CN107365388B - 多聚体蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法，该制备方法包括下述步骤：步骤(A)，准备在微生物的菌体内呈不溶性颗粒形态的蛋白，该蛋白为上述单体蛋白；步骤(B)，利用含有月桂酰‑L‑Glu的水溶液增溶步骤(A)中准备的单体蛋白；步骤(C)，在含有精氨酸盐酸盐的缓冲液中稀释步骤(B)中得到的溶液，降低月桂酰‑L‑Glu的浓度；以及步骤(D)，利用凝胶过滤层析等将步骤(C)中得到的溶液的溶剂置换成缓冲液。

Description

多聚体蛋白的制备方法
本申请是申请号为201280030917.5、申请日为2012年6月25日、发明名称为“由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法。
背景技术
治疗用抗体由于其疗效高和副作用风险小而取得了巨大成功，但因其制造成本高而引起的高药价则成为课题。该抗体的疗效局限于白血病或自身免疫疾病等较窄的疾病范围，在药物的组织转移性受到限制的固体癌症等中不太有效，这也成为课题。
自从1988年可以在大肠杆菌内制备抗体片段(非专利文献1～3)以来，组织转移性高、低分子化的修饰抗体(抗体片段)的开发持续进行。为了获得更高的抗癌效果，有多种使抗体片段与抗癌药、毒素、放射性同位素或前体药物活化酶等融合而得到的抗体融合蛋白也被提案。
但是，当天然抗体所具有的二价结合性是发挥其与靶抗原的高亲和性和优异的体内动力学的基础时，人工制作的一价抗体融合蛋白与靶抗原的结合性不及天然抗体的结合性。
因此，最近将低分子化修饰抗体或抗体融合蛋白形成多价的试验逐渐盛行(非专利文献4)。如果能够使用微生物廉价地生产抗体这样的多价分子，那么当然可以满足高功能和低药价这两个方面。
如双抗体、三链抗体或模仿免疫球蛋白M的抗体那样，已知利用抗体结构自身的缔合性来制备多价分子的方法。作为其他方法，还有通过使缔合性蛋白与抗体的片段结构融合而得到多价分子的方法。其例子有：经由与单链抗体可变区(scFv)结合的亮氨酸拉链结构等进行二聚化的方法(非专利文献5)或经由来自人p53的四聚体化α螺旋结构的方法(非专利文献6)、利用来自微生物的链霉亲和素的四聚体化的方法等。特别是，关于使链霉亲和素融合的方法，已经通过链霉亲和素的结构修饰实现了高功能化(提高稳定性和溶解性、降低免疫原性等)(非专利文献7)。融合了链霉亲和素的蛋白可以经由以高亲和性与链霉亲和素结合的生物素分子实现药物预靶向作用，因此是最受期待的多价融合蛋白之一(非专利文献7)。
其中，问题在于：使用大肠杆菌等微生物生产多价融合蛋白时，往往会在微生物的菌体内形成不溶性蛋白。在微生物的菌体内不溶性的蛋白丧失了活性或稳定性，所以为了将该蛋白作为药品等来使用，必需重新进行用于重建活性结构的重折叠操作。
Schultz等人通过想办法研究与链霉亲和素结合的scFv内的肽接头或H链与L链的配置顺序，报道了在大肠杆菌的菌体内以可溶性且活性型的方式生产的例子(非专利文献8)。但是，可知若将链霉亲和素改变成修饰型，则其在大肠杆菌的菌体内不溶(非专利文献9)。因此，在链霉亲和素融合蛋白的实用化上，认为必需进行重折叠操作。
由于这样的情况，Choe等人研究了修饰型链霉亲和素融合蛋白的重折叠例子(非专利文献10)，但目标物的回收率远远低于1％，在实用化上还存在很多课题。
本发明人之前提出了使由于不溶化或丧失了高级结构而失去了活性或稳定性的蛋白(改性蛋白)恢复天然状态的高级结构的方法(重折叠方法)(专利文献1)。根据该方法，使用1～3％的预定的酰基谷氨酸表面活性剂水溶液在pH6.5～9.0下增溶已改性沉淀的蛋白，之后，使用精氨酸缓冲液将该增溶后的溶液的表面活性剂浓度降低至0.02～0.5％，从而可以有效地重建蛋白结构。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/136568号；
非专利文献
非专利文献1：Science,240,1038-1041(1988)；
非专利文献2：Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,85,5879-5883(1988)；
非专利文献3：Science,242,423-426(1988)；
非专利文献4：Nature Reviews Immunology,10 345-352(2010)；
非专利文献5：Biochemisry(Mosc),31,1579-1584(1992)；
非专利文献6：Journal of Immunogy,157,2989-2997(1996)；
非专利文献7：Journal of Controlled Release 65,203-220(2000)；
非专利文献8：Cancer Research,60,6663-6669(2000)；
非专利文献9：Protein Science 10,491-503(2001)；
非专利文献10：Bulletin of Korean Chemical Society,30,1101-1106(2009)。
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述，使用大肠杆菌等微生物生产多价融合蛋白时，往往会在微生物的菌体内形成不溶性蛋白，但为了将其作为药品等来使用，必需进行用于重建活性结构的重折叠操作。
本发明的课题在于提供：即使在多价融合蛋白中，在亚单元结构中也包含免疫球蛋白折叠结构的多聚体蛋白的新的制备方法。
解决课题的方法
这次，本发明人发现：通过月桂酰-L-Glu增溶的具有免疫球蛋白折叠结构的融合蛋白，即使将月桂酰-L-Glu浓度降低至0.02～0.5％，也不会形成多聚体结构，而是稳定地继续溶解。而且，在该融合蛋白溶解于月桂酰-L-Glu溶液期间，只形成亚单元结构，接着，通过置换该溶液和特定的缓冲液，能够形成上述融合蛋白的多聚体结构。
即，通过本发明，提供由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的蛋白融合而得到的单体蛋白组成的多聚体蛋白的制备方法，该制备方法包括下述步骤：
步骤(A)，准备在微生物的菌体内呈不溶性颗粒形态的蛋白，该蛋白为使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的单体蛋白；
步骤(B)，利用含有月桂酰谷氨酸或其盐的水溶液增溶步骤(A)中准备的单体蛋白；
步骤(C)，在含有精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液中稀释步骤(B)中得到的溶液，降低月桂酰谷氨酸或其盐的浓度；以及
步骤(D)，利用选自下述(d1)～(d4)的方法，将步骤(C)中得到的溶液的溶剂置换成缓冲液，
(d1)选自凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析和它们的组合的柱层析；
(d2)超滤法；
(d3)透析法；以及
(d4)(d1)～(d3)中的两种以上的组合。
发明效果
通过本发明，使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合，并根据该融合蛋白的性质形成多聚体结构，由此可以制备对靶抗原具有多个亲和性部位的多聚体结构的多价融合蛋白。
根据本发明，即使是使性质大为不同的两种以上的蛋白融合而得到的蛋白，也可以有效地形成多聚体结构。
根据本发明的方法，能够形成亚单元结构的蛋白不会形成多聚体蛋白，可以抑制其聚集和沉淀。
附图说明
图1显示实验10中纯化的HyHEL-10scFv SA全长的还原SDS凝胶电泳的结果。
图2是显示实验10中纯化的HyHEL-10scFv SA全长的凝胶过滤HPLC图形(225nm下的紫外部吸收)的图。
图3显示实验11中纯化的D1.3scFv SA全长的还原SDS凝胶电泳的结果。
图4是显示实验11中纯化的D1.3scFv SA全长的凝胶过滤HPLC图形(225nm下的紫外吸收)的图。
图5是显示实验12中纯化的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的凝胶过滤HPLC图形(柱：Superdex 10/300GL；展开溶剂：0.1M磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐、pH6.8；流速为0.8ml/分钟；检测：280nm下的紫外吸收)的图。在峰的后方看到的次要成分推测是HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的分解物。
图6是显示实验12中纯化的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的场流分级法图形(交叉流：2.7ml/分钟；槽流：1.5ml/分钟；展开溶剂：0.1M磷酸钠、pH6.8；225nm下的紫外吸收)的图。分子量利用多角度光散射装置和Zimm plot法算出。在峰的前方看到的次要成分推测是HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的分解物。
