CN113583102A - 一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用。所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核酸序列如SEQIDNO.2所示。本申请经PCR扩增PoPGRP原核表达片段，再将其构建到质粒BluntE1上，后导入表达感受态BL21pLysS中进行诱导表达与纯化复性蛋白，从而得到具有活性的牙鲆PGRP重组蛋白。构建得到的牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白可以与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌发生凝集，同时也具有一定的杀菌作用。

Description

一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
肽聚糖识别蛋白(PGRP)是一种重要的天然免疫识别受体，在机体的免疫防御机制中扮演着重要角色。目前PGRPs大致可以分为短型PGRP(PGRP-S)、中间型的PGRP(PGRP-I)、长型PGRP(PGRP-L)三类。PGRP-S最短，PGRP-L最长，PGRP-I的大小居于二者之间。PGRP在生物机体免疫相关的细胞、组织、器官中都有表达。如昆虫的PGRP-S在淋巴、表皮、脂肪体细胞、血细胞、内脏等多处都有分布，PGRP-L主要分布在血细胞中。哺乳动物中，表达量最多的为PGRP-S，在中性粒细胞的颗粒中广泛存在，其次为PGRP-L，主要存在于肝脏中，表达量最低的为PGRP-I，主要在皮肤、食道等都有分布。硬骨鱼中，PGRP-S在鱼鳃中表达较多，PGRP-L在鱼肠具有较高表达。
牙鲆(Paralichthys olivaceus)又称比目鱼，体型扁平呈卵圆形，两眼位于头部的左侧，尾柄较长，牙齿尖锐，呈锥形状。牙鲆属于冷温性底栖鱼类，成鱼最适生长的温度为14℃到23℃。牙鲆为广盐性鱼类，可在盐度低于8‰的条件下生活，其次对低溶氧的难受力较强。幼鱼及成鱼多捕食鱼类、头足类与甲壳类，其产卵期约在4-6月。牙鲆为名贵海产鱼类，同时又是重要的海水增养殖鱼类之一，是较有前途的养殖品种。目前PGRP在草鱼、黄花鱼、鲤鱼、虹鳟鱼、许氏平鮋、斑点叉尾鮰、斑马鱼等硬骨鱼都有一定的研究。牙鲆作为经济价值较高的鱼类，生存也面对着考验，由于环境的污染及人类对抗生素的大量滥用，使得细菌对抗生素的耐药性大大增加，这严重的危机到了牙鲆的生存，也威胁到了人类的身体健康。研究牙鲆PGRP对其生存生长具有重大意义，同时也可以改善滥用抗生素的状况，带给养殖户更高的效益。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用。
第一方面，本申请提供一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白，是通过以下技术方案得以实现的。
一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
第二方面，本申请提供一种编码上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的核酸，是通过以下技术方案得以实现的。
一种编码上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的核酸，所述核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
第三方面，本申请提供一种上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的制备方法，是通过以下技术方案得以实现的。
一种上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1.以牙鲆PGRP ORF区基因序列为模板，采用上、下游引物对其进行扩增得到目的DNA；上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
S2.将扩增得到的目的DNA与Blunt E1质粒连接，转化感受态细胞，得到重组质粒；
S3.将构建成功的重组质粒转化表达菌株进行诱导培养，再进过纯化、复性后得到牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白。
