CN102234657B - 一种抗鸡球虫病的融合蛋白及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗鸡球虫病的融合蛋白及其制备和应用。本发明提供一种融合基因及其表达的融合蛋白，所述融合基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明还构建了包含上述融合基因的重组质粒。本发明提供的融合蛋白可用于制备预防鸡球虫病的药物。

Description

一种抗鸡球虫病的融合蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种抗鸡球虫病的融合蛋白及其制备和应用。

背景技术

球虫是严重危害家禽生长发育的一类重要寄生性原虫，隶属于艾美耳科(Eimeriidae)的4个属，即艾美耳属(Eimeria)、等孢属(Isospora)、泰泽属(Tyzzeria)和温扬属(Wenyonella)。鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起以下痢，血便为主要特征的肠道寄生虫病，其中以柔嫩艾美耳球虫毒力较强。其发病率为50％～70％，死亡率为20％～30％，严重时可达80％。除发病死亡外，还可导致饲料报酬降低和胴体质量下降等其他损失。它是集约化养鸡业最为多发，危害严重且防治困难得疾病之一，也是所有动物疾病中经济损失最为严重的疾病之一。该病分布广泛，世界各地普遍发生，全球每年因球虫病引起的经济损失高达20亿美元；我国虽没有具体的统计数字，但随着集约化养鸡业的迅速发展，因球虫病造成的直接经济损失和防治球虫病所造成的间接损失是可想而知的。估计我国仅抗球虫药的年消费就高达2.4亿～4.8亿元人民币。

虽然人们采取了穿梭用药、轮换用药、联合用药等各种措施，但耐药虫株的出现仍是防不胜防。而新药研制费用增加(约为5亿美元)、审批周期长(可能达10年)、严格的药物检测残留标准等原因，使抗球虫药的研制和使用受到了极大限制。因此，从20世纪80年代开始，对球虫病的控制研究逐渐转向了疫苗的研制。由于不可能直接从球虫纯化出大量的可作为疫苗的抗原蛋白质，而应用DNA重组技术则有可能达到这一目的。因此大大推动了球虫分子生物学的迅猛发展。但由于球虫基因组庞大，生活史复杂，同一球虫不同的发育阶段存在各自特异性抗原和共同的特异性抗原。目前为止，只有部分基因和基因片段被克隆出来，并证实克隆出的单一重组抗原只具有部分保护性，球虫的保护性抗原可能是由各阶段虫体所具有的保护性抗原共同组成，并且有些抗原对某一种球虫有保护性，而球虫感染往往是两种或以上球虫混合感染。因此，急需研究寻找一些具有交叉免疫保护的抗原。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种融合基因、其表达的蛋白及其制备和应用。将鸡E.tenellaYL株相关抗原基因3-1E基因和TA4基因构建融合基因，后进行原核表达，可得到多抗原共表达重组疫苗，更好地防治鸡球虫病。

本发明提供的融合基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述融合基因的合成方法，包括如下步骤：

1)采用RT-PCR方法扩增3-1E基因和TA4基因；

2)分别将3-1E基因和TA4基因连接到载体pMD18-T上，构建克隆载体pMD18-T-3-1E和pMD18-T-TA4；

3)以步骤2)所得载体pMD18-T-3-1E为模板，进行PCR扩增，上游引物为P5：5′-GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3′，下游引物P6：5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCCCTGGTACAG-3′；

4)以步骤2)所得载体pMD18-T-TA4为模板，进行PCR扩增，上游引物P7：5′-GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAG-3′；下游引物为P8：5′-CATGTCGACCGCCGCCATATCTGTCCAAT-3′；

5)以步骤3)和步骤4)的PCR产物为模板，进行PCR扩增，上游引物为P5：5′-GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3′，下游引物为P8：5′-CATGTCGACCGCCG CCATATCTGTCCAAT-3′，得到3-1E-TA4融合基因。

本发明提供一种重组质粒，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，上述重组质粒是指pET-32a-3-1E-TA4。

本发明提供一种抗鸡球虫病的融合蛋白，由上述3-1E-TA4融合基因表达而得。

上述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)将所述3-1E-TA4的融合基因连接到载体pMD18-T上，构建载体pMD18-T-3-1E-TA4；

