CN103131686A - 一种二型肽聚糖识别蛋白及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种美国红鱼二型肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)及其制备和应用。肽聚糖识别蛋白如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示。其制备方法：将质粒pPGRP2转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得BL21/pPGRP2，将其用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后通过亲和层析纯化重组蛋白，即为具有抑菌活性的蛋白。所述二型肽聚糖识别蛋白具有针对革兰氏阳性菌的特异性杀菌作用，从而能够用于抑制革兰氏阳性菌生长或感染。

Description

一种二型肽聚糖识别蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种美国红鱼二型肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)及其制备和应用。

背景技术

肽聚糖(peptidoglycan)是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替连接的杂多糖与不同组成的肽交叉连接形成的大分子。肽聚糖是许多细菌细胞壁的主要成分，尤其在革兰氏阳性细菌中，其所含的肽聚糖占细胞壁干重的50-80％。肽聚糖识别蛋白是一种天然免疫分子，广泛存在于在脊椎动物中，能够特异性识别肽聚糖。肽聚糖识别蛋白通过识别入侵病原细菌的肽聚糖，进而激活Toll和Imd等免疫信号通路并介导吞噬作用，因此在抵抗病原入侵的过程当中发挥着重要的作用。在人类中已发现4种肽聚糖识别蛋白，分别命名为PGRP-1到4。在结构上，所有肽聚糖识别蛋白都在其序列的C端含有一个酰化酶(amidase)结构，该结构在某些肽聚糖识别蛋白中具有酰胺酶活性，这种活性能够降解细菌细胞壁中肽聚糖的酰胺键，导致细菌死亡，因此这类肽聚糖识别蛋白具有杀菌能力。但是鱼类中具有杀菌作用的肽聚糖识别蛋白很少，目前只在斑马鱼和许氏平鲉中发现，在其它鱼种中尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种美国红鱼的二型肽聚糖识别蛋白及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种二型肽聚糖识别蛋白，二型肽聚糖识别蛋白如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示。

二型肽聚糖识别蛋白表达载体的构建方法，以美国红鱼cDNA为模板，用引物PGRPF1和PGRPR1进行PCR扩增，扩增产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSPGRP1；将质粒pBSPGRP1和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收1.4kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为二型肽聚糖识别蛋白表达载体pPGRP2；

所述引物PGRPF1和PGRPR1分别为：PGRPF1，5’-GATATCATGAGGCCAGCAGGTGTC   -3’；PGRPR1，5’-CGATATCATCTCTGAAGTGCTCCCA-3’。

将上述所得二型肽聚糖识别蛋白表达载体pPGRP2转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选转化子即为BL21/pPGRP2，将BL21/pPGRP2于含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.8，并加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再以18℃继续培养8-10小时，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示的二型肽聚糖识别蛋白。

二型肽聚糖识别蛋白的应用，所述序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列的二型肽聚糖识别蛋白可作为革兰氏阳性细菌的杀菌剂。所述革兰氏阳性细菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明具有如下优点：

1.革兰氏阳性菌特异性抑菌作用。本发明的二型肽聚糖识别蛋白可以有效裂解多种革兰氏阳性菌，从而抑制革兰氏阳性菌生长或感染。

附图说明

图1为本发明实施例纯化得到的二型肽聚糖识别蛋白电泳图谱(其中，纯化得到的肽聚糖识别蛋白为泳道2；泳道1：分子量marker。)。

图2.为本发明实施例二型肽聚糖识别蛋白的杀菌效应图(其中，图左为本发明实施例肽聚糖识别蛋白产生的抑菌圈，图右为阴性对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

二型肽聚糖识别蛋白如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示。序列表SEQ ID No.1为：

MTSFGVSIFVLGLSCFFTVYSRPAGVHLRNMDSFIRAVQQVEDSNPGISPLALVRALRRTAGHD

DAMTIHFLGASYNLSDAEVLETAILNASSFSFFDKAIHHIVTDYGEERGVVLTPDGTTVALAPL

LLG I ELGLKAKMEGTPAVGLFSLTLGRTLGLSFLSLQDFPPSYRLGPNGCWDNVDYPKMFKLSQ

AATLATDAVINGGMDGAILGT

DLSNLSAHEPPQALSDILKGYYSFILHEGQGLDALTKHVSPRR

REISRAILEPLDLHSQVMETLALVWKLEKTEWIAFDTGLGKAVKDGLERFVHKYWDCPQIIPRC

QWGAKAHRGTPLPLSLPLRFLYVHHTYEPSSPCLSFPTCSRDMRSMQRYHQEDRGWSDIGYSFV

VGSDGYVYEGRGWNQLGRHTRGHNDVGYGVSIIGNYTATLPSRHAMDLLRHRLVRCAVDGGGLV

ANFTIHGHRQVVNYTSCPGDAFFSEIRTWEHFRD

(a)序列特征：

●长度：482

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：美国红鱼

结构特征：该蛋白的最明显结构特征是含有1个酰化酶结构，由氨基酸327至467构成。

实施例2

二型肽聚糖识别蛋白的制备方法：

1)质粒pPGRP2的构建：

以美国红鱼cDNA为模板，用引物PGRPF1和PGRPR1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，55℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，61℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应7-10min。PCR产物纯化后与载体pBS-T(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSPGRP1。

