al., EMBO J.1:841, 1982) 도 상기 세포를 형질전환 시키는데 사용될 수 있다. 형질전환된 세포는, 벡터상의 tet 및/또는 amp 내성 유전자의 존재로 인해 그들이 내성을 갖게 되는, 항생물질, 통상적으로 테트라사이클린 (tet) 또는 앰피실린 (amp) 상에서의 증식을 통해 선별된다.
형질전환된 세포의 선별 후, 상기 세포는 배양액에서 증식된 후, 플라스미드 DNA (또는 외부 유전자가 삽입된 기타 벡터) 가 분리된다. 플라스미드 DNA 는 당 분야에 공지된 방법을 사용해 분리될 수 있다. 이어서, 상기 정제된 플라스미드 DNA 는 제한효소 매핑 및/또는 DNA 서열 분석에 의해 분석된다.
상기 기재된 방법에 따라, 골수종 (P3-653), 호성세포 (SP2/0), 중국 햄스터 난소 (CHO: Chinese Hamster Ovary), 녹색 원숭이 신장 (COSI) 및 쥐 섬유 아세포 (L492) 와 같은 포유류 세포계가 펩티드 발현에 적합한 숙주 세포이다. 상기 "포유류" 벡터는 프로모터, 인텐서, 폴리아데닐레이션 시그날, 시그날 서열 및 지네티신 (네오마이신 내성), 미코페놀 산 (크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소) 또는 히스티디놀 (히스티디놀 탈수소효소) 와 같은 선별 마커를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있다.
포유류 숙주 세포에 사용하기 적합한 프로모터에는 Ig 카파 (Kappa), Ig 감마 (Gamma), 사이토메갈로바이러스 (CMV: Cytomegalovirus) 이메디에이트 어얼리 (immediate early), 로우스 사르코마 바이러스 (RSV), 시미안 바이러스 40 (SV40) 어얼리, 마우스 유방암 (MMTV) 바이러스 및 메탈로티오네인이 포함되지만, 이들에 국한되지는 않는다. 적합한 인텐서에는 Ig 카파, Ig 헤비 (Heavy), CMV 어얼리 및 SV40 이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 적합한 폴리아데닐레이션 서열에는 Ig 카파, Ig 감마 또는 SV40 거대 T 항원이 포함된다. 적합한 시그날 서열에는 Ig 카파, Ig 헤비 및 인간 성장 호르몬 (HGH) 이 포함된다.
벡터가 바큘로바이러스인 경우, 적합한 프로모터 및 인텐서 서열에는 AcMGPV 폴리헤드린, AcMGPV ETL 및 AcMGPV p10 서열이 포함되지만, 이들에 국한되지는 않는다. 특히 적합한 폴리아데닐레이션 시그날은 폴리헤드린 AcMGPV 이다. Ig 카파, Ig 헤비 및 AcMGPV 는 적합한 시그날 서열의 예이다. 상기 벡터들은 SF9, SF21 및 High 5 와 같은 곤충 세포계 등에 유용하다.
이와는 달리, 펩티드는 PS23-6A, W301-18A, LL20, D234-3, INVSC1, INVSC2, YJJ337 과 같은 효모 균주에서 발현될 수 있다. gal 1 및 pEFT-1 과 같은 프로모터 및 인텐서 서열이 유용하다. 또한 Vra-4 도 적합한 인텐서 서열을 제공한다. 기능성 "복제 개시점" 으로서 유용한 서열에는 ars1 및 2μ 원형 플라스미드가 포함된다.
본 발명은 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드 또는 이들의 단편과 면역반응하는 항체들도 포함한다. 상이한 항원결정부 특이성을 가진 모노클로날 항체로 주로 구성된 항체, 및 차별화된 모노클로날 항체 제조법이 제공된다. 모노클로날 항체는 당 분야의 숙련자에게 널리 공지된 방법 (Kohler,et al., Nature,256:495, 1975) 에 의해 단백질 단편을 함유하는 항원으로부터 만들어진다. 항-BGP-A 또는 MGP-A 항체는 당 분야의 통상적인 방법을 통해 만들어질 수 있다. 예컨데, 폴리클로날 항혈청이 토끼, 마우스, 또는 쥐와 같은 적합한 동물에서 생성될 수 있다. 합성되어 수득되거나 또는 자연적으로 수득된 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드는 동물에게 면역성을 부여하는데 사용될 수 있다. 이어서, 면역원은 당 분야의 숙련자에게 널리 공지된 방법을 통해 동물에게 면역성을 부여하는데 사용될 수 있다. 혈청 시료는 항-BGP-A 또는 MGP-A 역가가 적절해질 때까지 수합된다. IgG 와 같은 항혈청의 다양한 분획은 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 이와는 달리, BGP-A 또는 MGP-A 면역원은, 당 분야에 널리 공지된 방법을 통해, 모노클로날 항체를 수득하는데 사용될 수 있다 (예컨데, Harlowet al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1988 참고).
항-BGP-A 또는 MGP-A 항체는, 조직학적 시료와 같은, 생물학적 시료내의 BGP-A 또는 MGP-A 의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 적합한 검출가능 2 차 항체는 BGP-A 또는 MGP-A 에 접합된 1차 항체를, 시각화를 통해, 확인하는데 사용될 수 있다. 검출 방법에는 방사성 뉴클레오티드 또는 과산화효소와 같은 효소 기질의 사용이 포함된다. 예컨데, 항-BGP-A 는 일반적인 방법에 의해 제조되며 송아지의 골수 시료 (세포학적 시료)를 염색시키는 것으로 증명되었다. 특히, 과립구 (예컨데, 호산구) 는 BNP-A 에 대해 강하게 염색된다.
본 발명에 사용된 "항체" 라는 용어는 에피토프 결정인자에 결합할 수 있는 온전한 분자 뿐만 아니라 그의 단편들, 예컨데 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 도 포함한다. 상기 항체 단편들은 그의 항원 또는 수용체와 결합하기 위해 몇몇 능력을 선별적으로 유지하며 하기와 같이 정의된다:
(1) Fab : 파파인 (papain) 효소로 전체 항체를 분해시켜 온전한 L 사슬 및 H 사슬 일부를 수득함으로써 제조될 수 있는, 항체 분자의 1 가 항원-결합 단편을 함유하는 단편;
(2) Fab' : 펩신으로 항체 전체를 처리하고, 이어서 환원시켜, 온전한 L 사슬 및 H 사슬의 일부를 수득함으로써 수득될 수 있는 항체 분자의 단편; 항체 분자당 두개의 Fab' 단편이 수득됨;
(3) (Fab')2: 펩신 효소로 전체 항체를 처리한 후 환원시키지 않음으로써 수득될 수 있는 항체의 단편; F(ab')2는 두개의 이황화 결합에 의해 서로 연결된 두개의 Fab' 단편의 이량체임;
(4) Fv : 두개의 사슬로서 발현되는, L 사슬의 가변 영역 및 H 사슬의 가변 영역을 함유하는 유전공학적으로 생성된 단편; 및
(5) 단일 사슬 항체 ("SCA") : 적합한 펩티드 링커에 의해 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자의 형태로 연결된, L 사슬의 가변 영역 및 H 사슬의 가변 영역을 함유하는 유전공학적으로 생성된 분자.
상기 단편을 만드는 방법은 당 분야에 공지되어 있다 (예컨데, Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (current edition) 참고).
본 발명에서 사용된 바에 따르면, "에피토프" 라는 용어는 항체의 파라토프 (paratope) 가 결합하는, 항원상의 임의의 항원 결정인자를 의미한다. 에피토픽 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 군들로 이루어지며, 일반적으로 특정한 3 차원 구조적 특성, 및 특정한 전하적 특성을 갖는다.