2)对分别对所述载体pMD18-T-3-1E-TA4和表达载体pET-32a(+)进行双酶切，将回收的3-1E-TA4融合基因，与表达载体pET-32a(+)连接，得到重组质粒pET-32a-3-1E-TA4；

3)步骤2)所述的重组质粒pET-32a-3-1E-TA4转化大肠杆菌；

4)培养步骤3)所得大肠杆菌，制备与纯化融合蛋白。

本发明还提供上述融合蛋白在预防鸡艾美耳球虫病中的应用。

本发明提供的技术方案能够达到以下技术效果：

3-1E基因对堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫具有交叉保护性；TA4基因也同时对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫有保护性。3-1E-TA4融合基因进行原核表达可得到多抗原共表达蛋白，更好的防治鸡球虫病。经动物实验表明融合基因表达抗原免疫组抗球虫指数明显高于单一抗原免疫组。

附图说明

图1是E.tenella YL株3-1E和TA4基因PCR产物电泳检测结果：

M.Trans2K Plus DNA标准；1.3-1E PCR产物；2.TA4 PCR产物。

图2是E.tenella YL株3-1E-TA4基因PCR产物电泳检测结果：

M.Trans2K Plus DNA标准；1.3-1E-TA4 PCR产物。

图3是pET-32a(+)-3-1E-TA4表达产物SDS-PAGE分析结果：

M.蛋白分子质量标准；1.0.4mmol/L IPTG诱导菌液；2.0.6mmol/L IPTG诱导菌液；3.0.8mmol/L IPTG诱导菌液；4.诱导3h后菌液；5.诱导5h后菌液；6.诱导7h后菌液；P.诱导的空载体菌液。

图4是pET-32a(+)-SO7酶切鉴定结果：

M.Trans2K Plus DNA标准；1.双酶切产物。

图5是6pET-32a(+)-3-1E-TA4表达融合蛋白的Western bloting结果：

M.免疫印迹标准Marker；1.共表达融合蛋白。

图6重组质粒pET-32a(+)-3-1E-TA4的构建。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

1 3-1E基因的克隆

1.1引物的设计与合成

参照NCBI上所提供的登录号应用Primer Premier 5软件合成1对引物，

上游引物P1：5′-GTT TGT AGT TTC TTT GTA TTT CC-3′；

下游引物P2：5′-CTG GAG ATC AAT TAG AAG CC-3′。

引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

1.2球虫卵囊的复苏与纯化

用单卵囊繁殖的鸡E.tenella YL株孢子化卵囊，按每羽1×10⁵个卵囊经口感染9日龄无球虫小公雏，分别于感染后第6、7、8、9天四天连续收取粪便。

(1)将采集来的新鲜鸡粪样本加少量饱和食盐水捻碎，加饱和食盐水，调匀后，静置15min，对粪便滤液进行初步的离心沉淀(3000r/min，离心20min)。

(2)得到的粪便滤液，弃去沉淀，收取上清液，加5倍体积的蒸馏水，(3000r/min，离心20mim)。

(3)弃上清液，收沉淀，加入2倍体积的饱和食盐水，静置15min，(3000r/min，离心20min)。

重复步骤(2)，收沉淀，即为卵囊。

对于研究工作收集的鸡球虫卵囊需要进行孢子化。其操作过程为：将分离纯化后的卵囊放于5倍体积的2.5％重铬酸钾溶液中(要求置于培养皿中)，溶液深度为0.4～0.6cm，放入到恒温箱中(要求温度在29℃)，培养3～5d。在此期间每天对培养液进行3～4次轻轻地搅拌，并涂片镜下观察孢子化情况，当达到85％以上的卵囊完成孢子化时，停止培养，即得到球虫孢子化卵囊，4℃保存备用。

1.3E.tenella YL株子孢子总RNA的提取

(1)孢子化卵囊和器材的准备

无核酶水：双蒸水加入DEPC至终浓度0.1％V/V，放置过夜，然后120℃下高压灭菌30min，4℃保存备用。

氯仿：4℃避光保存。

异丙醇：4℃避光保存。

75％乙醇溶液：用无核酶水依实验中所需的量现配制，4℃保存备用。

反转录试剂盒、DEPC、Trizol试剂均购自陕西宝鑫科技有限公司

无RNase实验器材的准备：所用的枪头、塑料制品和玻璃制品用0.1％DEPC水溶液在37℃处理过夜，然后在120℃下高压灭菌30min以去除残留的DEPC。

孢子化卵囊的准备：离心收集纯化后培养的E.tenella YL株孢子化卵囊，先用双蒸水洗2次，再用含0.1％DEPC的无核酶水洗3次，去除重铬酸钾，最后用含0.1％DEPC无核酶水垂悬。