进一步的，步骤S3中，采用海狸磁珠对粗牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白进行纯化。
第四方面，本申请提供一种上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备抗菌药物中的应用，是通过以下技术方案得以实现的。
一种上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备抗菌药物中的应用。
进一步的，所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白抑制创伤弧菌、藤黄微球菌的生长。
第五方面，本申请提供一种上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备诊断细菌感染试剂中的应用，是通过以下技术方案得以实现的。
一种上述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备诊断细菌感染试剂中的应用。
进一步的，所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白与无乳酸链球菌、鳗弧菌、创伤弧菌、藤黄微球菌、枯草杆菌或迟缓爱德华氏菌发生凝集。
本申请具有以下有益效果。
本申请经PCR扩增PoPGRP原核表达片段，再将其构建到质粒Blunt E1上，后导入表达感受态BL21pLysS中进行诱导表达与纯化复性蛋白，从而得到了具有活性的牙鲆PGRP蛋白。采用本申请方法得到的牙鲆PGRP重组蛋白对藤黄微球菌和创伤弧菌都有明显的抑制作用，尤其是对创伤弧菌的抑制作用相对更强；另外，在不加Zn+的情况下，牙鲆PGRP重组蛋白对无乳链球菌、鳗弧菌、创伤弧菌、藤黄微球菌、枯草杆菌、迟缓爱德华氏菌这六种菌都可以发生凝集，且凝集效果都非常明显。
附图说明
图1是本申请PoPGRP原核表达片段的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本申请胶回收后目的基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是本申请连接转化后单菌落pcr的琼脂糖凝胶电泳图；
图4是本申请PoPGRP重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图(M:Takara ProteinMarker；1：空白对照；2：结合前；3：结合后；4：洗柱；5：脱1；6：脱2)；
图5是本申请PoPGRP纯化液透析与浓缩后SDS-PAGE电泳图(M:Takara Marker；1：空白对照；2：菌破碎后的上清；3：复性蛋白)；
图6是本申请藤黄微球菌与PoPGRP孵育后生长状况图；
图7是本申请创伤弧菌与PoPGRP孵育后生长状况图；
图8是本申请PoPGRP与细菌结合荧光凝集结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对发明进行进一步的说明。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌株与质粒
大肠杆菌DH5α、BL21pLysS感受态：擎科生物科技有限公司
Blunt E1质粒：全式金生物科技有限公司
1.1.2实验试剂
引物合成：擎科生物科技有限公司
金Mix:擎科生物科技有限公司
胶回收试剂盒：擎科生物科技有限公司
核酸染料：擎科生物科技有限公司
质粒提取试剂盒：天根生物科技有限公司
胰蛋白胨(TRYPTONE)：OXOID生物科技有限公司
酵母提取物(YEAST EXTRACT)：OXOID生物科技有限公司
氯化钠：国药集团化学试剂有限公司
琼脂粉：Solarbio生物科技有限公司
氨苄青霉素：擎科生物科技有限公司
氯霉素：擎科生物科技有限公司
IPTG诱导剂：擎科生物科技有限公司
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒：上海帛龙生物科技有限公司
NaH2PO4·2H2O：国药集团化学试剂有限公司
尿素：OXOID生物科技有限公司
咪唑：OXOID生物科技有限公司
海狸磁珠：BEAVER生物科技有限公司
PBS：天根生物科技有限公司
FITC：天根生物科技有限公司
TBS:擎科生物科技有限公司
1.1.3主要仪器
PCR仪：美国Thermo公司有限
切胶仪：美国伯腾仪器有限公司