图7是显示实验12中纯化的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的阴离子交换HPLC图形(柱：RESOURCE Q、1ml；流速：0.5ml/分钟；展开溶剂：20mM Tris-盐酸盐、pH8.0；洗脱方法：0～0.5M NaCl线性浓度梯度洗脱法、20分钟；检测：280nm下的紫外吸收)的图。在峰的前方、后方看到的次要成分推测是HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的分解物。
图8是显示实验12中纯化的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的鸡卵清溶菌酶活性抑制率的图。将溶菌酶和HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白以图中所示的比率进行混合，加入到作为溶菌酶底物的微生物悬浮液中，由其吸光度的变化率评价残留的溶菌酶活性，求出相对于未添加HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白时的溶菌酶活性的抑制率(％)。
图9是通过SDS-PAGE(非还原)分析实验13中实施的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的重折叠步骤的图。泳道1：提取步骤；泳道2：利用稀释缓冲液进行的50倍稀释阶段；泳道3：置换成含有精氨酸盐酸盐的缓冲液的阶段；泳道4：利用阴离子交换柱进行的纯化阶段；泳道5：实验12中得到的纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白，粗箭头(←)显示四聚体的谱带，细箭头(→)显示单体的谱带。
具体实施方式
〔定义〕
在本说明书中，“免疫球蛋白折叠结构”是指，通过以二硫键结合的两个β结构平面构成的稳定的结构域结构，通过在其表面提示的环结构，能够形成与特定的分子强力结合的亲和性分子。还称作免疫球蛋白折叠(immunoglobulin fold)。分子细胞生物学，第3版，1227页，东京化学同人，1997年。
在本说明书中，“亚单元结构”是指，通过非共价键集合而形成稳定的多聚体结构的蛋白的、其中的一个结构单元。分子细胞生物学，第3版，51页，东京化学同人，1997年。
在本说明书中，“多聚体结构(多聚体蛋白)”是指，作为其构成成分的亚单元结构经由非共价键集合而形成的高级的层次结构，通常亚单元结构的配置是规则的、对称的。分子细胞生物学，第3版，51页，东京化学同人，1997年。有时将具有多聚体结构的蛋白称作多聚体蛋白。另外，有时将形成多聚体结构的构成成分称作单体蛋白。
〔步骤(A)：蛋白的准备〕
本发明中的构成多聚体蛋白的单体蛋白是使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的单体蛋白。根据该其他的蛋白所具有的自身集合性·自身结合性的性质，可以形成多聚体结构，可以制备与靶抗原具有多个亲和性部位的多聚体结构的多价融合蛋白。
作为具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白，可以列举：抗鸡溶菌酶抗体(例如HyHEL-10、D1.3)、抗TNFα抗体(英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab))、抗HER2抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))、抗CD20抗体(利妥昔单抗(rituximab))、抗VEGF抗体(贝伐珠单抗(bevacizumab))、抗EGFR抗体(西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab))等。
作为能够形成亚单元结构的其他蛋白，可以列举：链霉亲和素、来自人p53的四聚体化α螺旋结构、亮氨酸拉链结构、或它们的功能性片段等。需要说明的是，在本说明书中，功能性片段是指能够形成亚单元结构的蛋白片段，例如可以列举核心序列型链霉亲和素。
作为本发明中使用的单体蛋白，具体而言，可以列举scFv与链霉亲和素的融合蛋白等。更具体而言，可以列举：HyHEL-10scFv与链霉亲和素的融合蛋白、D1.3scFv与链霉亲和素的融合蛋白或HyHEL-10scFv与核心序列型链霉亲和素的融合蛋白等。
本发明中使用的单体蛋白在微生物的菌体内呈不溶性颗粒的形态。以后，只称呼“单体多聚体蛋白”时，还包括在微生物的菌体内意图不溶性颗粒的形态的单体蛋白的情形，该单体蛋白是指使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的蛋白。
本发明中使用的单体蛋白，可以利用本领域公知的方法、例如Ueda等人,Gene.1993,129,129-34.Lin,Y.等人,Cancer Res.2006,66,3884-3892.或Fischmann,T.O.等人,J.Biol.Chem.1991,266,12915-12920.Lin,Y.等人,Cancer Res.2006,66,3884-3892.中记载的方法，构建目标单体蛋白的生产系统，接着利用常规方法进行培养、集菌，由此即可制得。
〔步骤(B)：单体蛋白的增溶〕
■表面活性剂的种类
在本发明中，用于增溶单体蛋白的表面活性剂为月桂酰谷氨酸(月桂酰-Glu)或其盐。月桂酰-Glu可以是D体、L体、DL体中的任一种。优选月桂酰-L-Glu。
■表面活性剂的浓度
月桂酰-Glu或其盐优选制成1～10％的水溶液，更优选制成1～8％的水溶液。当为上述浓度范围时，可以充分提高单体蛋白的增溶效率，同时可以适度限制作为之后的操作的稀释的倍率。
■pH
关于该水溶液在25℃下的pH，根据单体蛋白的性质，可以选择优选pH6.5～9.0、更优选pH7.0～8.8的温和条件。需要说明的是，在本发明中，pH可以利用安装有pH电极的pH计来测定。pH的调节可以使用氢氧化钠等碱来进行。可以使用缓冲液作为该水溶液。
■温度和时间
利用如此操作制备的月桂酰-Glu水溶液，得到增溶单体蛋白的溶液。可以向月桂酰-Glu水溶液中添加单体蛋白，也可以向单体蛋白中添加月桂酰-Glu水溶液。
之后，通常可以在5～40℃下、优选15～40℃下放置。当为上述范围时，由化学反应引起的单体蛋白的切断或氧化等修饰被抑制在最小限度，因此优选。
放置时间通常为10分钟～3小时，优选为10分钟～1小时。当为上述范围时，由化学反应引起的单体蛋白的切断或氧化等修饰被抑制在最小限度，因此优选。可以在接触过程中进行搅拌。
蛋白是否被增溶，这可以通过例如目视的浊度判定、或者280nm等的紫外吸收光谱法等来确认。
〔步骤(C)：利用精氨酸缓冲液进行的稀释〕
■稀释倍率
接着，将步骤(B)中得到的增溶了单体蛋白的溶液，以数10倍～150倍左右的稀释倍率稀释在包含精氨酸或精氨酸衍生物作为添加剂的缓冲液中，直至单体蛋白恢复天然状态的高级结构，并维持不变。稀释后的月桂酰-Glu的浓度优选达到0.01～0.5％，进一步优选达到0.02～0.3％。稀释可以按照1段、多段(分级梯度)或线性梯度来适当选择进行。
当为上述范围时，天然状态的高级结构恢复得到促进，还可确保单体蛋白的稳定性，因此优选。单体蛋白是否恢复了天然状态的高级结构，这可以通过CD光谱或荧光光谱等分光测定、或观察HPLC等蛋白的理化特性的方法、或者酶活性等的高级结构指标来确认。
■添加剂的种类
用作添加剂的精氨酸可以是L型也可以是D型。可以是盐酸盐等与无机酸形成的盐、或者是乙酸盐等与有机酸形成的盐。
作为精氨酸衍生物，可以列举：乙酰精氨酸、N-丁酰精氨酸等具有碳原子数1～6的酰基的精氨酸；除去了羧基的精胺(agmatine,胍丁胺)；导入了羟基以代替α氨基的精氨酸等。作为精氨酸衍生物，优选酰基化精氨酸，更优选N-丁酰精氨酸。
作为添加剂，最优选精氨酸盐酸盐。
■pH
作为缓冲液，可以使用磷酸钠、枸橼酸钠、Tris-盐酸盐等。pH只要是与恢复天然状态的蛋白的性质相符的pH即可，稳定在大约pH6.5～9.0的中性pH。因此，步骤(C)中的pH只要处于该范围即可，可以不同于步骤(B)中的pH。pH的调节例如可以使用盐酸或氢氧化钠等来进行。
■添加剂浓度
添加剂浓度根据恢复天然状态的蛋白的性质分别选择，但稀释后的添加剂浓度优选调整成0.1～1.5M，进一步优选调节成0.2～1.2M。当为上述范围时，天然状态的高级结构恢复得到促进，因此优选。
■稀释温度·保持时间
稀释可以在室温下实施，当目标蛋白恢复天然状态时的热稳定性不够高时，可以在5～10℃下实施。温度调节可以按照1段、多段(分级梯度)或线性梯度适当选择进行。
稀释后，可以保持数小时～数天。优选保持1小时～5天，更优选保持1.5小时～3天，进一步优选保持2小时～24小时。可以逐步稀释。
分成几个阶段来进行稀释时，在最终阶段的稀释后，只取抵消稀释倍率的份量，例如利用超滤膜进行浓缩，从而将最终阶段的稀释后的蛋白浓度保持在0.01～1.0mg/ml、优选0.01～0.5mg/ml，当目标蛋白包含Fab时，促进构成Fab的重链与轻链的二硫键形成。