(2)子孢子总RNA的提取

破碎子孢子：洗好的子孢子中加入玻璃砂，漩涡振荡器中震荡5～6min，每次都要观察一下看破碎了没有。约80％破碎时，将上清吸入另一EP管中，用DEPC水洗剩下的玻璃砂，洗两次，洗液均收集。8000r/min离心3min，收集子孢子。

每管按1mL Trizol处理1×10⁷子孢子(实际用了0.8mL Trizol)，混匀，吹打几次。每1mL起始Trizol加0.2mL氯仿，盖紧管盖，震荡15s后，在2℃～8℃条件下冰上孵育10min(实际用4℃)。然后12000r/min，离心15min。此时混合物分为3层。RNA完全存在于上层无色水相层，约为Trizol体积的60％。

将小于80％的水相层转移至另一新的EP管中，并弃下面的有机相(要小心避免吸到中间层)。按每管1mL起始Trizol加0.5mL异丙醇，置15℃～30℃温水浴10min(此步骤没做，可以不做)。4℃，于12000r/min，离心10min。RNA沉淀在管壁或管底，为胶状颗粒。

RNA的洗涤：弃上清，每1mL起始Trizol加75％乙醇至少1mL，混匀。4℃，12000r/min，离心15min。

小心吸走乙醇，置空气中约10min(15min)风干RNA颗粒，然后将RNA重溶于无核酶水中(20uL)。用吸头反复吹吸几次，放于冰箱中保存(-70℃或-20℃)。

1.4E.tenella RT-PCR

用上述所提孢子化纯化卵囊。卵囊总RNA为模版，按反转录试剂盒说明进行反转录合成cDNA第1链，反转录反应体系为：

总RNA约12.5μL，下游Pr 1μL，混匀后70℃变性10min，立即置冰上冷却，再加入下列成分：dNTP 1μL，5×buffer 4μL，RNase 1μL，AMV 0.5μL，总体积20μL，混匀，42℃水浴反应1h，然后70℃10min灭活反转录酶，4℃保存。

E.tenella 3-1E基因的PCR扩增

以反转录获得的球虫cDNA为模板，PCR扩增E.tenella 3-1E基因。反应体系见表1。

表1 PCR扩增E.tenella 3-1E的反应体系(单位：μL)

Table 1 Amplification of E.tenella 3-1E genes by PCR(Unit：μL)

组分(Components)      反应(Reactionl)

DEPC水                16

Premix                20

cDNA                  2

上游P1                1

下游P2                1

总体积(Total Volume)  40

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸60s，30个循环，然后72℃延伸10min。反应结束后将PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测正确后，进行胶回收。

1.5RT-PCR产物的回收纯化

(1)制备10g/L琼脂糖凝胶：称取0.25g琼脂糖置于锥形瓶中，加入25mL 1×TAE，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液加入0.5μg/mL的溴化乙锭，即成10g/L琼脂糖凝胶液。

(2)胶板制备：取制胶槽洗干净，晾干，放入制胶板。将槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将混匀的10g/L琼脂糖凝胶液小心地倒入槽内，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

(3)取40μL扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶电泳并观察结果。

RT-PCR产物的回收纯化

电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶，放入干净的离心管中，用天根琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)向装有胶块的离心管中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(4)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液。

(6)将吸附柱CA2放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的试验。

(7)将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000r/min离心2min收集DNA溶液。

1.6RT-PCR产物与pMD18-T Vector的连接

将回收的RT-PCR产物与pMD18-T Vector进行连接，连接反应体系见表2。

表2RT-PCR产物与载体pMD18-T Vector的连接反应(单位：μL)

Table 2 Ligation of the RT-PCR products with pMD 18-T Vector(Unit：μL)