三孔温水槽：常州诺基仪器公司
迷你离心机：美国ABSON有限公司
台式微量离心机：美国Beckmen Coulter有限公司
大型离心机：德国Hettich有限公司
震荡培养箱：上海旻全仪器有限公司
凝胶成像仪：美国Bio-Rad有限公司
电泳仪和电泳槽：美国Bio-Rad有限公司
微量分光光度计：杭州奥盛仪器有限公司
超声破碎仪：宁波新芝生物科技有限公司
高压蒸汽灭菌锅：日本TOMY有限公司
净化工作台：上海博迅医疗设备厂
荧光显微镜：美国Bio-Rad有限公司
1.2方法
1.2.1引物设计
用DNAMAN软件，根据已知的牙鲆PGRP ORF区基因序列(Accession:JQ890080.1GI:449885199)设计PoPGRP原核表达引物，后送至擎科生物科技有限公司进行合成。
PGRP引物序列为
F：AGCAAGCCGGTAGGTGTC(SEQ ID NO.3)；
R：TCAGAACCTGAAGTGTTCCCA(SEQ ID NO.4)
1.2.2 PoPGRP原核表达片段扩增
反应体系如下表1：
表1 PGRP基因克隆反应体系
Figure BDA0003234874980000051
表中的cDNA为牙鲆肝脏组织提取RNA反转录成cDNA
反应程序：
Figure BDA0003234874980000061
1.2.3PoPGRP原核表达片段回收
1)打开水浴锅，使水温升高到65℃。
2)使硅胶膜活化。首先吸取Buffer BL 250ml于吸附柱EC中，之后进行离心，转速12000rpm，时间1min。
3)切胶。将胶放到切胶仪上，用干净的刀片切下具有目的DNA的条带。切记，切胶过程要仔细，动作一定要慢，尽量使回收凝胶的体积最小。
4)取一只干净的2ml离心管，将回收具有目的DNA条带的凝胶放入。
5)取500μL的Buffer GL加入该离心管中。
6)把该离心管放入预先加热好的水浴锅中进行水浴，温度65℃，时间4-6min。在此期间，每2-3min，上下翻动离心管一次，使胶块完全溶解，如若凝胶块太大，可适量增加Buffer GL。
7)凝胶块完全溶解后，将离心管中的溶液转到第二部处理好的吸附柱EC中，进行离心，转速12000rpm，时间1min。离心完毕后，倒掉收集管中的废液，把吸附柱EC重新放回。
8)取Buffer W2700μL加入到吸附柱EC中，后进行离心，转速12000rpm，时间1min，收集管中的废液掉到。Buffer W2在使用之前要提前检查是否已经加入适量的的无水乙醇。
9)重复一次步骤8。
10)弃除收集管中的废液后，将吸附柱EC重新放回收集管，后进行离心，转速12000rpm，时间2min。
11)离心完毕后，取一个干净的1.5ml的离心管，将吸附柱EC取出放入到该离心管中，室温(20-25℃)静放2min，后取预热好的Eluent 35-50μL于吸附膜的中央位置,室温静放2min，进行离心，转速12000rpm，时间2min。就得到了目的DNA溶液，做好标记。
1.2.4连接与转化
(1)连接
首先取出一个干净的离心管，向其加入1μL得到的目的DNA原液和1μLBlunt E1原液，在25摄氏度下，静放置15min进行连接。
(2)转化
1)将大肠杆菌DH5α感受态从-80℃中取出，放置于冰上解冻，取50μL于干净的离心管中，后向其加入1μL(上一步得到的)连接体系，轻轻摇晃离心管，混匀体系。
2)混匀体系后先放于冰上进行冰浴，约30min，目的使重组载体紧贴感受态细胞膜；再放于水浴锅中42℃，热激45s，使贴在感受态细胞膜上的质粒进入感受态中。
3)热激完毕后，取出离心管立刻放于冰上2-3min,在此过程期间不可摇晃离心管。
4)冰浴结束后，取300-400μL(不含抗生素)的LB液体培养基加入离心管中，将离心管放于温度37℃，180转的摇床上震荡培养50min，复苏菌体。
5)在震荡期间，将固体LB培养基放于微波炉融化待冷却适当温度时(不烫手背即可)，先取一支干净得试管，向其加入30ml的培养基，再加入30μL的氨苄青霉素。(氨苄青霉素和培养基以1:1000的比列加入)，摇荡均匀后，即可倒平板，晒凉至凝固。
6)将复苏后的大肠杆菌进行离心，转速3000rpm，时间1-2min。除去上清，用移液枪吸取剩下的菌液于凝固好的平板上，后用涂布棒将菌液均匀涂布，待出现涩涩的感觉即可。涂好平板后做好标记，放于37℃恒温培养箱中，进行过夜培养。
1.2.5菌落PCR鉴定及测序
(1)菌落PCR