将上述质粒pBSPGRP1和质粒pET259(质粒pET259的构建过程参见Zheng，W.J.，Hu，Y.H.，Sun，L.，2010.Cloning and analysis of aferritin subunit from turbot(Scoph tha lmus maximus).Fish.Shellfish.Immunol.28(5-6)，829836.)分别用限制性内切酶EcoRV和SwaI酶切后回收1.4kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pPGRP2。

所述引物PGRPF1和PGRPR1分别为：PGRPF1为5’-GATATCATGAGGCCAGCAGGTGTC  -3’，PGRPR1为5’-CGATATCATCTCTGAAGTGCTCCCA-3’。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水。

2)二型肽聚糖识别蛋白的表达和制备：

将步骤1)的质粒pPGRP2转化大肠杆菌BL21(DE3)(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含50ug/ml的卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pPGRP2。将BL21/pPGRP2于含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使培养基中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度达到0.2mM，18℃继续摇动培养8-10小时，而后用GE Healthcare(美国)公司的nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯化重组蛋白(层析条件：用4-5ml Wash buffer洗柱两次，随后用0.5-1ml Elution buffer洗柱，收集所有洗脱液。洗柱时将buffer加到柱中，让其自然流出即可)。将洗脱液中的重组蛋白进行N-端氨基酸测序，证实其分别为序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示的二型肽聚糖识别蛋白，同时将所得洗脱液进行电泳鉴定。电泳条件为：80V，30-40min，然后120V，1.2-1.5h。电泳后将蛋白在Coomassie blue(购于上海生物工程技术服务有限公司)中于37℃染色10-20min(参见图1)。

上述Wash buffer成分为：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0；上述Elution buffer成分为：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mMimidazole，pH 8.0.

实施例3

二型肽聚糖识别蛋白的杀菌效应

1)细菌平板制备。在LB培养基中分别培养海豚链球菌(Streptococcusiniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(皆保存于CGMCC，编号分别为CGMCC No.1984、1.363、1.460)至OD₆₀₀为0.5，分别将菌液与含有0.8％(质量百分比)琼脂的LB混合；将混合液倒入培养皿，凝固后即为细菌平板。

2)二型肽聚糖识别蛋白的杀菌效应检测。将无菌滤纸片置于上述1)的细菌平板上。将实施例2制备的肽聚糖识别蛋白在PBSZ中稀释至5uM，将10ul肽聚糖识别蛋白或PBSZ(阴性对照)加至细菌平板的滤纸片上。将平板于28℃保温12-14h后观察发现，在含有肽聚糖识别蛋白的滤纸片周围形成明显的抑菌圈(即周边细菌被杀死)，而含有PBSZ对照的滤纸片周围则无抑菌圈(参见图2)。因此本发明的肽聚糖识别蛋白具有杀死革兰氏阳性菌的能力，可作为革兰氏阳性菌的抑菌剂应用。

所述PBSZ组成成分为：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mMKH₂PO₄，10μM ZnCl₂。

Claims (5)

1.一种二型肽聚糖识别蛋白，其特征在于：二型肽聚糖识别蛋白如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示。

2.一种权利要求1所述的二型肽聚糖识别蛋白表达载体的构建方法，其特征在于：

以美国红鱼cDNA为模板，用引物PGRPF1和PGRPR1进行PCR扩增，扩增产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSPGRP1；将质粒pBSPGRP1和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV和Swa I酶切后回收1.4kb和5.4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为二型肽聚糖识别蛋白表达载体pPGRP2；

所述引物PGRPF1和PGRPR1分别为：PGRPF1，5’-GATATCATGAGGCCAGCAGGTGTC    -3’；PGRPR1，5’-CGATATCATCTCTGAAGTGCTCCCA-3’。

3.按权利要求2所述的二型肽聚糖识别蛋白表达载体的构建方法，其特征在于：

将上述所得二型肽聚糖识别蛋白表达载体pPGRP2转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选转化子即为BL21/pPGRP2，将BL21/pPGRP2于含有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.8，并加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再以18℃继续培养8-10小时，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示的二型肽聚糖识别蛋白。

4.一种权利要求1所述的二型肽聚糖识别蛋白的应用，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列的二型肽聚糖识别蛋白可作为革兰氏阳性细菌的杀菌剂。

5.按权利要求4所述的二型肽聚糖识别蛋白的应用，其特征在于：所述革兰氏阳性细菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subilis)。

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