组份(Components)        反应(Reaction)

pMD18-T Vector          0.5

纯化的PCR产物           4.5

Solution I              5

总体积(Total Volume)    10

4℃连接过夜。

1.7DH5α感受态细胞的制备

配培养基所用试剂均购自杨凌天成化玻站。

空白液体培养基200mL

胰蛋白胨  2g

酵母提取物2g

NaCl      1g

加入约180mL去离子水，溶解，加入NaOH 2g/50mL(1mol/L)0.5mL(PH＞7.0)，加水至200mL，高压灭菌25min，4℃保存。配制氨苄青霉素的液体培养基，需在使用前按1μL/mL的量加入配好的氨苄青霉素(100mg/mL)。

配LB平板(A⁺)150mL

胰蛋白胨    1.5g

酵母提取物  0.75g

NaCl        1.5g

加水至150mL，加入2.25g琼脂，加NaOH 0.75mL(PH＞7.0)，高压25min，倒平板前呆温度降至50℃时，按1μL/mL的量加入配好的氨苄青霉素(100mg/mL)，倒平板，4℃保存。

感受态细胞的制备(CaCl₂法)

(1)从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1∶100～1∶50的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。

(2)将培养液转入预冷的50mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下8000r/min离心10min。

(3)弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min后，4℃下8000r/min离心10min。

(4)重复步骤(3)。

(5)弃去上清，加入3mL预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，即成感受态细胞悬液。分装于预冷的灭菌Ep管中，每管200μL，贮存于-70℃。

1.8连接产物转化E.coli DH5α

(1)从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后即置冰上。加入3-1E基因的质粒DNA溶液10μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后。

(2)42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3～5min。

(3)向管中加入600μL LB液体培养基(不含Amp)，摇菌，250/150r/min，45min，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。然后4000r/min离心5min后，弃上清，管底留下100～200μL液体。

(4)轻轻吹打，混匀后，取100μL菌液涂布于含氨苄青霉素LB固体培养基平板上，待板上的菌液溶到培养基上之后，将平板放于37℃温箱中倒置培养18～24h。随机挑取LB平板上的白色菌落，接种于4mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。用培养物作模板，进行PCR鉴定。反应体系和程序同步骤2.2.3。将经PCR鉴定为阳性的克隆，按50％的甘油和菌液3∶7的比例进行保菌，并送西安新方舟生物科技有限公司去测序。

2 TA4基因的克隆

2.1引物的设计与合成

参照NCBI上所提供的登录号应用Primer Premier 5软件合成1对引物，

上游引物P3：5′-GAT TAC CCAACA GCA GTT ACG C-3′；

下游引物P4：5′-CGC CGC CATATC TGT CCA AT-3′。

引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

2.2E.tenella TA4基因的PCR扩增

以步骤1.4反转录获得的球虫cDNA为模板，PCR扩增E.tenella TA4基因。反应体系见表3。

表3PCR扩增E.tenella TA4的反应体系(单位：μL)

Table 3 Amplification of E.tenella TA4 genes by PCR(Unit：μL)

组分(Components)          反应(Reaction1)

DEPC水                    16

Premix                    20

cDNA                      2

上游P3                    1

下游P4                    1

总体积(Total Volume)      40

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸60s，30个循环，然后72℃延伸10min。反应结束后将PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测正确后，进行胶回收。

2.3PCR产物的回收纯化

(1)制备10g/L琼脂糖凝胶：称取0.25g琼脂糖置于锥形瓶中，加入25mL 1×TAE，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液加入0.5μg/mL的溴化乙锭，即成10g/L琼脂糖凝胶液。

(2)胶板制备：取制胶槽洗干净，晾干，放入制胶板。将槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将混匀的10g/L琼脂糖凝胶液小心地倒入槽内，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

(3)取40μL扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶电泳并观察结果。

RT-PCR产物的回收纯化

电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶，放入干净的离心管中，用天根琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)向装有胶块的离心管中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(4)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液。

(6)将吸附柱CA2放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的试验。

(7)将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000r/min离心2min收集DNA溶液。

2.4PCR产物与pMD18-T Vector的连接

将回收的PCR产物与pMD18-T Vector进行连接，连接反应体系见表4。

表4PCR产物与载体pMD18-T Vector的连接反应(单位：μL)

Table4 Ligation of the PCR products with pMD 18-T Vector(Unit：μL)