필요하다면, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는, 예컨데, 펩티드 또는 항체를 생성시킨 펩티드가 결합된 매트릭스에 결합되고 그로부터 용출됨으로써 추가적으로 정제될 수 있다. 당 분야의 숙련자는 폴리클로날 항체, 및 모노클로날 항체의 정제 및/또는 농축에 관한 면역학 분야의 통상적인 각종 기법을 알 것이다 (예컨데, Coligan,et al., Unit 9,Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, current edition 참고).
또한 항-유전자형 기법을 사용해 에피토프를 모방하는 모노클로날 항체를 제조하는 것도 가능하다. 예컨데, 1 차 모노클로날 항체에 대해 만들어진 항-유전자형 모노클로날 항체는 1 차 모노클로날 항체가 결합된 에피토프의 "이미지" 인 초가변부내에 결합 영역을 가질 것이다.
"정제된 항체" 라는 문구는 자연적으로 결합하게 되는 단백질 및 자연-발생적 유기 분자로부터 60 중량% 이상이 유리된 항체를 의미한다. 바람직하게, 시료는 75 중량% 이상, 보다 바람직하게 90 중량%, 및 가장 바람직하게는 99 중량% 이상이 항체, 예컨데 항-BGP-A 특이적 항체이다. 정제된 항체는, 예컨데, 재조합에 의해 생성된 단백질 또는 보존된 모티프 펩티드를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 표준 기법을 통해 수득될 수 있다. 본 발명에서는 온전한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 뿐만 아니라, 면역학적 활성을 갖는 항체 단편, 예컨데 Fab, Fab' 또는 (Fab')2단편, 또는 유전공학적으로 생성된 Fv 단편 (Ladner et al., 미국 특허 제 4,946,788 호) 이 사용될 수 있다.
"특이적으로 결합한다" 는 것은 특정 단백질, 예컨데 항-BGP-A 를 인지하고 그에 결합하는 항체, 특정 항체 또는 항-MGP-A 특이적 항체로, 자연적으로 단백질을 포함하는 시료내의 기타 분자를 실질적으로 인지 및 결합을 하지 않는 항체를 의미한다.
본 발명의 조성물이 균류, 박테리아 (그람 양성 및 음성), 및 원생동물 및 바이러스와 같은 다수의 미생물에 대해서 활성을 갖는다는 것을 숙지해야 한다. 상이한 조성물은 상이한 유기체에 대해 상이한 활성도를 가질 것이다. 또한 본 발명의 펩티드는 기타 단백질과 결합해 박테리아성 분해로부터 단백질을 보호하는 방부제로서 작용할 수도 있다. 이와는 달리, 상기 펩티드 또는 조성물은, 콘택트 렌즈용 용액, 연고, 샴푸, 약제, 식품 등과 같은 다수의 제형에 방부제 및 살균제로서 사용될 수 있다. 조성물에 사용되는 펩티드 양은 기타 성분의 본질, 얼마만큼의 보호가 필요한지 및 조성물의 목적하는 용도에 따라 달라질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항균성 펩티드의 치료량의 투여를 제시한다. 본문에 개시된 하나 또는 그 이상의 펩티드는 단독으로, 또는 지질 파시클 (fascicle) 제제 형태로, 항진균제로서 사용될 수 있다. 후자적 시도가 비펩티드성 항진균 약제인 앰포테리신에 대해 성공적으로 사용된 바 있다. 구체적인 적용법은 표적 병원균에 따라 달라질 것이다. 예컨데, 에이즈 환자의 피부점막 진균성 질병의 흔한 원인이며, 몇몇 β-디펜신에 매우 민감한 씨 알비칸스는 BGP-A 또는 MGP-A 를 기재로 한 치료법 또는 현존하는 1 차 약제계와 공동으로 사용함으로써 상기 환자에서 보다 효과적으로 조절될 수 있을 것이다. 유사하게, BGP-A 또는 MGP-A 는 수의학에서도 치료용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 치료적 용도의 한가지 장점은 펩티드가 낮은 면역유발성을 나타낸다는 것이다.
천연 공급원으로부터 정제된 또는 합성된, BGP-A 또는 MGP-A 는 바람직하게는 위내에서의 방출을 피할 서방성 제제형으로 경구 투여하는 것을 비롯해 다양한 방법을 통해 치료가 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 이와는 달리, 비측 위 항온배양 또는 경복병 도관을 통해 투여될 수 있다. 각각의 BGP-A 또는 MGP-A 종은 단독으로 투여될 수 있으며 또는 조합형태로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 또한 기타 항균성 조성물과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 나아가, 인체내 박테리아성 또는 진균성 감염을 치료하는데 유효한 양의 본 발명의 정제된 펩티드 및 약제적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 인체내 박테리아성 또는 진균성 감염을 치료하기 위한 약제적 조성물을 제공한다.
박테리아의 증식을 억제하는 방법은 조합형 또는 상협적 치료를 위한 항생물질의 첨가를 추가로 수반할 수 있다. 투여되는 적합한 항생물질은 박테리아가 그람 음성 또는 그람 양성인지의 여부와 같은 박테리아의 민감성에 따라 통상적으로 달라지며, 당 분야의 숙련자는 이를 쉽게 분별할 수 있을 것이다. 본 발명의 펩티드와 함께 상협적 치료에 유용한 특정 항생물질 부류의 예로서 아미노글리코시드 (예컨데, 토브라마이신), 페니실린 (예컨데, 피페라실린), 세팔로스포린 (예컨데, 세프타지딤), 플루오로퀴놀론 (예컨데, 시프로플록사신), 카르베페넴 (예컨데, 이미페넴), 테트라사이클린 및 마크로리드 (예컨데, 에리트로마이신 및 클라리트로마이신) 가 있다. 박테리아의 증식을 억제하는 방법은 조합형 또는 상협적 치료를 위한 항생물질의 첨가를 추가로 수반할 수 있다. 투여되는 적합한 항생물질은 박테리아가 그람 음성 또는 그람 양성인지의 여부와 같은 박테리아의 민감성에 따라 통상적으로 달라지며, 당 분야의 숙련자는 이를 쉽게 분별할 수 있을 것이다. 상기 언급된 항생물질과 더불어, 대표적인 항생물질에는 아미노글리코시드류 (아미카신, 젠타미신, 카나마이신, 네틸미신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트/에틸숙시네이트/ 글루셉테이트/락토비오네이트/스테아레이트), 페니실린과 같은 베타-락탐류 (예컨데, 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 앰피실린, 아목시실린, 티카르실린, 카르베니실린, 메즐로실린, 아즐로실린 및 피페라실린), 또는 세팔로스포린 (예컨데, 세팔로틴, 세파졸린, 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 세푸록심, 세포니시드, 세프메타졸, 세포테탄, 세프프로질, 로라카르베프, 세페타메트, 세포페라존, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세프타지딤, 세페핌, 세픽심, 세프포독심, 및 세프술로딘) 이 포함된다. 기타 항생물질 부류에는, 예컨데, 카르바페넴 (예컨데, 이미페넴), 모노박탐 (예컨데, 아즈트레오남), 퀴놀론 (예컨데, 플레록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 에녹사신, 로메플록사신 및 시녹사신), 테트라사이클린 (예컨데, 독시사이클린, 미노사이클린, 테트라사이클린), 및 글리코펩티드 (예컨데, 반코마이신, 테이코플라닌) 가 포함된다. 기타 항생물질로는 클로람페니콜, 클린다마이신, 트리메토프림, 술파메톡사졸, 니트로퓨란토인, 리팜핀 및 뮤피로신이 포함된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 가용성 단백질의 처리법은 사이즈 익스클루젼 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 또는 역상, 고성능, 액체 크로마토그래피로 구성된다. 그러나, 펩티드를 정제하기 위한 가용성 단백질의 처리는 당 분야의 숙련자에게 공지되고, 본 발명에 의해 숙고된, 다수의 방법을 통해 수행될 수 있음을 당 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 더욱이, 본 발명의 한 구현예에서, 과립을 회수하기 위한 과립구의 처리법은 밀도 구배 원심분리법으로 구성된다.