1)翌日，先取20个离心管，先向其10个离心管中加入10μL的ddH2O，剩余的10个离心管与这10个离心管一一对应。用枪头轻轻挑取该平板上的10个单个菌落分别放于含有ddH2O的离心管中，轻轻吹打，使细菌和ddH2O充分混匀，分别吸取2μL的菌液放于相对应的离心管中，再将该10个离心管置于PCR仪中，反应条件如表2。
表2菌落PGRP基因克隆反应体系
Figure BDA0003234874980000081
反应程序：
Figure BDA0003234874980000082
PCR反应完成之后，每个离心管分别取产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。如若没有条带，需查找原因，如温度，引物等条件，重新进行PCR程序。
2)将检测出具有正确目的条带大小所对应的菌液进行扩增培养。首先，取一只干净带有刻度的试管，向其倒入液体培养基，后加入氨苄青霉素，混匀。再取若干支干净的试管，均匀的将处理好的液体培养基分到这几支试管中。然后将具有正确目的片段所对应的菌液拿出来，用移液枪把菌液分别加入到这几支试管中，做好标记，整个过程在超净台完成。所有步骤完毕之后，把该试管放于温度37℃，160转的摇床上震荡培养16个小时。
(2)测序
翌日，将摇起来的菌液，分别取适量于离心管中，用封口膜封口，送至擎科生物科技有限公司测序。如若菌液没有摇起来，再从原来的平板上重新挑取菌落，再按照PCR程序、凝胶电泳检测、摇菌扩增培养一系列步骤重新做，如果这样还是菌还是没有摇起来，就要分析原因，从连接与转化重新做。
1.2.6提取质粒
对测序正确的菌液进行过夜扩增培养，翌日提取质粒，提取过程如下：
(1)使硅胶膜活化。首先取250μL的Buffer BL加入吸附柱AC中，后进行离心，转速12000rpm，时间1min；打开水浴锅，使其温度升至65℃。
(2)收集菌体。吸取1-4ml过夜扩增培养的菌液于离心管中，后进行离心，转速12000rpm，时间1min。
(3)向带有菌液离心管中加入Buffer S1200μL，使菌体沉淀重新悬浮，Buffer S1在使用之前先检查是否已经加入了RNase A。
(4)菌体全部悬浮后，吸取Buffer S2200μL加入该离心管中，缓缓地上下翻转数次(如若翻转动作大，会打断目的基因，导致质粒的纯度低)，但翻转时间不要过长，以防止质粒破坏，该步骤目的是充分裂解菌体。
(5)菌体裂解完毕之后，取Buffer S3200μL加入该离心管中，缓缓的上下翻转数次，充分混匀溶液，混匀后进行离心，转速12000rpm，时间15min。
(6)缓慢吸取上清液(不能吸沉淀)，转入吸附柱AC中(枪头不能触碰膜，膜易破碎)，之后进行离心，转速12000rpm，时间1min。离心完毕后，把收集管中的废液倒掉，然后将吸附柱AC重新放回收集管中。
(7)取Buffer W2(已加入无水乙醇)700μL加入到吸附柱AC中，加入完毕后进行离心，转速12000rpm，时间1min。倒掉收集管中的废液。
(8)重复一次步骤7
(9)将吸附柱重新放回收集管后进行离心，转速12000rpm，时间1min，目的为将漂洗液除去干净。离心完后，将吸附柱盖打开2-3min，挥发乙醇。
(10)取一个灭过菌的1.5ml的离心管，将吸附柱AC从离心管中取出放入其中，室温(20-25℃)静放2min；把Eluent放入水浴锅中15s,取预热好的的Eluent 35-50μL于吸附膜的中央，室温静放2min，之后进行离心，转速12000rpm，时间2min，就得到了质粒溶液。
1.2.7将测序正确的质粒倒入表达感受态细胞中，诱导原核表达
(1)首先将冷冻好的冰袋放入泡沫箱中，盖盖儿，后从-80℃中取出BL21pLysS表达感受态于泡沫箱中进行解冻。
(2)向干净的离心管中加入1μL的测序正确的质粒和50μL BL21pLysS表达感受态，混合均匀，冰浴30min。打开水浴锅，使温度升至42℃。
(3)冰浴结束后，取出离心管放于预热好的水浴锅中进行热激，时间45s。后再放入泡沫中冰浴2min。
(4)2min冰浴完毕后，取300μL液体LB(不含抗生素)于该离心管中(该步骤在超净台中完成)，后放于37℃、200rpm的摇床上，进行复苏1h。在复苏等待期间，把固体培养基放于微波炉中融化后放于超净台中进冷却，至不烫手背；后取一离心管，向其加入30ml LB、30μL氨苄青霉素和30μL氯霉素，混合均匀后倒入平板中等其凝固。
(5)复苏结束，从摇床取出离心管进行离心，转速3000rpm，时间1min。倒掉上清，吸取沉淀于处理好的平板上，用涂布棒将其涂布均匀，做好标记，到放于37℃恒温培养箱中，过夜培养。