组份(Components)        反应(Reaction)

pMD18-T Vector          0.5

纯化的PCR产物           4.5

Solution I              5

总体积(Total Volume)    10

4℃连接过夜。

2.5连接产物转化DH5α感受态细胞

(1)从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后即置冰上。加入3-1E基因的质粒DNA溶液10μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后。

(2)42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3～5min。

(3)向管中加入600μL LB液体培养基(不含Amp)，摇菌，250/150r/min，45min，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。然后4000r/min离心5min后，弃上清，管底留下100～200μL液体。

(4)轻轻吹打，混匀后，取100μL菌液涂布于含氨苄青霉素LB固体培养基平板上，待板上的菌液溶到培养基上之后，将平板放于37℃温箱中倒置培养18～24h。随机挑取LB平板上的白色菌落，接种于4mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。用培养物作模板，进行PCR鉴定。反应体系和程序同步骤2.2.3。将经PCR鉴定为阳性的克隆，按50％的甘油和菌液3∶7的比例进行保菌，并送西安新方舟生物科技有限公司去测序。

3 3-1E基因和TA4基因原核共表达

3.1引物设计

参照Ge neBank上登录的3-1E基因序列，用Primer5.0软件设计一对引物P5/P6，其中上游引物P5带有BamH I酶切位点：

P5：5′-GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3′；

P6：5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCCCTGGTACAG-3′。

参照GeneBank上登录的TA4基因序列，设计一对引物P7/P8，其中下游引物P8带有Sal I酶切位点：

P7：5′-GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAG-3′；

P8：5′-CATGTCGACCGCCGCCATATCTGTCCAAT-3′。

中间通过一条(GGGGS)₃ 15个氨基酸的柔性片段连接。

3.2PCR扩增

以本实验室构建的柔嫩艾美耳球虫克隆载体pMD18-T-3-1E和pMD18-T-TA4为模板，采用PCR技术扩增3-1E基因和TA4基因片段。反应体系见表3。

表3PCR扩增反应体系(单位：μL)

Table 3 Amplification by PCR(Unit：μL)

组分(Components)    反应(Reaction)

DEPC水                      16

Premix                      20

pMD18-T-3-1E/pMD18-T-TA4    2

上游Pr                      1

下游Pr                      1

总体积(Total Volume)        40

以上游引物P5，下游引物P6扩增3-1E基因，以上游引物P7，下游引物P8扩增TA4基因。

反应条件为：95℃预变性5min；94℃50s，59/58℃50s，72℃1min，共进行30个循环；最后再在72℃延伸10min。反应结束后将PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测正确后，切胶进行胶回收。

以胶回收的两种PCR产物为模板，以P5和P8为引物，扩增3-1E和TA4的融合基因，反应体系见表4。

表4PCR扩增反应体系(单位：μL)

Table 4 Amplification by PCR(Unit：μL)

组分(Components)            反应(Reaction)

DEPC水                      16

Premix                      20

3-1E                        1

TA4                         1

上游引物P5                  1

下游引物P8                  1

总体积(Total Volume)        40

反应条件为：95℃预变性5min；94℃50s，59℃50s，72℃1min，共进行30个循环；最后再在72℃延伸10min。反应结束后将PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测正确后，切胶进行胶回收，得融合基因3-1E-TA4，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1。

3.3共表达载体的构建及鉴定

3.3.1pMD18-T-3-1E-TA4的构建

将回收纯化的3-1E-TA4融合基因连接到pMD18-T Simple Vector上(选取合适比例进行连接反应)，连接体系见表5。

表5PCR产物与载体pMD18-T Simple Vector的连接反应(单位：μL)

Table 5 Ligation of the PCR products with pMD 18-T Simple Vector(Unit：μL)

组份(Components)            反应(Reaction)

pMD18-T Simple Vector       0.5

纯化的3-1E-TA4融合基因      4.5

Solution I                  5

总体积(Total Volume)        10

4℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑取单个菌落接种含氨苄青霉素的LB中，用天跟普通质粒小提试剂盒提质粒，用BamH I，Sal I进行酶切鉴定，见表6。

表6pMD18-T-3-1E-TA4酶切反应体系(单位：μL)

Table 6 Restriction enzyme digestion of pMD 18-T-3-1E-TA4(Unit：μL)