또한 본 발명은 박테리아 또는 균류를 죽이는데 유효한 량의 정제된 펩티드 및 적합한 담체로 구성된 조성물도 제공한다. 상기 조성물은 박테리아 또는 균류를 퇴치하는데 다양한 방식으로, 예컨데, 당 분야에 널리 공지된 담체를 이용한 가정 또는 실험실용 항균제제로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 국소적 도포에 적합한 생리학적으로-허용가능한-담체에, 단일 또는 조합 형태로, 합체된 BGP-A, BGP-A-아미드, MGP-A, 또는 MGP-A-아미드를 함유할 수 있다. 조성물은 약 10 ug/ml 내지 2000 ug/ml, 바람직하게는 50 ug/ml 내지 500 ug/ml 을 함유할 수 있다. 담체의 본질은 도포할 목적부위에 따라 달라질 것이다. 피부 도포용으로는, 라놀린, 실바덴 (Silvadene) (Marion 사 제품; 특히 화상 치료용), 아쿠아포르 (Aquaphor) (Duke Laboratories, South Norwalk, Conn.) 등을 포함한 적합한 주약과 함께 크림 또는 연고 기재가 일반적으로 바람직하다. 또한 BGP-A, BGP-A-아미드, MGP-A, 또는 MGP-A-아미드 펩티드를 천연 또는 합성 붕대 및 기타 치료용 붕대에 도입하여 상처가 지속적으로 펩티드에 노출되도록 하는 것도 가능하다. 또한 분무식 도포구에 있어서도 본 발명이 유용하게 사용될 수 있다.
펩티드가 항균제로 사용될 경우, 펩티드는 각종 염류 및 완충제를 함유하는 완충 수성 배지형으로 조제될 수 있다. 대부분의 경우 염류는 알칼리 및 알칼리 토금속 할라이드, 인산염, 황산염, 예컨데, 염화 나트륨, 염화 칼륨 또는 황산 나트륨이다. 예컨데 구연산염, 인산염, HEPES, 트리스 등과 같은 각종 완충제는 상기 완충제로 처리될 대상 숙주에 생리학적으로 허용가능한 범위내에서 사용될 수 있다.
화합물이 냉동건조된 분말 형태로 된 각종 부형제 또는 기타 첨가제는 다음 용도로 용액에 사용될 수 있다. 부형제에는 각종 폴리올, 불활성 분말 또는 기타 증량제가 포함될 수 있다.
제형 및 숙주의 성질에 따라, 대상 화합물은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 제제는 예컨데, 정맥, 복강내, 비인두 등을 통한 주사에 의해 국소적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 있어서, 본발명의 정제된 펩티드의 살균 유효량 및 적합한 담체 또는 약제학적 조성물, 또는 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물은 세제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 펩티드 조성물에 세제를 첨가하는 것은 본 발명의 신규 펩티드의 항박테리아, 항바이러스, 또는 항진균 특성을 강화시키는데 유용하다. 어떠한 적합한 세제도 사용될 수 있지만, 현재로서 바람직한 세제는 Tween 20 또는 1% NP40 과 같은 비이온성 세제이다.
또한 본 발명은 본 발명의 정제된 펩티드, 또는 약제학적으로 허용가능한 리포좀 또는 기타 전달 수송체에 합체된, 인체 세균성, 박테리아성, 바이러스성, 또는 진균성 감염을 치료하는데 효과적인 양의 펩티드를 전달할 수 있는 유전자 전달 또는 유전자 발현 벡터로 구성된, 인체 세균성, 박테리아성, 바이러스성, 또는 진균성 감염 치료용 약제학적 제제 또는 조성물을 제공한다.
"제제" 란 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제제가 표적 세포의 가장 바깥쪽 세포막의 세포질측에 합체되어 표적 세포에 뉴클레오티드 서열을 전달, 또는 세포내로 직접 전달할 수 있는 유전자 전달 및 유전자 발현이 가능하고, 전달된 뉴클레오티드 서열의 유전자 발현이 검출가능한 수준으로 표적 세포내에서 나타나도록 유전자 발현을 수행할 수 있는 조성물을 의미한다. 보다 바람직하게, 세포막의 세포질 쪽으로의 전달 후 조성물은, 엔도소말 또는 세포 용해적 분해를 거치지 않고, 표적 세포내에서 전달된 뉴클레오티드 서열의 유전자 발현도가 검출 가능한 수준이 되도록 유전자 발현을 이룰 수 있는 기능적 상태로 곧바로 표적 세포의 핵으로 운송된다. 표적 세포 내의 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 발현도는 그 안의 뉴클레오티드 생성물이 생물학적으로 유익한 유효량의 유전자 생성물을 제공할 수 있는 양 또는 기능상 유익한 생물학적 효과를 제공할 수 있는 양으로 지속 기간동안 유전자 발현을 제공할 수 있다. 본문에 사용된 바에 따르면, 제제란 용어는 하기 예를 가리킬 수 있으나, 이들에 의해 (명백히 또는 은연중에) 제한 받지는 않는다: (1) 최종 특성 및 총 전하가 양이온성, 음이온성 또는 중성인 리포솜 또는 리포솜 시약 또는 리포솜성 조성물; (2) [DNA + 폴리양이온 + 리간드] 조성물이 리간드를 통해 표적 세포상의 세포 표면 수용체에 부착된 후, [DNA + 폴리양이온 + 리간드] 조성물이 표적 세포내로 세포내이입될 수 있고, 이어서 DNA 가 리간드 및 폴리양이온으로부터 이탈하여, 이후의 발현을 위한 기능성 상태인 세포핵으로 전달되는 폴리양이온/들 및 리간드/들과 이온적으로 착화된 DNA, 핵산 또는 핵산 발현 벡터. (a) 표적 세포내로 도입된 후 조성물이 라이소소말 소포를 떠나도록 함으로써 엔도소말 용균으로부터 조성물을 보호하거나, 또는 (b) 핵 피막의 구멍을 통과해 세포의 핵에 이르기까지 핵산을 호위하는 핵 표적화제로써 작용하는 펩티드 서열을 포함해 당 분야의 숙련자들에 의해 조성물에 주어질 다양한 변형이 구상될 수 있다. 이미 기재된 바 있는 유사한 시약으로는 아시알로글리코프로틴-폴리라이신 접합체가 있다 (Wuet al., J. Biol. Chem.263:14621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem.264:16985, 1989); (3) 나출 핵산; (4) 압축된 핵산 또는 압축된 시약; 또는 (5) 미세주입될 수 있는 플라스미드 또는 나출 DNA (Wolffet al., Science 247:1465, 1990); (6) 바이러스성 또는 레트로바이러스성 조성물내의 핵산; 및 (7) 콜로이드성 분산액 (Felgneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987; Onoet al., Neuroscience Lett.117:259, 1990; Brighamet al., Am. J. Med. Sci.298:278, 1989; Staubinger and Papahadjopoulos,Meth. Enz.101:512, 1983). 당 분야의 숙련자는 표적 세포로 뉴클레오티드 서열을 전달하는 기타 조성물이 구상될 수 있음을 알게될 것이다.