〔步骤(D)：与缓冲液进行置换〕
将步骤(C)中得到的溶液的溶剂与缓冲液进行置换。由此，从系统中除去月桂酰-Glu。
利用缓冲液进行的置换采用选自下述(d1)～(d4)的方法来进行，其中，优选(d1)的柱层析，更优选凝胶过滤层析：
(d1)选自凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析和它们的组合的柱层析；
(d2)超滤法；
(d3)透析法；以及
(d4)(d1)～(d3)中的两种以上的组合。
上述操作方法是本领域中使用的惯用方法，本领域技术人员可以适当选择·确定操作条件。
本发明中使用的缓冲液是pH缓冲液，例如可以使用：在三(羟甲基)氨基甲烷等弱碱性溶液中加入有计算量的强酸(例如盐酸、硫酸、甲酸等)的缓冲液、或者在磷酸等弱酸性溶液中加入有计算量的强碱(例如氢氧化钠或氢氧化锂等)稀溶液的缓冲液。
缓冲液中可以含有精氨酸或精氨酸衍生物，也可以含有NaCl等无机盐或EDTA等螯合剂。此时的浓度例如为0.001～1.2M。
缓冲液的pH优选为6～9。
利用本发明的方法，单体蛋白是否形成了多聚体蛋白，这可以通过紫外吸收、静态光散射法等来确认。
〔任意步骤(i)：用添加剂溶液进行稀释前的放置〕
根据蛋白，在用精氨酸或精氨酸衍生物缓冲液进行稀释前，可以添加磷酸缓冲溶液等，并进行放置。具体而言，在上述步骤(B)与步骤(C)之间添加磷酸缓冲液，使表面活性剂浓度达到2～5％，之后，优选在5～40℃下优选放置10分钟～1小时，由此可以提高单体蛋白的提取率，可以进一步提高溶解度。其结果，可以进一步提高蛋白的高级结构的恢复率。此时得到的溶液在25℃下的pH只要处于pH6.5～9.0的范围即可。
〔任意步骤(ii)：二硫键的形成〕
根据蛋白，在单一的分子内有时具有二硫键。使蛋白进行氧化还原反应以促进这些二硫键的形成时，重折叠率进一步提高，因此优选。
氧化还原反应可以通过共存用于促进硫醇·二硫化物交换反应以形成分子内或分子间的二硫键的氧化还原物质(例如氧化型谷胱甘肽(GSSG)与还原型谷胱甘肽(GSH)的混合物、或胱氨酸与半胱氨酸的混合物、或胱胺与半胱胺的混合物、或氧化型谷胱甘肽或胱氨酸与巯基乙醇的混合物等))、或用于促进空气氧化的铜离子来进行，也可以通过改变蛋白的氧化还原电位来进行。优选使用氧化还原物质。
氧化还原反应只要在上述步骤(B)以后进行即可，例如可以通过在上述步骤(C)中将氧化还原物质和添加剂一同添加到步骤(A)中得到的溶液中来进行，也可以通过在上述步骤(C)中在得到稀释液后向该稀释液中添加氧化还原物质来进行。
对于每一种恢复天然状态的蛋白，氧化还原物质或铜离子的浓度都调整至适当的浓度。
此时的25℃下的pH只要处于pH6.5～9.0的范围即可。pH的调节例如可以使用盐酸或氢氧化钠等来进行。
液温可以和步骤(B)中得到的溶液的温度为相同程度，也可以和步骤(C)中得到的溶液的温度为相同程度。为了促进氧化还原反应，优选5～48℃左右。
氧化还原反应后，可以在5～48℃下放置1小时～5天(120小时)左右。
根据本发明的方法，重折叠率至少为10％，往往会达到30％。
〔任意步骤(iii)：纯化〕
恢复了高级结构的蛋白，可以通过常规方法、例如超滤、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水性相互作用层析、反向层析、亲和层析等进行纯化。
在本发明人的之前的申请(国际公开第2009-136568号)中报道了：使用1～3％的预定的酰基谷氨酸表面活性剂在pH6.5～9.0下增溶改性蛋白，之后，使用精氨酸缓冲液进行稀释，使表面活性剂浓度降低至0.02～0.5％，由此可以有效地重建蛋白结构。
虽然多聚体蛋白具有通过非共价键缔合的若干个亚单元，但即使使用预定的酰基谷氨酸表面活性剂(月桂酰-L-Glu)在预定pH下增溶多聚体蛋白，之后仅凭用精氨酸缓冲液进行稀释，也无法结束重折叠。虽然不拘泥于任何的理论，但推测是亚单元间的缔合被月桂酰-L-Glu抑制。
本发明有悖于此，虽然不拘泥于任何的理论，但本发明推测如下：通过用月桂酰-L-Glu抑制亚单元间的缔合，起初只是促进亚单元的结构形成，之后用缓冲液置换认为是抑制缔合的因子的月桂酰-L-Glu而将其除去，其结果，引起亚单元之间的缔合，结束重折叠。
使用如此操作而制备的多聚体蛋白，可以得到癌症、免疫疾病、生活习惯病等各种疾病的治疗药、临床检查用试剂、研究用试剂等。这些药物组合物除了含有通过本发明的方法得到的多聚体蛋白外，还可以含有赋形剂或载体等。
实施例
〔参考例1〕
包含HyHEL-10scFvSA全长的不溶性颗粒的沉淀物的制备
构建以大肠杆菌BL21株(DE3)为生产宿主的、单链抗体可变区(HyHEL-10scFv)与全长型链霉亲和素(SA全长)的融合蛋白(HyHEL-10scFv SA全长)的生产系统(Ueda等人,Gene.1993,129,129-34.Lin,Y.等人,Cancer Res.2006,66,3884-3892.)。
按照常规方法，使用带有挡板的三角烧瓶，将所构建的生产菌在2×YT培养基中、在28℃下振荡培养18小时(4L)，使HyHEL-10scFv SA全长在大肠杆菌的菌体内以不溶性颗粒的形式蓄积。收集其菌体，悬浮于20mM Tris-盐酸盐、0.5M NaCl、pH8.1中，进行超声波破碎。将得到的悬浮液在6000g、30分钟的条件下进行离心分离，回收包含HyHEL-10scFv SA全长不溶性颗粒的沉淀物。
回收的沉淀物依次用2％的Triton X-100水溶液、丙酮进行清洗。之后，用纯净水(ミリQ水)清洗，完全除去Triton X-100。再次在上述条件下进行离心分离操作，得到包含不溶性颗粒的沉淀物。
将得到的每100mg的沉淀物分到4支Eppendorf离心管中。将各管称作管1～4。
需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，则单位“％”是指“质量％”。
〔参考例2〕
包含D1.3scFv SA全长的不溶性颗粒的沉淀物的制备
在参考例1中，除了使用D1.3scFv作为单链抗体可变区来代替HyHEL-10scFv，构建其与全长型链霉亲和素(SA全长)的融合蛋白(D1.3scFv SA全长)的生产系统(Fischmann,T.O.等人,J.Biol.Chem.1991,266,12915-12920.Lin,Y.等人,Cancer Res.2006,66,3884-3892.)以外，进行与参考例1相同的操作，得到包含D1.3scFv SA全长的不溶性颗粒的沉淀物。
〔实验1〕
(1)制备5％的月桂酰-L-Glu溶液(20mM磷酸钠、pH8.5)。
(2)将该溶液中的0.2ml加入到管1中、0.25ml加入到管2中、0.3ml加入到管3中、0.35ml加入到管4中，增溶管中的沉淀物。将管1～4在室温下涡旋后，轻轻地进行离心分离(10000rpm、1分钟)，消去所产生的泡。
(3)向各管中加入20mM的磷酸钠(pH7)，定容至0.5ml，将管1～4的最终的月桂酰-L-Glu浓度分别调整至2.0％、2.5％、3.0％、3.5％。使用微小pH电极将管内的pH调节至7.3左右，之后在37℃下加热30分钟，从沉淀物中提取不溶性颗粒，使其溶解。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，则在25℃下测定pH。
(4)将得到的各溶液转移到另外的Eppendorf离心管中，在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟，回收上清1～4。
(5)作为稀释用溶液，制备0.404M的精氨酸盐酸盐溶液(1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH7.2)。
(6)使用7.425ml的该稀释用溶液，在5℃下稀释之前回收的各0.075ml的上清1～4，最终分别调整成0.1％的月桂酰-L-Glu、0.4M的精氨酸盐酸盐(1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH7.2、7.5ml)。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(7)已稀释的上清1～4在5℃下保持18小时，之后用离心分离型超滤膜(AmiconUltra 15、分子量截留10kDa；Millipore制)浓缩3倍，调整至2.5ml。
(8)将各2.5ml的3倍浓缩液负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mMEDTA、pH7.2)事先平衡好的凝胶过滤用柱(PD-10柱、GE Healthcare制)上，接着，用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。由此，用缓冲液置换柱内的浓缩液。