(6)翌日，先取一干净的离心管加入10μL ddH2O，后用枪头挑取单菌落于该离心管中，混合均匀，取2μL菌液为模板进行PCR扩增和电泳检测。
(7)若凝胶上有目的条带，将剩余的8μL菌液进行扩增。首先取5ml液体LB、1ml氨苄青霉素和1ml氯霉素于一干净的离心管中，混合均匀，后再向其加8μL的菌液放于37℃、200rpm的摇床上，培养16h。
(8)翌日，向两个干净的试管中分别加入5ml液体LB、5μL Amp和5μL CM，再各加入培养16小时的菌液50μL，混匀，一个标记为实验组，另一个对照组，放入37℃、180转的摇床上，摇2h。
(9)2h结束后，测实验组菌液的OD值，使OD600≥0.6-0.8。测OD值时，首先用液体LB空白纠正，后再测实验组菌液OD值。
(10)若实验组菌液OD值在0.6-0.8之间，加IPTG诱导，所用IPTG的浓度为0.5mM，该实验所用的IPTG原浓度为500mM，所以向试管中加入5μL IPTG，而对照组不加。继续放入37℃、180rpm摇床上，摇4-5h。
(11)诱导结束后，各取实验组、对照组菌液1ml于干净的离心管中，做好标记，进行离心，转速10000rpm，时间1min，弃掉上清，收集菌沉淀。
(12)分别向该两离心管中加入50μL无菌水和15μL loading buffer混合均匀，悬浮。
(13)后煮沸10min，进行离心，转速10000rpm，时间5min，两离心管各取样10μL，跑蛋白胶检测。
(14)若如有目的条带，进行扩菌培养。首先是接种，菌液与液体培养基的比列为1:100接种，放于摇床上；2h后测OD值，若其在0.6-0.8之间，加入0.5mM IPTG进行诱导，再放入摇床；4-5h结束后，进行分装(如50ml菌液一个离心管)，离心(9000rpm、10min)，去上清，留菌沉淀，冷藏保存。
1.2.8蛋白质的纯化及复性
(1)蛋白纯化
1)缓冲液的配制
该实验蛋白纯化所用的磁珠为海狸磁珠(镍离子鳌合磁珠)，所以要准备两种种缓冲液，浓度为0.5mol/L定容200ml。
Buffer I：取一干净的烧杯，向其加入NaH2PO416.2ml、NaCl 5.86ml、尿素96g，放到热水锅中加热溶解，冷却后进行定容至200ml，用PH仪测其PH，并调其PH至7.4左右，装入细口瓶中，做好标记。
Buffer II：将其配方变为NaH2PO416.2ml、NaCl 5.86ml、尿素96g、咪唑6.8g，配制过程与Buffer I一样。
2)破菌。取菌沉淀，向其加入5ml的Buffer I，用移液枪不断吹打，使菌沉淀完全溶解于Buffer I。后打开超声破碎仪，用水清洗变幅杆，再取大的烧杯，将两个冰袋放入加满水，放入超声破碎仪的托盘上；再使变幅杆插入已处理好菌液的离心管中(确保变幅杆插入液面以下)，固定住，注意变幅杆不能碰离心管环壁及底部，后挪动托盘，使离心管插入烧杯中，位于两块冰袋之间，固定住。关闭超声破碎仪门，检测，破碎声音正常，设置时间60min，启动。如若破碎声音不正常，重新安置离心管。
3)离心。破菌完毕之后进行离心，首先将离心管从超声破碎仪中取出，然后向变幅杆上喷洒酒精，用蒸馏水冲洗干净，后对离心管进行称重，再配一个与其重量相同的离心管，一同放入离心机进行离心，转速9000rpm，时间10min。
4)悬浮海狸磁珠。在离心等待期间，可悬浮磁珠。取一新的离心管，向其加入5ml的磁珠，放于磁性分离器上，弃掉上清液，将离心管取下，再向离心管中加入5ml的Buffer I，上下轻轻翻动离心管若干次，目的悬浮离心管中的磁珠，后将离心管放于磁性分离器上进行磁性分离，弃除上清液，再重复此步骤2次(最后一次，先不要将上清液弃掉)。
5)目的蛋白与磁珠结合。离心完毕后，取出离心管，取100μL的菌液上清于一干净的1.5ml离心管中，做好标记(可标记为结合前)。再将具有磁珠离心管的上清液倒掉，后将剩余的菌液上清全部加入具有磁珠的离心管中，把该离心管放于旋涡混匀器上震荡15s，后放在摇床上，摇晃混合30min。在摇晃离心管的过程中，要不断观看，以防止离心管的盖子松动。
6)摇晃完毕后，将离心管取出放于磁性分离器上进行磁性分离，再取一干净的离心管，将上清液移入其中，标记为结合后。
7)洗涤磁珠。向具有磁珠的离心管中加入4ml Buffer I和1ml Buffer II，放在摇床上，摇晃混合30min，后取下放入磁性分离器上，将上清液放于一个干净的离心管中，标记为洗柱。