당 분야의 숙련자는 임의의 적합한 약제학적으로 허용가능한 리포솜을 본 발명의 펩티드용 수송체로서 사용할 수 있음을 쉽게 숙지할 것이다. 상기 리포소말 조성물은 상기 자세히 기술된 본 발명의 기타 조성물의 활성과 유사한, 다수의 미생물에 대한 활성을 갖는다. 더욱이, 상기 조성물은 상기 보다 자세히 기술된 것과 같이 다양한 통상적인 방식 및 널리 공지된 방식으로 투여될 수 있다.
본문에 사용된 바에 따르면, "치료상 효과적" 이란 치료 대상 환자 또는 동물의 상태를 개선시키기에 충분한 양의, 약제학적으로 허용가능한 담체내의, 제제, 조성물, 또는 시약의 양을 가리킨다. "개선" 이란 치료받는 대상자의 질병 상태 또는 질환의 유해한 영향을 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명의 대상은 바람직하게는 인간이지만, 어떠한 동물도 본 발명의 방법으로 치료될 수 있음을 기대할 수 있다. "조절" 이란 용어는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 항균 활성의 발현 또는 작용을 강화, 억제, 변경, 또는 변화시키는 것을 의미한다.
투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체 조제형으로는 무균 또는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 유상액이 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 유지, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체로는 물, 알코올성/수성 용액, 유상액 또는 현탁액, 예컨데 염수 및 완충 배지가 포함된다. 비경구용 매개체로는 염화 나트륨 용액, 링어스 (Ringer's) 포도당, 포도당 및 염화 나트륨, 락트화 링어스, 또는 불휘발성 유지가 포함된다. 활성 치료 성분은 주로 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분에 상화가능한 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제에는 물, 염수, 포도당, 글리세롤 및 에탄올, 또는 이들의 조합물이 포함된다. 정맥성 매개체로는 유액 및 영양소 보충제, 링어스 포도당을 기재로하는 전해질 보충제와 같은 전해질 보충제 등이 포함된다. 또한, 예컨데, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체등과 같은 방부제 및 기타 첨가제도 사용될 수 있다.
본 발명에 포함된 또다른 치료적 시도는 세균성, 박테리아성, 바이러스성 또는 진균성 질환을 가진 대상에 임의의 통상적인 투여 기법 (예컨데 국소 주사, 흡입, 또는 전신적 투여를 포함하지만 이에 국한되지는 않음) 을 통해 시약 또는 조성물을 직접 투여하는 것을 수반한다. 또한 시약, 제제 또는 조성물은 본문에 기재된 임의의 방법을 통해 특정 세포 또는 수용체로 표적화될 수 있다. 세균성, 박테리아성, 바이러스성 또는 진균성 질환을 조절하는 시약, 제제 또는 조성물의 실제 투여량은, 유기체의 크기 및 건강 상태를 비룻한 다수의 요인에 따라 달라지지만, 당 분야의 숙련자는 사용에 적합한 투여량을 결정하기 위해 임상 투여량을 결정하는 방법 및 기법이 기재된 하기 문헌을 사용해 적절한 투여량을 정할 수 있다 (Spilker B.,Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984, pp. 7-13, 54-60; Spilker B.,Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, pp. 93-101; Craig C., and R. Stitzel, eds.,Modern Pharmacology, 2d ed., Little, Brown and Co., Boston, 1986, pp. 127-33; T. Speight, ed.,Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics,3d ed., Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, pp. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa and P. McGonigle,Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, pp. 18-20); 그러나, 통상적으로, 최종 농도를 포함해 약 0.1 mg/kg 내지 1000 mg/kg 의 범위, 보다 구체적으로는 약 1.0 mg/kg 내지 500 mg/kg, 및 바람직하게는 약 10 mg/kg 내지 100 mg/kg 가 약제학적으로-허용가능한 담체와 함께 성인을 대상으로 매일 투여된다.
본 발명의 펩티드는 또한 LPS 와 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수도 있다. LPS 와 관련된 질환과 관련해, 내독소혈증 또는 패혈증과 같은 LPS 와 관련된 질환의 치료에 대해 본문에서 사용되는 "치료적 유효량" 이라는 용어는 LPS 에 대한 환자의 반응을 감소시키고 패혈증과 같은 LPS 와 관련된 질환의 증상을 감소시키기에 충분한 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드의 양을 가리킨다. 따라서, "치료적으로 유효한" 이란 용어는 임상적으로 중요한 의미를 갖는 플라스마내 LPS 농도의 증가를 방지, 및 바람직하게는 50% 이상 감소, 및 보다 바람직하게 90% 로 감소시키기에 충분한 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드의 양을 포함한다. BGP-A 또는 MGP-A 펩티드의 투여량 범위는 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 양이면 된다. 일반적으로, 투여량은 상기 기재된 바와 같이 환자의 나이, 상태, 성별, 및 박테리아 또는 기타 요인에 의한 감염의 정도에 따라 달라지며, 당 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 금기가 있을 경우엔 의사가 투여량을 조절할 수 있다. 어떠한 경우든지, 치료 효과는 환자내의 LPS 농도 또는, 종양 괴사 인자 (TNF) 와 같은, LPS 관련 분자의 농도를 모니터함으로써 측정될 수 있다. 혈청 LPS 및 TNF 농도의 감소는 LPS 관련 질환의 개선을 의미한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 식품 방부제로서 또는 잠재적인 병원균을 제거하기 위해 식품을 처리하는데 사용될 수 있다. 후자의 용도는 인체에 심각한 질병을 유발하는 장용성 병원균과 같은 심각한 문제점을 지닌 생선 및 가금류를 대상으로 할 수 있다. 또다른 구현예에서, BGP-A 또는 MGP-A 는 무균 상태로 유지되어야 하는 제품에 살균제로서 사용될 수 있다. 추가적인 구현예에서, BGP-A 또는 MGP-A 는 식용 곡물에 대한 항균제로서, 추수후 손상을 완화시키는 제제로 사용되거나, 또는 숙주 내성을 강화시키기위해 유전자도입적으로 발현될 수 있다. 펩티드의 항생물질, 항균, 및 항바이러스성 특성으로 인해, 펩티드는 세균성 또는 바이러스성 감염에 민감한 물질에 방부제 또는 살균제로서 사용될 수도 있다. 본 발명의 BGP-A 또는 MGP-A 펩티드는 광범위한 스펙트럼을 갖는 항균제로서 다양한 용도로 사용될 수 있다. 상기 용도로는, 단독 또는 라이소자임과 같은 항박테리아성 식품 첨가제와 함께, 가공 식품 [살모넬라 (Samonella), 예르시니아 (Yersinia), 쉬겔라 (Shigella) 를 포함한 유기체] 에 방부제로서의 펩티드의 사용; 국소제 [슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토코커스 (Streptococcus)] 로서의 사용 및 악취 생성 미생물 [마이크로코카이 (Micrococci)] 을 죽이는데 사용하는 것이 포함된다. 기재된 용도로서 사용되는 본 발명의 펩티드의 상대적인 효과는 펩티드중 하나에 대한 임의의 유기체의 민감성을 측정함으로써 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
또한 미생물 증식을 유지할 수 있는 환경에서 살균적 억제 또는 미생물 증식 억제의 방법으로서, 미생물 증식이 바람직하지 않은 장치 또는 비물질적인 대상에 펩티드의 살균 유효량 또는 미생물 증식 억제 유효량을 투여함으로써 장치 또는 비물질적 대상에 펩티드를 도입하는 것도 가능하다. 상기 장치 또는 비물질적 대상으로는 린넨, 천, 플라스틱, 이식 장치 (예컨데, 심장 박동 조절 장치, 수술용 스텐트), 표면 또는 저장 용기가 포함되지만, 이들에 국한되지는 않는다. 코팅은 비특이적 흡수 또는 공유 접합에 의해 이루어질 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하도록 의도되었지만 어떠한 방식, 모양, 또는 형태로든 (노골적 또는 은연중에) 본 발명을 제한해서는 안 되며, 그렇게 해석되어서도 안된다. 사용될 수 있는 것 중 대표적인 것들이지만, 당 분야의 숙련자에게 공지된 기타 과정, 방법, 또는 기법을 대신 사용할 수 있다.