组份(Components)        反应(Reaction)

pMD18-T-3-1E-TA4        8

10×T Buffer            1

BamH I                  0.5

Sal I                   0.5

总体积(Total volume)    10

酶切1h后，于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，鉴定正确后，送去测序。

3.3.2pET-32a(+)-3-1E-TA4载体的构建

将测序正确的pMD18-T-3-1E-TA4和表达载体pET-32a(+)分别用BamH I，Sal I进行双酶切，酶切体系见表7。

表7质粒pET-32a(+)/3-1E酶切反应体系(单位：μL)

Table 7 Restriction enzyme digestion of plasmid pET-32a(+)and 3-1E(Unit：μL)

组份(Components)                 体系(System)

pET-32a(+)/pMD-18T-3-1E-TA4      32

10×H Buffer                     4

BamH I                           2

Sal I                            2

总体积(Total volume)             40

酶切3h后，于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳，切胶进行胶回收，回收基因与载体片段进行连接，连接体系表见8。

表8 3-1E-TA4与载体pET-32a(+)的连接反应(单位：μL)

Table 8 Ligation of the PCR products with pET-32a(+)vector and 3-1E(Unit：μL)

组份(Components)            反应(Reaction)

Digested pET-32a(+)         1.5

Digested pMD-18T-3-1E-      6.5

TA4                         1

T4DNALigase                 1

10×T4DNA Ligase            10

总体积(Total Volume)        20

4℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落接种含氨苄青霉素的LB中。提质粒分别用BamH I，Sal I进行双酶切鉴定，酶切体系见表9。

表9pET-32a(+)-3-1E-TA4酶切反应体系(单位：μL)

Table 9 Restriction enzyme digestion of pET-32a(+)-3-1E-TA4(Unit：μL)

组份(Components)        反应(Reaction)

pET-32a(+)-3-1E-TA4     8

10×T Buffer            1

BamH I                  0.5

Sal I                   0.5

总体积(Total volume)    10

酶切1h后，于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，鉴定正确后，转BL21感受态细胞，同样用BamH I，Sal I进行双酶切鉴定，酶切体系同表7。酶切1h后，于10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果表明成功构建pET-32a(+)-3-1E-TA4载体，按50％的甘油和菌液3∶7的比例进行保菌。

3.3.3pET-32a(+)-3-1E-TA4重组质粒诱导表达

(1)SDS-PAGE。

a.将保存的重组菌液接种于3mL LB培养基/(含100μg/mL Amp)中，37℃振荡培养过夜以获得饱和培养物。

b.100μL过夜培养物接种于3mL LB培养基(含100μg/mL Amp)中，37℃振荡培养OD₆₀₀值为0.6左右时，加IPTG(0.1mol/L)18至IPTG终浓度为0.6mmol/L，28℃培养5h。

c.5h后取将培养物转移至一微量离心管中，迅速在室温下以12000r/min离心1min，弃上清液，收集细菌沉淀，加500μL氯化钠注射液吹打混匀，室温下以12000r/min离心1min，用100μL氯化钠注射液定容，吹打混匀。按样品和缓冲液4∶1的比例加25μL 5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min处理样品。然后取15μL进行SDS-PAGE电泳，点10μL ProteinRuler I，电泳条件为12g/L分离胶80V，30min；120V，1.5h。电泳结束后取下凝胶，经考马斯亮蓝染色液100℃加热煮沸染色5min，回收染色液，100℃沸水脱色数次至背景色退去，观察结果，进行拍照。

(2)不同诱导浓度、不同诱导时间蛋白表达量。

a.100μL过夜培养物接种于3mL LB培养基(含100μg/mLAmp)中，分别接种3管，37℃振荡培养OD₆₀₀值达到0.6左右时，分别加入IPTG(0.1mol/L)12mL、18mL、24mL至IPTG终浓度为0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L，28℃培养。分别在培养3h、5h、7h后取IPTG终浓度为0.4mmol/L诱导的菌液1mL，4℃保存。在培养5h时分别取三种浓度诱导的菌液各1mL，六个样品按2.3.3(1)中c所述步骤处理样品。

b.取15μL处理好的样品进行SDS-PAGE，电泳条件为12g/L分离胶80V，30min；120V，1.5h。电泳结束后取下凝胶，经考马斯亮蓝染色液100℃加热煮沸染色5min，回收染色液，100℃沸水脱色数次至背景色退去，观察结果，进行拍照。