8)洗脱目的蛋白。向带有磁珠的离心管中加入5ml Buffer II，放于摇床上，摇晃20min，后进行磁性分离，上清液转入一个干净的离心管中，标记为脱1。
9)向带有磁珠的离心管中加入3ml Buffer II，重复一次步骤8，标记为脱2。再向离心管中加5ml Buffer II清洗磁珠，上下颠倒数次，弃掉上清，后加适量ddH2O，放入4℃冰箱保存。
(2)SDS-PAGE验证。
1)安置胶板。厚玻璃板在后，薄的在前，有箭头的在上边，放在打开的固定器上，后将固定器放于架子上。向两块玻璃之间注入蒸馏水，若1min后不漏水，将其里面的水倒出。
2)配胶。按照试剂盒上说明配胶，先配分离胶，再配浓缩胶，加入浓缩胶后，插上梳子，等其凝固。
3)制样。取4个干净的离心管，标记为结合后、洗柱、脱1、脱2，从相应的离心管中分别取出100μL加入其中。后向结合前及这几个离心管中加入适量染色液，煮沸10min。
4)点样。将配好的胶放入电解槽中，加入缓冲液(一块胶加至2G，两块胶加至4G)，等待几分钟后将梳子拔出。Mark 7μL、空白及被检样品各10μL加入胶孔中。
5)电泳。电压300V，时间30min。
6)染色。将胶块取出，放入胶盒中，加入染色液至淹没胶块，放入微波炉中至烫手为止。放在摇床上20min。
7)脱色。将胶盒中的染色液倒入小瓶中(染色液可重复利用)，后向胶盒中加清水清洗，至清洗的水干净为止。
8)看图。将胶快放入凝胶成像仪上，电脑看图，并保留图片。
(3)复性
通过看图，将有目的条带的脱1、脱2转于透析袋中，将透析袋依次放入8M、6M、4M、3M、2M、1M、0M尿素的复性液中进行透析，每隔8个小时换下一浓度的复性液。透析结束后，将透析袋中的蛋白装入一个干净的离心管中，进行离心，转速10000rpm，时间5min。弃掉沉淀，并将上清液每100μL分放到离心管中，做好标记，保存备用。
1.2.9PoPGRP体外功能的初步研究
(1)牙鲆PGRP细菌的抑制实验
1)取藤黄微球菌、创伤弧菌各500μL于两个干净的离心管中进行离心，转速3000rpm，时间3min。
2)去掉上清，留在菌沉淀，向两个离心管中加入1ml PBS清洗，再离心，转速3000rpm，时间3min，去上清，留沉淀，后再加入PBS 1ml，悬浮。
3)测OD值。首先用PBS空白校对，后取出500μL PBS，加入500μL菌液，测OD值，得出结果乘四就是菌液的OD值。
4)将藤黄微球菌、创伤弧菌的OD值调整至0.8，后再各取出100μL菌液进行稀释，至50μL的菌液大约有2000个菌。
5)首先取出四个干净的离心管，两个加入50μL的藤黄微球菌菌液，另两个加入50μL的创伤弧菌菌液，一组藤黄、创伤弧菌标为实验组，另一组藤黄微球菌、创伤弧菌标位对照组，后进行离心，转速3000rpm，时间1min。
6)向实验组各加目的蛋白50μL，而对照组各加TBS 50μL，后藤黄微球菌放于37℃、60rpm的摇床上，而创伤弧菌放于28℃、60rpm的摇床上。
7)在30、60、90、120min时间段，取实验组、对照组菌液各10μL涂平板，隔夜培养，第二天，观察菌的生长情况。
(2)细菌荧光凝集
本实验所用菌为无乳链球菌、鳗弧菌、创伤弧菌、藤黄微球菌、枯草杆菌、迟缓爱德华氏菌。步骤如下：
1)取这6种菌液各200μL于6个新的离心管，做好标记，该组为实验组。同样再取这6种菌液于另6个干净的离心管中，做好标记，该组为对照组。
2)实验组、对照组的菌液进行离心，转速3000rpm，时间1min。弃掉上清，留菌沉淀。
3)向各有菌沉淀的离心管中加200μL的PBS进行清洗，后进行离心，转速3000rpm，时间1min，重复此步骤一次。
4)分别向实验组和对照组的各个离心管中加入适量FITC、PBS 300μL，混合均匀，37℃，50-60rpm，摇床孵育1h。FITC在光下易分解，所以进行孵育时可用锡纸将离心管包裹住。
5)孵育完成后，对实验组和对照组进行离心，转速3000rpm，时间1min，去掉上清，留菌沉淀；
6)将目的蛋白进行离心，转速10000rpm，时间5min，分别取上清液10μL于实验组的6个离心管中，并将目的蛋白和菌沉淀混合均匀悬浮，放于摇床上进行孵育，温度37℃，转速50-60rpm，时间20min。对照组的6个离心管分别加入10μL TBS，混合均匀，放入摇床。
7)孵育结束后，从各个离心管中取20μL溶液于干净的载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察凝集情况并拍照保存。
2结果
2.1 PoPGRP原核表达片段的扩增