재료 및 방법
[소 호중구]. 다형핵 백혈구 (PMN) 를 구연산 처리된 신선한 소 혈액 1 L 로부터 정제한다. 37℃ 에서 40 분 동안 700 x g 로 침강시킨 후, 적혈구 칼럼을 7 초동안 저장 용균시킨 다음, 3x 인산 완충 염수를 사용해 등장성을 회복시킨다. 이어서 백혈구-풍부한 현탁액을 120 x g (4℃, 15 분) 로 침강시킨다. 잔여 적혈구를 상기 과정을 1 또는 2 회 반복해 용균시킨다. 혈구계산법 및 분별 집계에 의한 정량 평가를 위해 분주를 분리한다. 상기 방법을 통해 수득된 시료는 97 ± 3% 가 호중구인 전체 혈액 1 리터당 평균 4 x 109세포를 함유한다. 시료를 2 mM 디이소프로필플루오로포스페이트 (DFP) 로 처리한다. 이어서 호중구 시료를 20 분 동안 4℃ 로 냉각하고 파르 밤 (Parr bomb) (Borregaard, N.,et al., J. Cell Biol. 897:52-61, 1983) 내에서 질소 캐비테이션 (cavitation) 을 통해 파쇄한다. 캐비테이트를 4℃ 에서 10 분동안 800 x g 로 원심분리하고, 과립-함유 상청액을 수득한다. 과립은 40 분동안 27,000 x G 에서 원심분리하여 채취하고 -80℃ 에서 저장한다.
[PMN 과립 추출물]. 1-5 x 1010PMN 에서 유래한 냉동 과립 시료를 1 x 109세포 당량 당 5 ml 의 냉각된 10% 아세트산을 사용해 추출한다. 18 시간 동안 얼음에서 교반한 후, 현탁액을 4℃ 에서 20 분동안 27,000 x G 로 원심분리하여 맑게 한 후 상청액을 냉동건조시키고 -70℃ 에서 저장한다.
[사이즈 익스클루젼 크로마토그래피]. 냉동건조된 과립 추출물은 10% 아세트산에 ml 당 1 x 109세포 당량의 농도로 용해시키고, 원심분리를 통해 맑게하고, 5% 아세트산중에 평형이 유지된 BioGel P-60 4.8 x 110 cm 칼럼에 로딩한다. 칼럼을 8℃ 에서 시간당 2 cm 의 용출 속도로 용출시키고, 280 mn 에서 계속 모니터하며 15 ml 분획을 수득한다.
[역상 HPLC (RP-HPLC)]. 사이즈 익스클루젼 칼럼으로부터 용출된 저분자량 성분을 1 x 25 cm Vydac C-18 칼럼상의 Waters 510 binary system 상에서 RP-HPLC 를 통해 추가로 분해시킨다. 물 및 0.1% 트리플루오르아세트산 (TFA) 또는 0.13% 헵타플루오로부티르산 (HFBA) 을 함유하는 아세토니트릴을 사용해 농도구배 용출시킨다. 정제된 펩티드를 냉동건조시키고, 100 - 500 μg/ml 로 0.01% 아세트산에 용해시키고, -70℃ 에 저장한다.
[폴리아크릴아미드 겔 전기영동]. 소듐 도데실 술페이트 (SDS; 14) 및 산-요소 (Selsted, M.E.,et al., Anal. Biochem.155:270-274, 1986) 겔 전기영동을 이용해 이미 기재된 바 (Selsted, M.E.,et al., Infect. Immun.45:150-154, 1984) 대로 단백질 시료의 분자량 및/또는 순도를 측정한다.
[아미노산 분석]. 각각의 펩티드의 아미노산 조성을 자연 그대로의 및 퍼포름산으로 산화된, 또는 환원 및 알킬레이트된 시료의 6 N HCl 가수분해물 상에서 (2 시간동안, 15℃ 에서) 측정한다. 트립토판 함량을 서열 분석 및 Edelhoch 의 방법 (Edelhoch, H.,Biochem.6:1948-1954) 에 의한 Beckman DU 60 분광광도계상에서의 분광 측정을 통해 측정한다 (Bidlingmeyer, B.A.,et al., J. Chromatogr.336:93-104, 1984).
[서열 분석]. 서열 분석을 위해, 정제된 BGP-A 를 자동 에드만 (Edman) 서열 분석기로 분석한다. 자동 서열 분석은 온라인 PTH-아미노산 분석용으로 맞춰진 Applied Biosystems 475A 기기상에서 수행한다. 서열은 1 차 구조와 아미노산 조성과의 비교, 및 cDNA 클로닝을 통해 확인할 수 있다.
[펩티드 합성]. 30 분의 커플링 시간을 수반하는 표준 Fmoc/BOP/HOBt/NMM 활성화를 통해 Millipore 9050 자동 합성기상에서 0.4 mmol 스케일로 BGP-A 및 BGP-A-아미드를 합성한다. 유리산 펩티드용 출발 수지는 Fmoc-L-Valine-PEG-PS (Millipore) 이며, 펩티드 아미드용 출발 수지는 Fmoc-PAL-PEG-PS 이다 (Barany, G.,et al., Intercept, R. Epton, Andover, England, 1992, pp. 29-38; Van Abel, R.J.,et al., Int. J. Peptide Protein Applicant respectfully requests withdrawal of the rejection. 45:401-409, 1995). 측쇄 보호기는 아르기닌의 경우 Pmc, 글루타민 및 히스티딘의 경우 트리틸, 라이신의 경우 tBoc 및 타이로신의 경우 tBu 이다. Fmoc 탈보호는 15 분동안 2% 피페리딘 및 2% DBU 를 이용해 이루어진다. 트립토판 및 이소루신은 이중 커플링시킨다. 사슬 어셈블리 후 수지를 자르고 K 시약 (82.5% TFA, 5% 페놀, 5% 티오아니솔, 5% 물 및 2.5% 에탄디티올) 로 4 시간동안 탈보호시킨다. 펩티드 용액을 아세트산중에서 30% 로 만들고, 디클로로메탄으로 추출하고, 수성상을 동결건조시킨다. 0.1% TFA 및 분당 0.33% 로 전개되는 선형 아세토니트릴 농도구배를 사용해 22.5 x 250 mm preparative Vydak C-18 칼럼상에서 RP-HPLC 를 통해 정제를 수행한다. 정제된 펩티드는 아미노산 분석, 산-요소 겔 전기영동 및 분석 RP-HPLC 를 통해 분석한다.
[cDNA 분리 및 특성화.] BGP-A: Chomczynski 및 Sacchi 의 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀 추출법 (Chomczynski, P.,et al., Analyt. Biochem.162:156-159, 1987) 을 사용하여 소 골수로부터 전체 RNA 를 분리한다. 이어서, 골수 전체 RNA (1 mg) 를 조류 역전사효소를 사용하여 제조자의 프로토콜 (5'-RACE System; Life Technologies; Gaithersburg, MD) 에 따라 1 차 사슬 cDNA 를 합성한다. 상기 cDNA 는, 축퇴 유전자 특이적 프라이머가 올리고(dT)15-앵커 프라이머와 쌍을 이뤄 BGP-A cDNA 의 3'-말단을 생성시키는, 3'-RACE 에 주형으로써 사용된다. 하기 회전 매개변수를 사용해 PCR 증폭을 수행한다: 95℃, 1 분; 55℃, 1 분; 72℃, 1 분, 35 회전. 1 차 사슬 cDNA 를 말단 전이효소를 사용해 테일 (tail) 시키고 상이한 유전자 특이적 및 앵커 프라이머를 사용한다는 점을 제외하고는 유사한 방식으로 5'-RACE 를 수행한다. PCR-증폭된 RACE 생성물을 종래에 기재된 방법 (Yount, N.Y.,et al., J. Immunol.155:4476-4484, 1995) 에 따라 서브클론하고 서열 분석한다. BGP-A cDNA 의 5'- 및 3'- 말단이 공지되면, 완전한 길이의 BGP-A 서열에 해당하는 PCR 생성물이 생성되고 서열 분석에 의해 특성화된다.