(9)将这些浓缩液在5℃下保持18小时后，在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟。将30μL该上清供给凝胶过滤HPLC(柱：Superdex 20010/300GL、GE Healthcare制；展开液：0.1M磷酸钠、0.8M精氨酸盐酸盐、pH6.8；检测方法：225nm的紫外吸收；定量用标准品：纯化抗血管性血友病因子单克隆抗体(WO96/17078))，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。结果见表1。
[表1]
Figure BDA0001344226950000111
可知：在使用5.0％的月桂酰-L-Glu溶液增溶沉淀物后，使用2.0～3.5％的月桂酰-L-Glu溶液，从包含不溶性颗粒的沉淀物中提取融合蛋白，使不溶性颗粒溶解，之后进行重折叠时，可以回收1.0～1.8μg/ml的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
〔实验2〕
(1)制备2％的月桂酰-L-Glu溶液(20mM磷酸钠、pH8.5)。
(2)使用(1)中得到的溶液，进行与实验1相同的操作，将其加入到参考例1中得到的100mg沉淀物中，增溶该沉淀物。
(3)制备含有精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(4)使用(3)中制备的稀释用溶液，将(2)中得到的溶液稀释100倍，最终调整成30ml的0.02％月桂酰-L-Glu、0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、1mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、pH8.0。蛋白浓度调整至0.02mg/ml。
(5)与实验1一样，保持(4)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，调整至10ml。
(6)将40μl的(5)中得到的3倍浓缩液在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟，与实验1一样，将得到的10μl上清供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
(7)另外，将2.5ml的(5)中得到的3倍浓缩液负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、pH6.6)事先平衡好的PD-10柱上，接着，用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(8)进行与实验1相同的操作，将(7)的回收物保持和离心分离后，同样将12μl该上清供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。结果见表2。
[表2]
Figure BDA0001344226950000121
由表2所示的结果可知：在用稀释用溶液稀释了100倍的阶段(步骤(4))，完全无法检测HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白，置换成缓冲液并保持时(步骤(7)和(8))，可以回收2.4μg/ml的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
〔实验3〕
(1)进行与实验1相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)与实验1一样，将每0.15ml的该溶液用稀释用溶液稀释100倍，最终分别调整至pH7.2和pH8.4(0.05％月桂酰-L-Glu、0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、15ml)。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(3)与实验1一样，保持(2)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，分别调整至5ml。
(4)使用与实验1相同的缓冲液，将上述浓缩液中的每2.5ml负载到PD-10柱上，接着，用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(5)与实验1一样，将其保持和离心分离后，供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
[表3]
Figure BDA0001344226950000131
由表3所示的结果可知：增溶后，即使稀释至pH7.2或8.4，也可以回收相同程度的量的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
〔实验4〕
(1)进行与实验1相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)制备各种浓度的包含精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)按每份0.075ml分取(1)中得到的溶液，用(2)中制备的稀释用溶液稀释100倍，最终使月桂酰-L-Glu浓度达到0.02％、0.05％、0.07％、0.1％、0.2％或0.3％(0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、pH7.2、7.5ml)。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(4)与实验1一样，保持(3)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，分别调整至2.5ml。
(5)使用与实验1相同的缓冲液，将2.5ml的(4)中得到的3倍浓缩液负载到PD-10柱上，接着，用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(6)与实验1一样，将其保持和离心分离后，供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
[表4]
Figure BDA0001344226950000132
由表4所示的结果可知：增溶后，将月桂酰-L-Glu浓度稀释至0.02～0.30％，由此可以回收相同程度的量的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
〔实验5〕
(1)进行与实验1相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)制备各种浓度的包含精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)按每份0.075ml分取(1)中得到的溶液，用(2)中制备的稀释用溶液稀释100倍，最终使精氨酸盐酸盐浓度达到0.4M、0.8M、1.0M、1.2M(0.025％月桂酰-L-Glu、1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH7.2、7.5ml)。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(4)与实验1一样，保持(3)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，分别调整至2.5ml。
(5)使用与实验1相同的缓冲液，将各2.5ml的(4)中得到的3倍浓缩液负载到PD-10柱上，接着，用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(6)与实验1一样，将其保持和离心分离后，供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
[表5]
Figure BDA0001344226950000141
增溶后，将精氨酸盐酸盐浓度稀释至0.4～1.2M，由此可以回收相同程度的量的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
〔实验6〕
(1)进行与实验1相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)制备使还原型谷胱甘肽浓度和氧化型谷胱甘肽浓度发生了各种变化的包含精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)按每份0.075ml分取(1)中得到的溶液，分别用(2)中制备的稀释用溶液稀释100倍，最终使还原型谷胱甘肽浓度、氧化型谷胱甘肽浓度从无添加变化至5mM(0.05％月桂酰-L-Glu、1.2M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH8.4、7.5ml)。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(4)与实验1一样，保持(3)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，分别调整至2.5ml。