用设计好的引物，进行PoPGRP原核表达片段的扩增，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图1，其扩出条带大小与预期相符，目的DNA大小为1386bp。
2.2胶回收鉴定
凝胶回收的结果如图2，从图可以看出目的条带清晰明亮，回收的效果很好。
2.3 PoPGRP菌落PCR与测序鉴定
连接转化完毕后，挑取单菌落，进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3。一共挑取了10个单菌落，由图可以看出1、3、4、6、7、10组中有清晰单一的条带，并且是符合要求的。把有相似于目的基因的这6组菌液送至擎科生物科技有限生物公司进行测序，测序结果与NCBI数据库中的牙鲆PGRP区域序列比对相似性为100％。
重组蛋白的DNA序列(SEQ ID NO.2)如下：
AGCAAGCCGGTAGGTGTCCACTTACGGAACATGGACAGTTTCATCCGCGCTGTGCAGCAAGTTGAGGACTCTGACCCTGGCACGTCCCCTCTGGCTCTGGTCAGGGCCCTGCGGAGGACTGCTGGCCATGATGATGCAATGACAATCCATTTCCTGGGTGCGTCAAATAATCTCAGTGATGCTGAAGTCCTTGAGACAACAATGCTTAATGCCTCGCGCTTCAGCTTTTTTGATAAGGCCATCCATCATATTGTGACAGACTATGGAGAGGAACGTGGGGTGGTTCTTGCTCCAGATGGCACCACAGTGGCACTTGCACCATTACTGCTGGGAATCGAGTCAGGACTGAGGGCAAAGATTGAGGGGAAGCCAGCTAATGGCATCTTCCCTCTTACCTTGGCCAGGACACTGGGCCTGTCCTTCCTCAGCCTCCAGGACTTCCCACCACGTTATCGCATGGGGCCAAGTGGGTGCTGGGACAATGTGGAGCACCCTAAGGTGTTCAGTCTGTCTCGGCTTCCCACTCTGGCCACTGATGCTATGATTAATGGTGGCATGGATGGAGTTGTACTGGGCATGAACCTCAGCAATCAAAGTGAACCTGAAAAGCCAAAAGCCCTCAGTAAGATCTTGAGAGGATACTATAGTTTTACTTTGCATGAGGGGCAGGGCCTTGATGCTGTGACCAGCCACATTAGCCCGAAGCGACGGGAGATATCTAGAGCCTTTCTGGAACCACTTGATTTACACAGCCAGGTGATGGAGACACTGGCATTGGTCTGGAAGCTGGAGAAGACAGAATGGATTGCCTGGGACACTGGAGTGGGGCAAGCGGTGAAGGATGGATTGAAGGCATTTGTACATATATACTGGGACTGCCCTCAAATCGTTCGTCGTTGTCAGTGGGGGGCAAAATCCCTCCAGGATACCCCCATCCCACTGTCTTTGCCCCTTCACTTCCTGTATGTGCACCACACCTACGAGCCATCCTCACCCTGTATGTCCTTCCCACAGTGCTCTCGTGACATGAGAGCCATGCAGAGGTTCCACCAGGAGGACCGTGGCTGGAGCGACATCGGATACAACTTTGTGGTGGGCTCTGACGGCTACGTATATGAAGGAAGAGGTTGGAAATACCTCGGCACACACACCAGGGGCCACAATAGCCTCGGGTATGGGGTGTCAATCATTGGTAACTACACCGCCACCCTTCCCTCTCGCCACGCCATGGACCTATTGCGTCATCGTCTGGTCCATTGTGCAGTAAATGGAGGAGGATTGTCTGCCAACTTCACCATCCATGGCCACAGGCAGGTGGTAAACACTTCCTGTCCTGGAGATGCCTTCTTCTCTGAAATAAGAAGCTGGGAACACTTCAGGTTCTGA
2.4 PoPGRP的纯化与复性
将倒入目的质粒培养过后的菌超声波破碎，取上清液进行纯化及复性，结果如下图4-5。
纯化蛋白所用的是海狸磁珠，通过结果图可以看出纯化及复性获得目的条带比较明亮、清晰，说明该磁珠的纯化效果比较好。
重组蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