3.3.4Western blotting

(1)试验所用试剂的准备

大滤纸、PVDF膜，均购自北京全式金生物技术有限公司。

膜转移缓冲液：

Glycine 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，加少量水溶解后，加200mL甲醇，定容至1L，室温保存。

TBS缓冲液(Western杂交膜清洗液)：1mol/LTris·HCl(pH7.5)10mL，NaCl 8.8g，加蒸馏水定容至1000mL。

TBST缓冲液(Western杂交膜清洗液)：Nacl 8.8g，1mol/L Tris-Hcl(pH8.0)20mL加入约800mL去离子水溶解，加入0.5mL Tween20后混匀，定容至1L，4℃保存。

封闭缓冲液：

5g脱脂奶粉溶于100mL TBST Buffer中，4℃保存(现配现用)。

(2)Western blotting

a.SDS-PAGE电泳：诱导表达的重组蛋白15μL上样，用12g/L分离胶，在80V，30min，120V电压下电泳1.5h，点10μL EasySee Western Marker。在此期间将滤纸、PVDF膜剪成与胶块大小一样，然后将其和海绵垫子一起浸泡在蛋白转移Buffer中。

b.转膜：电泳结束后，剥胶，放入上述蛋白转移Buffer中，在正极板上按海绵、四层滤纸、PVDF膜、凝胶、四层滤纸、海绵的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，60V转移2.5h。

c.封闭：转移完成后，取下PVDF膜，用铅笔标记膜的正反面。将膜放入一个干净的培养皿中，用双蒸水冲洗几次，然后倒入封闭液，室温轻轻振摇2h或4℃过夜。

d.与抗体结合：封闭结束后，倒出封闭液，先用TBS振摇洗两次，再用TBST漂洗一次。加入TBST稀释的1∶200的鸡抗E.tenella阳性血清，4℃过夜。然后先用TBS洗两次，再用TBST漂洗一次，加入TBST稀释的1∶500兔抗鸡IgG，37℃结合2h，取出后先用TBS洗两次，再用TBST漂洗一次，每次10min。

e.暗室曝光在暗室内将PVDF膜放一个预先准备的干净的塑料袋内，将配好的显色试剂DAB底物溶液加到袋中膜的正面一侧，在暗室中来回晃动，使试剂与膜充分结合1min。然后将膜正面小心放在压片夹中的X-光片上，压2min，将膜拿出，分别在显影液、蒸馏水、定影液的盆中浸润2min、1min、2min。取出光片在水龙头上冲洗，条带出现后，立即用水终止反应，观察显色情况，在凝胶成像系统中照像、保存。

3.3.5结果

含pET-32a(+)-3-1E-TA4重组质粒的大肠埃希氏菌BL21(DE3)用IPTG诱导表达后取样品进行SDS-PAGE分析，其融合蛋白的分子质量大小为60ku左右。通过不同诱导剂和不同诱导时间诱导，可以看出在相同的诱导时间内0.6mmol/L IPTG诱导的菌液表达的蛋白量最多；在相同的诱导剂浓度下，诱导5h的菌液表达的蛋白量最多。诱导菌液，将表达的蛋白电转移至NC膜上，进行Western-blotting分析。分析结果表明，其表达的蛋白可与免疫鸡阳性血清发生反应，其特异杂交带的大小与该基因编码的融合蛋白大小一致。

4动物实验

分别用纯化的pET-32a(+)-3-1E-TA4共表达融合蛋白和pET-32a(+)-3-1E，pET-32a(+)-TA4单一的融合蛋白免疫7日龄的雏鸡，一周后进行二免，胸部肌肉注射。21日龄经口感染E.tenella YL株孢子化卵囊1×10⁵个/羽。每日观察并记录鸡只精神状态、死亡情况，28日龄对所有鸡只进行剖杀，称重、进行盲肠病变记分、计数各组的克粪便卵囊数(OPG)，计算抗球虫指数(ACI)。ACI＝(相对增重率+成活率)-(病变值+卵囊值)。ACI≥180为保护效果明显，ACI＝160～179为保护效果较好，ACI＝160～120为保护效果一般，ACI＜120为无保护效果。设阴性(非感染非免疫)和阳性(感染非免疫)对照组。结果表明共表达抗原免疫组抗球虫指数明显高于单一抗原免疫组。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种抗鸡球虫病的融合蛋白及其制备和应用