(5)将2.5ml的(4)中得到的3倍浓缩液负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.4M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、pH8.0)事先平衡好的PD-10柱上，接着，用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(6)与实验1一样，将其保持和离心分离后，供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
[表6]
Figure BDA0001344226950000151
可知：即使将还原型谷胱甘肽浓度、氧化型谷胱甘肽浓度分别从无添加变化至5mM，也可以回收已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。由此可知：根据蛋白，必需使特定的组合达到还原型和氧化型谷胱甘肽浓度时，可以适当选择最佳浓度的组合。
〔实验7〕
(1)进行与实验2相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)制备含有精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)按每份0.3ml分取(1)中得到的溶液，分别用上述稀释用溶液稀释，最终调整成30ml的0.02％月桂酰-L-Glu、0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、1mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、80mM Tris-盐酸盐、pH8.0。蛋白浓度调整至0.02mg/ml。
(4)与实验1一样，保持(3)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，调整至10ml。
(5)将其加入到50mM Tris-盐酸盐和1mM EDTA中，制备含有0.2M NaCl或精氨酸盐酸盐、pH6.6或pH7.6的共计4种缓冲液。
(6)将每2.5ml的(4)中得到的3倍浓缩液负载到用上述缓冲液事先平衡好的PD-10柱上，接着，分别用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(7)与实验1一样，将其保持和离心分离后，供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
[表7]
Figure BDA0001344226950000152
即使缓冲液的添加盐是NaCl、精氨酸盐酸盐中的任一种，也可以回收HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。添加盐中使用精氨酸盐酸盐时，与使用NaCl时相比，可知四聚体蛋白的回收量增加。可知：添加盐中使用NaCl时，若pH由6.6上升至7.6，则回收量增加。
〔实验8〕
(1)进行与实验2相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)制备含有精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)将0.45ml的(1)中得到的溶液用上述稀释用溶液稀释100倍，最终调整成45ml的0.02％月桂酰-L-Glu、0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH8.0。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(4)与实验1一样，保持(3)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，调整至15ml。
(5)作为缓冲液，制备pH6.5、pH7.2、pH8.4的共计3种缓冲液。其中，pH6.5的缓冲液包含0.2M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA和25mM磷酸钠。pH7.2和pH8.4的缓冲液包含50mM Tris-盐酸盐以代替25mM磷酸钠。
(6)将每2.5ml的(4)中得到的3倍浓缩液负载到用上述缓冲液事先平衡好的PD-10柱上，接着，分别用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(7)与实验1一样，将其保持和离心分离后，供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
[表8]
Figure BDA0001344226950000161
可知：将缓冲液的pH设定为6.5～8.4时，可以回收HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
〔实验9〕
(1)进行与实验2相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)制备含有精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)将0.45ml的(1)中得到的溶液用上述稀释用溶液稀释100倍，最终调整成45ml的0.02％月桂酰-L-Glu、0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、1mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、80mM Tris-盐酸盐、pH8.0。蛋白浓度调整至0.02mg/ml。
(4)与实验1一样，保持(3)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，调整至15ml。
(5)作为缓冲液，制备使精氨酸盐酸盐浓度变化至0.05M、0.1M、0.2M、0.4M、0.8M的共计6种缓冲液。其中，所有的缓冲液均为25mM磷酸钠、1mM EDTA、pH6.6。
(6)将每2.5ml的(4)中得到的3倍浓缩液负载到用上述缓冲液事先平衡好的PD-10柱上，接着，分别用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(7)将其在5℃下保持18小时后，用离心分离型超滤膜(Amicon Ultra 4、截留分子量为10kDa)分别浓缩5倍，调整至0.6ml。
(8)将其中的0.5ml负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mM EDTA、pH8.0)事先平衡好的PD MiniTrap G-25(GE Healthcare制)上，用0.9ml相同的缓冲液展开，回收全量。
(9)再负载到用与(8)中使用的缓冲液相同的缓冲液事先平衡好的阴离子交换柱(HiTrap Q HP；GE Healthcare制)上，回收全量的通过柱的组分。如此操作，除去聚集体。
(10)将通过的组分用超滤膜(Amicon Ultra 4、截留分子量为10kDa)浓缩至0.5ml，在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟，之后将30μl该上清供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
[表9]
Figure BDA0001344226950000171
可知：将缓冲液的精氨酸盐酸盐添加浓度设定为0.05～0.8M时，回收了HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白，当精氨酸盐酸盐添加浓度为0.2～0.8M时，其回收量提高。
〔实验10〕
(1)进行与实验2相同的操作，增溶参考例1中得到的100mg沉淀物。
(2)制备含有精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)将3.8ml的(1)中得到的溶液用上述稀释用溶液稀释100倍，最终调整成380ml的0.02％月桂酰-L-Glu、0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、1mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、80mM Tris-盐酸盐、pH8.0。蛋白浓度调整至0.02mg/ml。
(4)在5℃下保持(3)中得到的溶液18小时，之后用超滤膜(Pellicon 3、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩至75ml。