쥐 골수 전체 RNA 및 1 차 사슬 cDNA 를 BGP-A 와 마찬가지로 생성한다. 이어서, 두개의 유전자 특이적 프라이머를 사용해 BGP-A 상동체에 해당하는 서열을 PCR 증폭시킨다. 상기 서열을 상기 기재된 바대로 서브클론하고 서열분석한다.
[항균성 검정]. 종래에 기재된 바대로 (Selsted, M.E.,Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Plenum Press, New York, 1993, pp. 131-147) 이 콜라이 ML35, 에스 아우레우스 502A, 씨 알비칸스, 및 씨 네오포르만스를 살균 현탁 검정에 표적 유기체로써 사용한다.
실시예1
BGP-A 의 정제
종래의 소 PMN 과립의 산-가용성 단백질 전기 영동 분석은 상기 시료가 1,000 내지 200,000 D 로 크기가 다양한 단백질 복합 혼합물을 함유한다는 것을 증명하였다 (Selsted, M.E., et al.,J. Biol. Chem.267:4292-4295, 1992). 1.3 x 1010호중구에서 추출된 과립-풍부한 분획의 아세트산 추출물을 상기 "재료 및 방법" 이란 제목의 섹션에 기재된 바대로 Bio-Gel P-60 칼럼상에서 크로마토그래피 한다. 산 용해된 과립 단백질의 약 2 x 1010세포 당량을 BioGel P-60 칼럼상에서 분획하고, 수집된 용출 분획의 항박테리아 활성을 "재료 및 방법" 에 기재된 바대로 검정한다. 피이크 E 에 해당하는 분획을 동결건조시키고 RP-HPLC 를 통해 추가로 정제시킨다. 각각의 피이크 (도 1A 에서 A-F) 는 에스 아우레우스 및 이 콜리아에 대한 살균 활성을 갖는다. 피이크 F 는 신규 13 잔기 항균 펩티드 아미드인 인돌리시딘 (Selsted, M.E.,et al., J. Biol. Chem.267:4292-4295) 을 주로 함유하고, 피이크 E 는 적어도 13 β-디펜신을 함유한다.
피이크 E 분획을 조합하고 HPLC 로 추가 정제한다. 피이크 E (도 1a) 로부터 수집된 분획의 1/10 을 0.1% TFA/물 (용매 A) 로 평형화된 1 x 25 cm Vydac C-18 칼럼에 3.0 ml/분의 유속으로 로딩한다. 0.1% TFA (용매 B) 를 함유하는 아세토니트릴 (20% 내지 45%) 의 선형 농도구배를 분당 0.33% 의 속도로 적용한다. Pharmacia Frac-200 분획 수집기의 피이크 커팅 모드를 사용해 분획을 수집한다. 피이크 E 분획의 초기 RP-HPLC 정제를 통해 복합 크로마토그람 (도 1B) 이 수득되고, 이중 대부분의 피이크가 둘 이상의 펩티드를 함유한다는 것이 산-요소 PAGE 에 의해 측정되었다. 그러나, BGP-A 는 RP-HPLC 크로마토그람 초기에 분리된, 실제로 순수한 피이크 (도 1B 의 * 로 나타냄) 로써 용출된다. 최종 정제 (도 2) 를 RP-HPLC 2 차 회전을 통해 수득한다.
실시예 2
BGP-A 의 아미노산 및 서열 분석
BGP-A 의 조성은 아미노산 분석 (도 2) 을 통해 입증된다. 정제된 BGP-A 약 5 μg 을 1.0 ml/분의 유속으로 흐르는 0.4 x 25 cm Vydac C-18 칼럼상에 주입한다. 용매는 도 1B 에 대해 상기 기재된 바와 동일하다. 농도구배 조건: 25 분 동안 10% B 내지 50% B. B. 정제된 BGP-A 의 산-요소 겔. 정제된 BGP-A 2 μg 시료를 12.5% 산-요소 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 250 V 에서 4 시간동안 전기영동시킨다 (2 레인). 소 호중구 과립으로부터 추출된 미가공 산 추출물 100 μg 시료를 평행하게 전개시킨다 (1 레인). 15% 포르말린을 함유하는 코마씨 블루로 염색시킨다. BGP-A 의 흡광 스캔을 300 내지 200 nm 에서 수행하여 정확한 타이로신 및 트립토판 함량치를 제공한다 (Edelhoch, H.,Biochem.6:1948-1954, 1967). BGP-A 2 nmol 에 대해 자동 서열 분석을 수행한다. 반복된 서열 분석을 통해 평균 ≥ 90% 가 수득되고, 이는 13 잔기 모두의 정확한 예측을 가능케 한다. BGP-A 의 전체 아미노산 서열은 하기와 같다:
Tyr-Lys-Ile-Ile-Gln-Gln-Trp-Pro-His-Tyr-Arg-Arg-Val (서열 번호: 5; 도 6). BLAST 알고리듬 (Altschul, S.F.,et al., J. Molec. Biol.215:403-410, 1990) 을 이용한 단백질 서열 조사에 의해 유전자 은행 (GenBank) 데이타 베이스에 유사한 아미노산 서열이 없다는 것이 확인되었다.
실시예 3
BGP-A 및 BGP-A-아미드의 합성
두개의 합성 BGP-A 형태를 Nα-Fmoc 보호된 아미노산으로써 조립한다. (정제된 펩티드의 산-요소 겔 패턴이 도 3 에 나와있다.) 12.5% 산-요소 겔에 2-4 μg 의 천연 BGP-A (도 3, 1 레인), 합성 BGP-A (도 3, 2 레인) 또는 합성 BGP-A-아미드 (도 3, 3 레인) 를 로딩한다. 도 2 에 대해 기재된 바와 같이 염색을 수행한다. HPLC-정제된 재료의 수율은 유리산 형태의 경우 31.4% 이고, 카르복스아미드화된 형태의 경우 22.1% 이다.
실시예 4
BGP-A cDNA 클론의 분리 및 서열 분석
완전한 길이의 BGP-A cDNA 는 길이가 688 뉴클레오티드 (서열 번호: 2) 이고 190 잔기 (도 4; 서열 번호: 3) 로 이루어진 21 kD 전구체가 예측되어진다. BGP-A 전구체 내, 최초 21 잔기 중 11 은 소수성이고 시그날 펩티드가 예측되어진다 (Von Heijne,G., Eur. J. Biochem.133:17-21, 1983). 시그날 펩티드 영역은 156 잔기를 함유하는 개재 프로펩티드 영역이 뒤따른다. 전구체의 최종 13 잔기는 숙성한 BGP-A 펩티드 서열 (서열 번호: 6) 에 해당한다.