SKPVGVHLRNMDSFIRAVQQVEDSDPGTSPLALVRALRRTAGHDDAMTIHFLGASNNLSDAEVLETTMLNASRFSFFDKAIHHIVTDYGEERGVVLAPDGTTVALAPLLLGIESGLRAKIEGKPANGIFPLTLARTLGLSFLSLQDFPPRYRMGPSGCWDNVEHPKVFSLSRLPTLATDAMINGGMDGVVLGMNLSNQSEPEKPKALSKILRGYYSFTLHEGQGLDAVTSHISPKRREISRAFLEPLDLHSQVMETLALVWKLEKTEWIAWDTGVGQAVKDGLKAFVHIYWDCPQIVRRCQWGAKSLQDTPIPLSLPLHFLYVHHTYEPSSPCMSFPQCSRDMRAMQRFHQEDRGWSDIGYNFVVGSDGYVYEGRGWKYLGTHTRGHNSLGYGVSIIGNYTATLPSRHAMDLLRHRLVHCAVNGGGLSANFTIHGHRQVVNTSCPGDAFFSEIRSWEHFRF
2.5 PoPGRP细菌抑制
为了初步验证PoPGRP抑制细菌的特性，本申请针对藤黄微球菌、创伤弧菌两种菌进行了涂平板实验，结果见表3-4和图6-7。
表3藤黄微球菌与PoPGRP孵育后生长状况
Figure BDA0003234874980000161
表4创伤弧菌与PoPGRP孵育后生长状况
Figure BDA0003234874980000162
Figure BDA0003234874980000171
通过表3与图6可以看出，30min时，对照组与实验组菌的个数差别不大，但是60min时，实验组的菌个数只有几十个，说明牙鲆PGRP可以抑制藤黄微球菌的生长。而通过表4与图7可以看出，30min时，对照组与实验组菌个数就相差很多，60min时，实验组的菌几乎都没有了，说明牙鲆PGRP可以有效的抑制创伤弧菌的生长，但牙鲆PGRP对创伤弧菌的抑制作用要远大于藤黄微球菌。
2.6细菌荧光凝集
荧光凝集实验是细菌先与FITC染料结合，之后PoPGRP蛋白再与细菌结合。在荧光显微镜下，通过观察凝集情况，来看目的蛋白对细菌的影响。荧光凝集的实验结果如下图8。
通过实验组和对照组的对比，实验组都发生了凝集，说明不管是对革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，PoPGRP可以与细菌结合，可以与其发生作用。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的核酸，其特征在于：所述核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种权利要求1所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.以牙鲆PGRP ORF区基因序列为模板，采用上、下游引物对其进行扩增得到目的DNA；上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
S2.将扩增得到的目的DNA与Blunt E1质粒连接，转化感受态细胞，得到重组质粒；
S3.将构建成功的重组质粒转化表达菌株进行诱导培养，再进过纯化、复性后得到牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤S3中，采用海狸磁珠对粗牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白进行纯化。
5.一种权利要求1所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备抗菌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白抑制创伤弧菌、藤黄微球菌的生长。
7.一种权利要求1所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备诊断细菌感染试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白在制备诊断细菌感染试剂中的应用，其特征在于：所述牙鲆肽聚糖识别蛋白的重组蛋白与无乳酸链球菌、鳗弧菌、创伤弧菌、藤黄微球菌、枯草杆菌或迟缓爱德华氏菌发生凝集。
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