(5)将每25ml的浓缩液分3次负载到用缓冲液(25mM磷酸钠、0.1M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、pH6.6)事先平衡好的Sephadex G-25柱(5cmφ×6.5cm；GE Healthcare制)上，接着，用相同的缓冲液展开，以280nm的紫外吸收为指标，得到蛋白组分。
(6)将得到的共计105ml的蛋白组分在5℃下保持18小时，之后用超滤膜(PelliconXL、再生纤维素膜、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩约3倍，达到36ml。
(7)将每12ml的浓缩液分3次负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mMEDTA、pH8.0)事先平衡好的Superdex 200pg 26/60(2.6cmφ×60cm，GE Healthcare制)上，以280nm的紫外吸收为指标，回收HyHEL-10scFv SA全长组分。
(8)将组分合并后，通过凝胶过滤HPLC定量，确认到920μg的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。将该组分用超滤膜(Amicon Ultra 15、截留分子量为30kDa)浓缩至10ml。
(9)为了除去其中所含的聚集体，将其负载到用与(7)中使用的缓冲液相同的缓冲液事先平衡好的阴离子交换柱(HiTrap CaptoQ、5ml；GE Healthcare制)上，回收除去了聚集体的全量的通过柱的组分。通过凝胶过滤HPLC定量，确认到了450μg的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
(10)浓缩至2.5ml后，将其全量负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mM EDTA、pH8.0)事先平衡好的Superdex 200pg 16/60(1.6cmφ×60cm；GE Healthcare制)上，以280nm的紫外吸收为指标，回收HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。通过凝胶过滤HPLC定量，确认到150μg的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白。
(11)纯化的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白，在还原SDS凝胶电泳中在45kDa附近显示出单一谱带(图1)，在凝胶过滤HPLC中显示出分子量为230kDa的单峰，不出所料，可知其形成了四聚体(图2)。
(12)根据已有的报道(Ueda等人,Gene.1993,129,129-34.)，研究纯化的HyHEL-10scFv SA全长的卵清溶菌酶抑制活性。
测定用的缓冲液使用50mM的磷酸溶液(pH6.2)、200mM NaCl。将鸡卵清溶菌酶(生化学工业株式会社Code No.100940)的最终浓度调整至1.5μM，制备混合溶液，使HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白与溶菌酶的相对浓度达到[HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白]/[溶菌酶]＝0～2.0。将其在28℃下加热1小时，之后将30μl的该混合液与970μl的调整成540nm下的吸光度为1.0的微生物悬浮液(溶壁微球菌ATCC No.4698；M3770-5G、Sigma-Aldrich制)混合，立即在测定波长540nm下测定吸光度变化达5分钟。
若增加HyHEL-10scFv SA全长的添加量，则鸡卵清溶菌酶所产生的微生物的溶菌活性被显著抑制，可知纯化的HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白具有溶菌酶抑制活性。
〔实验11〕
(1)将570mg的参考例2中得到的包含D1.3scFv SA全长不溶性颗粒的沉淀物供给与实验1相同的增溶处理，最终得到1.8ml 2％的月桂酰-L-Glu溶液。
(2)将该溶液用稀释用溶液稀释100倍，最终调整成180ml的0.02％月桂酰-L-Glu、0.8M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、1mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、80mM Tris-盐酸盐、pH8.0。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(3)在5℃下保持18小时后，用超滤膜(Pellicon 3、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩至50ml。
(4)将每25ml的浓缩液分2次负载到用缓冲液(25mM磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、pH6.6)事先平衡好的Sephadex G-25柱(5cmφ×6.5cm；GE Healthcare制)上，接着，用相同的缓冲液展开，以280nm的紫外吸收为指标，得到蛋白组分。
(5)将得到的共计70ml的蛋白组分在5℃下保持18小时后，用超滤膜(PelliconXL、再生纤维素膜、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩约3倍，达到24ml。
(6)将每12ml的浓缩液分2次负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mMEDTA、pH8.0)事先平衡好的Superdex 200pg 26/60(2.6cmφ×60cm；GE Healthcare制)上，以280nm的紫外吸收为指标，回收D1.3scFv SA全长组分。
(7)将该组分用超滤膜(Amicon Ultra 15、截留分子量为30kDa)浓缩至6ml。再将其负载到用与(6)中使用的缓冲液相同的缓冲液事先平衡好的阴离子交换柱(HiTrapCapto Q、5ml；GE Healthcare制)上，回收除去了聚集体的全量的通过柱的组分。通过凝胶过滤HPLC定量，确认到220μg的D1.3scFv SA全长多聚体蛋白。
(8)浓缩至2.0ml后，将其全量负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mM EDTA、pH8.0)事先平衡好的Superdex 200pg 16/60(1.6cmφ×60cm；GE Healthcare制)上，以280nm的紫外吸收为指标，回收D1.3scFv SA全长多聚体蛋白。通过凝胶过滤HPLC定量，确认到64μg的纯化D1.3scFv SA全长。
(9)纯化的D1.3scFv SA全长多聚体蛋白在还原SDS凝胶电泳中在45kDa附近显示出单一谱带(图3)、在凝胶过滤HPLC中显示出200kDa的单峰，由此可知：不出所料，其形成了四聚体(图4)。
(10)将(8)中得到的纯化D1.3scFv SA全长多聚体蛋白供给与实验10相同的酶抑制评价，结果可知：上述多聚体蛋白具有卵清溶菌酶抑制活性。
〔比较实验例1〕
(1)制备8M盐酸胍、20mM磷酸钠、pH8.5的溶液。
(2)向参考例1中得到的包含不溶性颗粒的100mg沉淀物中加入0.375ml的上述溶液，增溶沉淀物。在室温下涡旋后，轻轻地进行离心分离，消去所产生的泡。
(3)向其中添加微量的20mM磷酸钠、pH8.5，调整至0.5ml。在37℃下加热30分钟，供给涡旋，确认不溶性颗粒充分溶解。
(4)将该溶液在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟，回收0.25ml的上清。
(5)将0.05ml的该上清用稀释用溶液稀释100倍，最终调整成5ml的6M盐酸胍、0.2MNaCl、50mM Tris-盐酸盐、1mM EDTA、pH8.0。蛋白浓度调整至0.02mg/ml。
(6)将其通过分级透析法(Tsumoto等人,Journal ofImmunological Methods,219,119-129(1998))进行透析。具体而言，用1000ml的表10所示的透析编号1～5的透析外液在5℃下透析预定的时间，最终回收5.5ml的透析内液。回收的透析内液在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟，之后将30μl的该上清供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。其结果，无法确认到HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白的峰(没有图示)。
[表10]
Figure BDA0001344226950000201
〔比较实验例2〕
(1)制备8M盐酸胍、20mM磷酸钠、pH8.5的溶液。