BGP-A 전구체가 기타 뉴클레오티드 또는 단백질 서열과 상동인지를 측정하기 위해, 유전자 은행 데이터베이스의 블라스트 (Blast) 조사를 수행한다. BGP-A 서열 및 미공지된 조직에서 유래한 쥐 아데노카르시노마로부터 분리된 부분 cDNA 서열간의 약간의 상동성이 관찰되었다. 쥐 아데노카르시노마 및 BGP-A 서열로부터 유도된 공통 프라이머를 사용해, 마우스 골수에서 유래한 BGP-A 유사 서열을 코딩하는 cDNA (도 5; 서열 번호: 5) 를 분리한다. 상기 완전한 길이의 cDNA 는 길이가 679 뉴클레오티드 (서열 번호: 4) 이며, BGP-A 에 대해 기재된 것과 유사한 시그날 프로펩티드 영역(도 5; 서열 번호: 5) 를 함유하는 전구체가 예측되어진다. 쥐 cDNA 에 의해 예측되어진 상기 숙성한 펩티드 서열은 13 잔기 중 7 개가 BGP-A 와 동일하다 (도 6; 서열 번호: 7). 상기 유사성을 근거로, 쥐 골수 cDNA 로부터 분리된 상기 서열을 마우스 과립구 펩티드 A (MGP-A; 도 5; 서열 번호: 5 및 도 6, 서열번호: 7) 라 명명한다.
실시예 5
BGP-A 및 BGP-A-아미드의 항균 활성
천연 및 합성 BGP-A 및 합성 BGP-A-아미드의 에스 아우레우스 502A, 이 콜라이 ML35, 씨 알비칸스, 및 씨 네오포르만스에 대한 살균 활성을 시험한다. 살균 현탁 검정 (Selsted, M.E.,Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Plenum Press, New York, 1993, pp. 131-147) 을 사용해, 펩티드 농도가 5-100 μg/ml 인 각각의 펩티드를 네개의 시험용 유기체에 대해 시험한다. 세개의 펩티드 시료의 살균 및 진균 활성을 표준 살균 검정법을 이용해 측정한다. 유기체를 중간 로그 성장 단계까지 증식시키고, 채취하여, 2 x 107CFU/ml 에 현탁시킨다. 항온배양 혼합액은 1-2 x 106CFU/ml, 10 mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.4 및 농도가 100 μg/ml 인 펩티드를 함유한다. 37℃ 에서 1 시간동안 항온 배양 (씨 네오포르만스의 경우 4 시간동안 항온 배양) 후, 10-배 계단식 희석물을 트립티카제 소이 아가 (박테리아) 또는 에스 아바라우드 (S. abaraud) 포도당 아가 (균류) 상에 도포하고, 37℃ 에서 24-48 시간동안 항온배양한다. 살균 작용은 콜로니 수를 세어 정량화하고, 항온배양에서의 펩티드 농도의 함수로써 그래프를 그린다.
도 7 에 제시된 데이타는 1 또는 4 시간 항온배양기 후의 콜로니 형성 유니트의 감소로써 측정된 각 펩티드의 투여량-의존적 활성을 나타낸다. 상기 데이타는 1) BGP-A 가 각 유기체에 대한 살균 활성을 가지며; 2) 합성 BGP-A 및 천연 BGP-A 의 효력이 동일하며, 이는 천연 펩티드의 활성이 오염물이 아닌 정제된 화합물에 의해 부여됨을 시사하고; 3) BGP-A 의 카르복스아미드화된 형태가 유리-카르복실 형태보다 대부분의 표적에 대해 효과가 보다 크다는 것을 증명한다.
숙성한 펩티드는 대표적인 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 및 두가지 균류의 효모 형태에 대해 시험관내 살균성을 갖는다. 천연 펩티드의 항균 활성은 합성 BGP-A 가 동등한 살균활성을 갖는다는 것이 증명됨으로써 확인되었다.
실시예 6
LPS 질환 치료에 대한 BGP-A 및 BGP-A-아미드의 활성
본 발명의 BGP, MGP, BGP-A 및 MGP-A 펩티드가 마크로파지내 LPS-유도된 TNF 에 미치는 영향은, 일반적인 방법에 따라, 당 분야의 숙련자에 의해 측정될 수 있다. 예컨데, 세포 배양 플라스크에 세포를 종균하여 마크로파지 세포를 증식시키고, 1 주일동안 37℃, 5% CO2에서 항온배양한다. 이어서 마크로파지 세포 배지 [(Hepes 완충액을 수반하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium 450 ml; 2.4mM L-글루타민 3ml (400mM); Pen/Strep 3ml (104U/ml 의 Pen, 1 mg/ml strep); 및 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청 (FBS) 50 ml)] 를 플라스크로부터 완전히 제거한다. 10 ml 의 세포 해리 용액 (Sigma) 을 각 플라스크에 첨가하고 37℃ 에서 10 분동안 항온배양한다. 세포를 플라스크로부터 제거하고, 마크로파지 세포 배지내에서 희석시키고 약 6 분동안 원심분리한다. 세포 펠렛을 사용된 배지/플라스크 5 ml 에 재현탁시킨다. 100 μl 세포 현탁액을 제거하여 400 μl 의 트리판 블루에 첨가하고 혈구계를 사용하여 세포수를 센다. 세포 현탁액을 1 x 106세포/ ml 로 희석시키고 1 ml 의 현탁액을 24 웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다. 24 웰 플레이트를 하룻밤동안 37℃, 5% CO2에서 항온배양한다.
하룻밤동안의 항온배양후, 모든 웰로부터 배지를 흡출한다. 100 μl 의 리포 다당류 (LPS) 를 100ng/100μl 로 첨가한다. BGP-A 및 MGP-A 를 목적 농도/100μl 로 특정 웰에 첨가한다. 마크로파지 세포 배지를 최종 부피 1 ml/웰이 되도록 첨가한다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6 시간동안 항온배양한다. 웰에서 상청액을 제거하여 하룻밤동안 4℃ 에서 저장한다. 박테리아 전체가 직접 첨가된 웰의 경우, 상청액을 0.2μm 필터 에펜도르프 튜브에서 5 분간 원심분리한다.
이어서 상청액을 세포 사이토톡식 L929 검정에 사용한다. 시료를 96 웰 플레이트로 이동시킨다. 50 μl 의 TNF 배지를 모든 플레이트의, 첫째 줄의 웰을 제외한 모든 웰에 첨가한다. 10μl 의 쥐 TNF 표준 (20ng/ml) 및 90μl 의 TNF 배지를 이중으로 플레이트에 첨가하고 두번째 줄 부터 마지막줄 이하 1:2 로 희석한다. 마크로파지 세포 검정에서 생성된 상청액을 함유하는 시험 시료 (75μl) 를 독립된 줄에 이중으로 첨가하고 두번째 줄부터 마지막줄까지 1:3 으로 희석한다.
TNF-민감성 L929 마우스 섬유 아세포를 162cm2세포 배양 플라스크에 106세포를 종균하여 증식시키고 1 주일간 증식하도록 방치한다. L929 세포를 10 mls 의 트립신-EDTA/플라스크로 플라스크로부터 제거하고 3-5 분간 항온배양한다. 세포 현탁액을 희석하고 6 분간 원심분리한다. 펠렛을 5 ml 의 신선한 L929 배지/플라스크에 재현탁시키고 수를 센다 (마크로파지 세포의 경우와 동일). 세포 현탁액을 106세포/ml 로 희석시킨다. 상청액과 함께 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 100 μl 을 접종한다. (L929 증식 배지는, FBS 대신 50 ml 의 10% 열 불활성화된 말 혈청이 사용된다는 것을 제외하고는 마크로파지 세포 배지와 동일하다; TNF 검정용 배지는 4μg/ml 액티노마이신 D 가 첨가된 것을 제외하고는 마크로파지 세포 배지와 동일하다.)
플레이트를 37℃, 5% CO2에서 2 일간 항온배양한다. 이어서 배지를 흡출하고, 페놀 레드가 생략된 변형된 이글 배지중의 염료 MTT (0.5mg/ml) 100μl 로 대체한다. 이어서 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3 시간동안 항온배양한다. 염료를 제거하고 무수 에탄올 100 μl 로 대체한다. 플레이트를 상온에서 10 -15 분간 방치시켜 포르마잔 염료 결정을 용해시킨다.