<130>1

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1206

<212>DNA

<213>3-1E-TA4融合基因

<400>1

atgggtgaag aggctgatac tcaggcgtgg gatacctcag tgaaggaatg gctcgtggat       60

acggggaagg tatacgccgg cggcattgct agcattgcag atgggtgccg cctgtttggc      120

gctgcaatag acaatgggga ggatgcgtgg agtcagttgg tgaagacagg atatcagatt      180

gaagtgcttc aagaggacgg ctcttcaact caagaggact gcgatgaagc ggaaaccctg      240

cggcaaacaa ttgttgacgg ccgtgcccca aacggtgttt atattggagg agttaaatat      300

aaactcgcag aagttaaacg tgatttcacc tataacgacc agaactacga cgtggcgatt      360

ttggggaaga acaagggtgg cggtttcctg attaagactc cgaacgacaa tgtggtgatt      420

gctctttatg acgaggagaa ggagcagaac aaagcagatg cgctgacaac ggcacttgcc      480

ttcgctgagt acctgtacca gggcggcttc ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct      540

ggcggtggcg gatcgatgaa caagctgaga aaagcagcag gacttcctgc attcgaagat      600

gctgtgggag acacatttgt tctaccagca tactcgcatg aagagtctag ggcggcacca      660

gtagctgaaa ctctctggaa gacggagata tgccccaaag tcttaggagg cggaaggtcc      720

aggaacgtta ctgaagctgt caagttaact ggcaattttg cctactaccc cgtcacagac      780

ggcaaaaaag agtgcagcga tgctgtggag tactggaaag gcggactttc tcagttcaac      840

gacacaattc ccccaacgtt ccaagcgttg aacgaccccg ttgtgtacaa tgacagggct      900

gtttcctttg tcgccctata caaccccaaa accagccccg ttgtcagttg cgtgctcctc       960

cagtgcccta atgcaggtgt tggtggacgc aggcttgcgg caggcacgac agacgctgtc      1020

atttgcttga caaatccggc tcctttggaa gcaaggtcac aaccattcga cgacgagcaa      1080

tggaagaaaa ttgttgactc tctatctctc cctgaggaag aggaagagaa gggcggagtt      1140

tctccagtcg tcccttcagt agccctcatc tctgcggcgg tcatctccgc tttcgctctc      1200

ttttag                                                                 1206

Claims (8)

1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述融合基因的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

     1）采用RT-PCR方法扩增3-1E基因和TA4基因，并进行鉴定；

2）分别将3-1E基因和TA4基因连接到载体pMD18-T上，构建克隆载体pMD18-T-3-1E和pMD18-T -TA4；

3）以步骤2）所得载体pMD18-T-3-1E为模板，进行PCR扩增，上游引物为 P5: 5′- GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG -3′，下游引物P6: 5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAG CCGCCCTGGTACAG-3′；

4）以步骤2）所得载体pMD18-T -TA4为模板，进行PCR扩增，上游引物P7：5′-GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAG-3′；下游引物为P8：5′- CATGTCGACCGCCG CCATATCTGTCCAAT -3′；

5）以步骤3）和步骤4）的PCR产物为模板，进行PCR扩增，上游引物为P5: 5′- GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG -3′，下游引物为P8：5′- CATGTCGACCGCCG CCATATCTGTCCAAT -3′，得到3-1E -TA4融合基因。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是指pET-32a-3-1E -TA4。

5.一种抗鸡球虫病的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由3-1E-TA4融合基因表达而得，其中所述3-1E-TA4融合基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将所述3-1E-TA4的融合基因连接到载体pMD18-T上，构建载体pMD18-T-3-1E -TA4；

2）分别对所述载体pMD18-T-3-1E -TA4和表达载体pET-32a(+)进行双酶切，将回收的3-1E-TA4融合基因，与表达载体pET-32a(+)连接，连接产物经鉴定正确后，即得到重组质粒pET-32a-3-1E -TA4；

3）步骤2）所述的重组质粒pET-32a-3-1E -TA4转化大肠杆菌感受态细胞；

4）培养步骤3）所得大肠杆菌，制备与纯化融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21感受态细胞。

8.权利要求5所述融合蛋白在制备预防鸡艾美耳球虫病的药物中的应用。 

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