(2)向参考例1中得到的包含不溶性颗粒的100mg沉淀物中加入0.375ml上述溶液，增溶沉淀物。将其在室温下涡旋后，轻轻地进行离心分离，消去所产生的泡。
(3)向其中添加微量的20mM磷酸钠、pH8.5，调整成0.5ml。在37℃下加热30分钟，供给涡旋，确认不溶性颗粒充分溶解。
(4)将该溶液在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟，回收0.32ml的上清。
(5)作为稀释用溶液，制备未添加或添加月桂酰-L-Glu、未添加或添加还原型和氧化型谷胱甘肽的共计4种稀释用溶液。其中，所有的稀释用溶液均为0.06M盐酸胍、0.2M精氨酸盐酸盐、80mM Tris-盐酸盐、1mM EDTA、pH7.2。
(6)将每0.075ml的(4)中得到的上清用各稀释用溶液稀释100倍，最终制备成各7.5ml的0.06M盐酸胍、0.2M精氨酸盐酸盐、80mM Tris-盐酸盐、1mM EDTA、pH7.2。但是，最终调整成月桂酰-L-Glu浓度为0％或0.05％、还原型和氧化型谷胱甘肽浓度为0mM或1mM的共计4种溶液。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。
(7)与实验1一样，保持(6)中得到的溶液后，用离心分离型超滤膜浓缩3倍，分别调整至2.5ml。
(8)将这些浓缩液负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mM EDTA、pH7.2)事先平衡好的PD-10柱上，接着，用3.0ml相同的缓冲液展开，回收全量的浓缩液。
(9)将其在5℃下保持18小时后，在14000rpm(18700×g)下离心分离10分钟，同样将30μl的该上清供给凝胶过滤HPLC，定量已形成四聚体结构的HyHEL-10scFv SA全长。
其结果，用蛋白改性剂(盐酸胍)代替月桂酰-L-Glu来增溶不溶性颗粒时，完全无法确认HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白的峰(没有图示)。即使向稀释用溶液中添加月桂酰-L-Glu或谷胱甘肽，也无法提高HyHEL-10scFv SA全长多聚体蛋白的回收率(没有图示)。
〔参考例3〕
包含HyHEL-10scFvSAcore的不溶性颗粒的沉淀物的制备
与参考例1一样，构建以大肠杆菌BL21株(DE3)为生产宿主的、单链抗体可变区(HyHEL-10scFv)与天然存在的野生型核心序列链霉亲和素(natural core Streptavidin)的融合蛋白(HyHEL-10scFv SAcore)的生产系统。natural core Streptavidin的氨基酸序列见已有的报道(Takeshi Sano等人.Thejournal ofbiological chemistry 270,47,28204-28209(1995))。
按照常规方法，使用培养烧瓶在LB培养基中、在37℃下振荡培养所构建的生产菌。培养数小时后，确认到660nm的吸光度为约0.8，添加IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷)使达到1mM，之后进一步培养4～5小时，使HyHEL-10scFv SAcore在大肠杆菌的菌体内以不溶性颗粒的形式蓄积。
从250ml份的培养液中回收菌体，将其悬浮于20ml的20mM Tris-盐酸盐、30mMNaCl、5mM EDTA、pH7.5中，之后在冰冷下进行60W、3分钟的超声波破碎。得到的菌体破碎液在5℃下进行4400g、10分钟的离心分离，得到的沉淀物再次悬浮于20ml的20mM Tris-盐酸盐、30mM NaCl、5mM EDTA、pH7.5中。在5℃下进行6500g、10分钟的离心分离，得到沉淀物。再重复1次相同的操作，最终得到1.11g的包含HyHEL-10scFv SAcore不溶性颗粒的沉淀物。
〔实验12〕
(1)进行与实验2相同的操作，增溶参考例3中得到的1.11g HyHEL-10scFv SAcore沉淀物，得到4.75ml增溶液。但最终将所含的月桂酰-L-Glu浓度调整至2.5％。
(2)制备含有精氨酸盐酸盐的稀释用溶液。
(3)将(1)中得到的4.75ml增溶液中的2.9ml用上述稀释用溶液稀释50倍，最终调整成145ml的0.05％月桂酰-L-Glu、1.2M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH7.6。蛋白浓度调整至0.05mg/ml。当为HyHEL-10scFv SAcore时，由于已经进行了分子内二硫键形成，所以没有必需利用谷胱甘肽等氧化还原物质进行二硫键形成促进反应。
(4)将(3)中得到的溶液在5℃下保持18小时后，用超滤膜(Pellicon 3、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩至50ml。
(5)将每25ml的浓缩液分2次负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、pH7.8)事先平衡好的Sephadex G-25柱(5cmφ×6.5cm；GE Healthcare制)上，接着，用相同的缓冲液展开，以280nm的紫外吸收为指标，得到蛋白组分。由此，用缓冲液置换柱内的浓缩液。
(6)将得到的共计68ml的蛋白组分在5℃下保持3天，之后用超滤膜(Amicon Ultra15、再生纤维素膜、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩约3倍，达到15ml。
(7)将其用缓冲液(20mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、pH8.0)稀释6倍，调整至90ml，负载到用相同的缓冲液事先平衡好的阴离子交换柱(HiTrap Q HP、5ml；GE Healthcare制)上，回收已除去聚集体的通过柱的组分的全量95ml，在5℃下保持1天。将其全量用超滤膜(Amicon Ultra 15、再生纤维素膜、截留分子量为30kDa；Millipore制)浓缩至10ml，通过凝胶过滤HPLC定量，确认到1.2mg的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白。将其在5℃下保持2天。
(8)将10ml浓缩液中的5ml用缓冲液(20mM Tris-盐酸盐、pH8.0)稀释10倍，调整至50ml。将其负载到用相同的缓冲液事先平衡好的阴离子交换柱(HiTrap Q HP、5ml；GEHealthcare制)上，以2.5ml/分钟的流速，用洗脱用缓冲液(20mM Tris-盐酸盐、0.5M NaCl、pH8.0)进行20分钟的线性浓度梯度洗脱。以280nm的紫外吸收为指标，得到6.5ml蛋白组分。
对剩下的5ml浓缩液进行相同的处理，得到7.8ml蛋白组分。将两种蛋白组分合并，用超滤膜(Amicon Ultra 15、再生纤维素膜、截留分子量为30kDa；Millipore制)浓缩至2ml，通过凝胶过滤HPLC定量，确认到0.76mg的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白。将其在5℃下保持2天。
(9)将2ml浓缩液负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、1mM EDTA、pH8.0)事先平衡好的Superdex 200pg 16/60(2.6cmφ×60cm；GE Healthcare制)上，以280nm的紫外吸收为指标，回收HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白。用超滤膜(Amicon Ultra15、再生纤维素膜、截留分子量为30kDa；Millipore制)浓缩至1ml，通过凝胶过滤HPLC定量，确认到0.39mg的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白。
来自增溶液的总回收率为5.3％。
纯化的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白在凝胶过滤HPLC中产生意味着单分散性高的尖峰(图5)，在展开溶剂中使用0.1M的磷酸钠、pH6.8的场流分级法/静态光散射法中得到了178kDa的分子量(图6)。在使用1ml RESOURCE Q(GE Healthcare制)的阴离子交换HPLC中，显示出1个尖峰(图7)。
由上述结果得出了以下结论：得到了具有所预料的四聚体结构的HyHEL-10scFvSAcore多聚体蛋白。
(10)根据已有的报道(Ueda等人,Gene.1993,129,129-34.)研究纯化的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的卵清溶菌酶的酶抑制活性。