690nm 참조 필터를 갖춘 ELISA 플레이트 리더로 570nm 에서 플레이트를 판독한다. TNF 활성 1 유니트는 L929 세포의 50% 를 죽이는데 필요한 양으로 정의한다. 따라서 ml 당 유니트로 표시되는 TNF 수준은 L929 세포의 50% 를 죽인 희석도의 역수이다.
본 발명이 상기 상세한 설명을 참고로 하여 기재되었으나, 상기 설명은 본 발명의 범위를 예시하려 의도된 것이지 제한하려고 의도된 것이 아님을 숙지해야 한다. 본 발명의 기타 측면, 장점, 및 변형은 하기 청구항의 범위내에 있다. 본문에 언급된 모든 문헌, 특허 출원, 출원, 및 기타 참고문헌은 전체 내용이 도입되었다.

Claims (44)

  1. 아미노산 서열 YXXIQXWXHYR (서열 번호: 1) (이중, X 는 임의의 아미노산일 수 있다) 을 함유하는 분리된 항균성 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 번호: 6 에 기재된 펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 번호: 7 에 기재된 펩티드.
  4. 제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 하나 이상의 변형된 아미노산을 함유하는 펩티드.
  5. 제 4 항에 있어서, 변형된 아미노산이 카르복시 말단 아미드를 함유하는 펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서, 펩티드가 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 균류 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물에 대한 항균 활성을 나타내는 펩티드.
  7. 제 6 항에 있어서, 유기체가 에스 아우레우스 (S. aureus), 이 콜라이 (E. coli), 씨 알비칸스 (C. albicans), 에스 티피무리움 (S. typhimurium), 및 씨 네오포르만스 (C. neoformans) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드.
  8. 서열 번호: 3 에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 단편을 함유하는 분리된 항균성 폴리펩티드.
  9. 서열 번호: 5 에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 단편을 함유하는 분리된 항균성 폴리펩티드.
  10. 서열 번호: 1 의 펩티드 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 분리된 핵산 서열.
  11. 서열 번호: 6 의 펩티드 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 분리된 핵산 서열.
  12. 서열 번호: 7 의 펩티드 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 분리된 핵산 서열.
  13. 서열 번호: 3 의 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 분리된 핵산 서열.
  14. 서열 번호: 5 의 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 분리된 핵산 서열.
  15. 제 13 항 또는 14 항에 있어서, 상기 서열이 하기에 의해 특성화 되는 폴리뉴클레오티드:
    a) 엄격한 조건하에 제 13 항 또는 14 항의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열;
    b) 제 13 항 또는 14 항의 DNA 에 의해 코딩되는 아미노산 서열로부터 보존형 변이를 갖는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    c) T 가 U 인 제 13 항 또는 14 항의 뉴클레오티드 서열;
    d) BGP-A 또는 MGP-A 의 생물학적 활성을 유지하는 펩티드를 코딩하는 a), b), 또는 c) 의 기능성 단편; 및
    e) a), b), c), 또는 d) 중 어느 하나에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 축퇴 뉴클레오티드 서열.
  16. 서열 번호: 1 에 결합하는 항체.
  17. 제 16 항에 있어서, 항체가 모노클로날인 항체.
  18. 제 16 항에 있어서, 항체가 폴리클로날인 항체.
  19. 미생물 증식을 유지시킬 수 있는 환경에서, 아미노산 서열 YXXIQXWXHYR (서열 번호: 1) (X 는 임의의 아미노산일 수 있다) 을 갖는 펩티드의 살균 또는 미생물 증식 억제 유효량을 상기 환경에 투여하는 것을 특징으로 하는 살균 방법 또는 미생물 증식 억제 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 6 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 7 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 3 에 기재된 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 단편을 갖는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 5 에 기재된 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 단편을 갖는 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항균 조성물을 더 함유하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 항균 조성물이 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 항생제가 아미노글리코시드, 페니실린, 세팔로스포린, 카르바페넴, 모노박탐, 퀴놀론, 테트라사이클린, 글리코펩티드, 클로람페니콜, 클린다마이신, 트리메토프림, 술파메톡사졸, 니트로퓨란토인, 리팜핀 및 뮤피로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제 부류로부터 선택되는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 항생제가 아미카신, 젠타미신, 카나마이신, 네틸미신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트/에틸숙시네이트/글루셉테이트/락토바이오네이트/스테아레이트, 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 앰피실린, 아목시실린, 티카르실린, 카르베니실린, 메즐로실린, 아즐로실린, 피페라실린, 세팔로틴, 세파졸린, 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 세푸록심, 세포니시드, 세프메타졸, 세포테탄, 세프프로질, 로라카르베프, 세페타메트, 세포페라존, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세프타지딤, 세페핌, 세픽심, 세프포독심, 세프술로딘, 이미페넴, 아즈트레오남, 플레록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 에녹사신, 로메플록사신, 시녹사신, 독시사이클린, 미노사이클린, 테트라사이클린, 반코마이신, 및 테이코플라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제 19 항에 있어서, 펩티드가 하나 이상의 변형된 아미노산을 함유하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 변형된 아미노산이 카르복시 말단 아미드를 함유하는 방법.
  30. 제 19 항에 있어서, 펩티드가 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 균류 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물에 대한 효과적인 살균제 또는 미생물 증식 억제제인 방법.
  31. 유기체가 에스 아우레우스, 이 콜라이, 씨 알비칸스, 에스 티피무리움, 및 씨 네오포르만스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 30 항의 펩티드.
  32. 제 19 항에 있어서, 환경이 유기체인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 환경이 동물인 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 환경이 인간인 방법.
  35. 제 19 항에 있어서, 환경이 식품 또는 식료품인 방법.
  36. 제 19 항에 있어서, 환경이 상수도인 방법.
  37. 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 단편을 갖는 펩티드의 치료 유효량을 피검자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 리포 다당류 (LPS) 와 관련된 질환을 갖고 있는, 또는 가질 위험이 있는 피검자에서 상기 질환을 억제하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항균 조성물을 더 함유하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 항균 조성물이 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 항생제가 아미노글리코시드, 페니실린, 세팔로스포린, 카르바페넴, 모노박탐, 퀴놀론, 테트라사이클린, 글리코펩티드, 클로람페니콜, 클린다마이신, 트리메토프림, 술파메톡사졸, 니트로퓨란토인, 리팜핀 및 뮤피로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제 부류로부터 선택되는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 항생제가 아미카신, 젠타미신, 카나마이신, 네틸미신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트/에틸숙시네이트/글루셉테이트/락토바이오네이트/스테아레이트, 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 앰피실린, 아목시실린, 티카르실린, 카르베니실린, 메즐로실린, 아즐로실린, 피페라실린, 세팔로틴, 세파졸린, 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 세퓨록심, 세포니시드, 세프메타졸, 세포테탄, 세프프로질, 로라카르베프, 세페타메트, 세포페라존, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세프타지딤, 세페핌, 세픽심, 세프포독심, 세프술로딘, 이미페넴, 아즈트레오남, 플레록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 에녹사신, 로메플록사신, 시녹사신, 독시사이클린, 미노사이클린, 테트라사이클린, 반코마이신, 및 테이코플라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  42. 제 37 항에 있어서, 펩티드가 하나 이상의 변형된 아미노산을 함유하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 변형된 아미노산이 카르복시 말단 아미드를 함유하는 방법.
  44. 서열 번호: 1, 6 및 7 로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드의 억제 유효량을 원생동물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 원생동물 증식 억제 방법.
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