使用测定用缓冲液(50mM磷酸缓冲液、12mM NaCl、pH6.2)，制备鸡卵清溶菌酶(Code No.L-6876、Sigma-Aldrich制)的最终浓度调整至0.09μM、纯化HyHEL-10scFvSAcore多聚体蛋白的最终浓度调整至0.0056～0.045μM七个阶段的100μl的混合溶液，在28℃下保持30分钟。由于纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白在分子内具有4个抗溶菌酶抗体结构域(HyHEL-10scFv)，所以上述混合溶液中的溶菌酶：HyHEL-10scFv混合摩尔比相当于1：0.25～1：2。
作为溶菌酶活性的阳性对照，制备未添加纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的混合溶液。
向100μl的各混合溶液中加入100μl的用50mM磷酸缓冲液(pH6.2)调整成540nm下的吸光度为1.78的微生物悬浮液(溶壁微球菌、ATCC4698、SIGMA M-3770、Sigma-Aldrich制)，立即在28℃下、在测定波长540nm下每5分钟测定1次吸光度，历时1小时。以各测定点的吸光度减少率(斜率)作为溶菌酶活性，研究纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白与鸡溶菌酶的混合摩尔比和溶菌酶活性抑制率的关系。
鸡溶菌酶：HyHEL-10scFv混合摩尔比为1：1时，溶菌酶活性的50％被抑制，混合摩尔比为1：2时，溶菌酶活性大体上被抑制(图8)。
由此显示：在1分子的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白所具有的4个scFv中，有2个scFv与溶菌酶结合，具有抑制其活性的能力。
(11)通过展开溶剂中使用0.1M磷酸钠、pH6.8的场流分级法/静态光散射法研究纯化的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的卵清溶菌酶结合能力。
使用缓冲液(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、pH8.0)，制备纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的最终浓度调整至1.24μM、鸡卵清溶菌酶的最终浓度调整至未添加、2.48μM、4.95μM三个阶段的600μl的混合溶液。由于纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白在分子内具有4个抗溶菌酶抗体结构域(HyHEL-10scFv)，所以上述混合溶液中的溶菌酶：HyHEL-10scFv混合摩尔比分别相当于0：1、0.5：1、1：1。在5℃下保持24小时后，将70μl的各混合溶液供给场流分级法，追踪峰的保留时间和静态光散射法中的分子量的变化。
随着溶菌酶混合比的上升，峰保留时间延长，支持由溶菌酶的结合引起的分子大小的增加。算出分子量分别是163.4kDa、188.1kDa、225.0kDa，显示每1分子的纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白分别结合有0分子(未添加溶菌酶)、1.7分子、4.3分子的鸡卵清溶菌酶。
由此可知：具有四价结合能力的纯化HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白，如设计的那样，每1分子可以结合4分子的溶菌酶。但是，如上述(10)的酶活性抑制评价中所示，实际上溶菌酶活性受到抑制的溶菌酶仅限于相当于所结合的溶菌酶分子的1/2的2分子。
〔实验13〕
(1)将与实验12中使用的增溶液相同的、0.15ml的HyHEL-10scFv SAcore增溶液用含有精氨酸盐酸盐的稀释用溶液稀释50倍，最终调整成7.5ml的0.05％月桂酰-L-Glu、1.2M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、80mM Tris-盐酸盐、pH7.6。蛋白浓度调整至0.03mg/ml。
将得到的溶液在5℃下保持18小时后，用超滤膜(Amicon Ultra 15、再生纤维素膜、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩至2.5ml，负载到用缓冲液(50mM Tris-盐酸盐、0.3M精氨酸盐酸盐、1mM EDTA、pH7.8)事先平衡好的PD-10柱(GE Healthcare制)上，用3ml相同的缓冲液展开，回收全量。由此，用缓冲液置换柱内的浓缩液。
将得到的蛋白组分在5℃下保持1天后，用超滤膜(Amicon Ultra 4、再生纤维素膜、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩3倍，达到1ml，在5℃下保持2天。将其用缓冲液(20mM Tris-盐酸盐、0.2M NaCl、pH8.0)稀释6倍，调整至6ml，负载到用相同的缓冲液事先平衡好的阴离子交换柱(HiTrap Q HP、1ml；GE Healthcare制)上，回收除去了聚集体的通过柱的组分的全量7ml。
立即用超滤膜(Amicon Ultra 4、再生纤维素膜、截留分子量为10kDa；Millipore制)浓缩7倍，达到1ml，通过凝胶过滤HPLC定量，确认到0.038mg的HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白。来自增溶液的总回收率为17.0％。
(2)将增溶阶段、用含有精氨酸盐酸盐的稀释用缓冲液进行50倍稀释的稀释阶段、通过PD-10柱置换成含有精氨酸盐酸盐的缓冲液的置换阶段、和利用阴离子交换柱进行的纯化阶段的各样品供给非还原的SDS-PAGE，确认形成了四聚体结构的操作阶段。
在该SDS-PAGE中，用包含2％SDS的稀释用缓冲液将各样品稀释调整至0.03μg/ml，之后将样品前处理用的加热条件缓和成45℃、2分钟，使已经形成的四聚体结构不会解离，并且可以以四聚体谱带的形式进行观察。在该温和的加热条件下进行了样品处理的SDS-PAGE分析中，不破坏natural core Streptavidin(天然核心链霉亲和素)的四聚体结构且可观察到，这通过已有的报道(Jody Schultz,Donald.Axworthy等人,Cancer Research60,6663-6669(2000))等来显示。
如图9所示，在增溶阶段、用含有精氨酸盐酸盐的稀释用缓冲液进行50倍稀释的稀释阶段，没有观察到HyHEL-10scFv SAcore多聚体蛋白的谱带。可知：在完全除去了月桂酰-L-Glu、置换成含有精氨酸盐酸盐的缓冲液的置换阶段，初次形成了四聚体结构(图中用←显示的谱带)。
这具体地显示了本发明的特性：即通过用月桂酰-L-Glu抑制亚单元间的缔合，首先只进行亚单元的结构形成，之后用缓冲液置换月桂酰-L-Glu而将其除去，实现了亚单元之间的缔合促进和折叠的结束。

Claims (5)

1.多聚体蛋白的制备方法，所述多聚体蛋白是由使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白和能够形成亚单元结构的蛋白或其功能性片段融合而得到的单体蛋白组成的，该制备方法包括下述步骤：
步骤(A)，准备在微生物的菌体内呈不溶性颗粒形态的蛋白，该蛋白为使具有免疫球蛋白折叠结构的蛋白与能够形成亚单元结构的其他蛋白融合而得到的单体蛋白；
步骤(B)，利用含有月桂酰谷氨酸或其盐的水溶液增溶步骤(A)中准备的单体蛋白；
步骤(i)，在步骤(B)得到的溶液中添加磷酸缓冲液，使月桂酰谷氨酸或其盐的浓度达到2～5%；
步骤(C)，在含有精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液中稀释步骤(i)中得到的溶液，降低月桂酰谷氨酸或其盐的浓度，由此使得单体蛋白恢复天然状态的高级结构；以及
步骤(D)，利用选自下述(d1)～(d4)的方法，将步骤(C)中得到的溶液的溶剂置换成含有无机盐类和螯合剂的缓冲液，从而从系统中除去月桂酰谷氨酸或其盐，使单体蛋白的亚单元之间缔合而得到所述多聚体蛋白，
(d1)：选自凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析和它们的组合的柱层析；
(d2)：超滤法；
(d3)：透析法；以及
(d4)：(d1)～(d3)中的两种以上的组合，
其中，精氨酸或精氨酸衍生物选自具有碳原子数1～6的酰基的精氨酸、精氨酸丁酯、精胺和精氨酸。
2.权利要求1所述的方法，其中，单体蛋白为scFv与链霉亲和素的融合蛋白。
3.权利要求2所述的方法，其中，上述scFv选自HyHEL-10 scFv和D1.3 scFv。
4.权利要求2或3所述的方法，其中，链霉亲和素为全长链霉亲和素或其功能性片段。
5.权利要求1所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物为精氨酸盐酸盐。
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