JPWO2012176919A1 - 免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質と、サブユニット構造となりうるタンパク質とを融合させた単量体タンパク質からなる多量体タンパク質の調製方法 - Google Patents
免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質と、サブユニット構造となりうるタンパク質とを融合させた単量体タンパク質からなる多量体タンパク質の調製方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
1988年、抗体断片を大腸菌で製造(非特許文献1〜3)できるようになって以来、組織移行性の高い、低分子化された改変抗体(抗体断片)の開発が続いてきた。より高い殺ガン効果を得るために、抗体断片と、抗がん剤、毒素、放射性同位体又はプロドラッグ活性化酵素等とを融合させた抗体融合タンパク質も多く提案されてきた。
しかし、天然の抗体の持つ二価の結合性は、標的抗原への高い親和性と優れた体内動態を発揮させる基盤であるところ、人工的に作られた一価の抗体融合タンパク質の標的抗原への結合性は、天然の抗体の結合性には及ばない。
Diabody、Triabody、又は免疫グロブリンMを模倣した抗体のように、抗体構造そのものの会合性を使って多価分子を調製する方法が知られている。別の方法として、抗体の断片構造に、会合性タンパク質を融合させることで多価分子を得る方法もある。単鎖抗体可変領域(scFv)に結合させたロイシンジッパー構造などを介して二量化させるものや(非特許文献5)ヒトp53由来の四量体化αへリックス構造を介するもの(非特許文献6)、微生物由来のストレプトアビジンの4量体化を利用するものなどがその例である。特に、ストレプトアビジンを融合させる方法については、ストレプトアビジンの構造改変による高機能化(安定性と溶解性を高め、免疫原性を下げるなど)がすでに達成されている(非特許文献7)。ストレプトアビジンを融合させたタンパク質は、ストレプトアビジンに高い親和性で結合するビオチン分子を介した薬剤プレターゲティングが可能なことから、最も期待される多価融合タンパク質の一つである(非特許文献7)。
Schultzらは、ストレプトアビジンに結合させるscFv内のペプチドリンカーや、H鎖とL鎖の配置順序を工夫することで、大腸菌の菌体内に可溶性かつ活性型で生産させた例を報告している(非特許文献8)。しかし、ストレプトアビジンを改変型に変えると、大腸菌の菌体内で不溶化することがわかっている(非特許文献9)。従って、ストレプトアビジン融合タンパク質の実用化には、リフォールディング操作が必要と考えられている。
このような事情から、Choeらは改変型ストレプトアビジン融合タンパク質のリフォールディング例を検討したが(非特許文献10)、目的物の回収率は1%を大きく下回っており、実用化にはまだ課題が多かった。
本発明は、多価融合タンパク質の中でも、免疫グロブリン折りたたみ構造をサブユニット構造中に含む多量体タンパク質の新規調製方法を提供することを課題とする。
すなわち、本発明により、免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質と、サブユニット構造となりうるタンパク質とを融合させた単量体タンパク質からなる多量体タンパク質の調製方法であって、
(A)免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質に、サブユニット構造となり得る別のタンパク質を融合させた単量体タンパク質であって、微生物の菌体内に不溶性の顆粒の形態であるタンパク質を準備する工程、
(B)ラウロイルグルタミン酸又はその塩を含む水溶液により、工程(A)で準備した単量体タンパク質を可溶化する工程、
(C)工程(B)で得られた溶液を、アルギニン又はアルギニン誘導体を含む緩衝液中で希釈し、ラウロイルグルタミン酸又はその塩の濃度を下げる工程、及び
(D)工程(C)において得られた溶液の溶媒を、
(d1)ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びこれらの組合せからなる群から選ばれるカラムクロマトグラフィー;
(d2)限外ろ過法;
(d3)透析法;及び
(d4)(d1)〜(d3)の二以上の組合せ;
からなる群から選ばれる方法を用いて緩衝液に置換する工程、
を含む、前記調製方法を提供する。
本発明によれば、性質の大きく異なる二種以上のタンパク質を融合させたタンパク質であっても、効果的に多量体構造を形成させることが可能となる。
本発明の方法によれば、サブユニット構造となり得るタンパク質が、多量体タンパク質を形成せずに凝集して沈殿してしまうのを抑制できる。
本明細書において、「免疫グロブリン折りたたみ構造」とは、ジスルフィド結合で結ばれた二つのβ構造平面により構成される安定なドメイン構造のことであり、その表面に提示されるループ構造によって、特定の分子に強く結合する親和性分子となり得る。イムノグロブリンフォールド(immunoglobulin fold)とも呼ばれる。分子細胞生物学、第3版、1227ページ、東京化学同人、1997年。
本明細書において、「サブユニット構造」とは、非共有結合によって集合することで安定な多量体構造のタンパク質を形成する、その一つの構造単位のことである。分子細胞生物学、第3版、51ページ、東京化学同人、1997年。
本明細書において、「多量体構造(multimeric protein)」とは、その構成成分であるサブユニット構造が非共有結合を介して集合して形成される高次の階層構造であり、しばしば、サブユニット構造の配置は、規則的、対称的である。分子細胞生物学、第3版、51ページ、東京化学同人、1997年。多量体構造を有するタンパク質を多量体タンパク質という場合がある。また、多量体構造を形成する構成成分を単量体タンパク質ということがある。
本発明における多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質は、免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質に、サブユニット構造となり得る別のタンパク質を融合させたものである。この別のタンパク質が有する自己集合性・自己結合性の性質によって多量体構造を形成させることが可能となり、標的抗原への親和性部位を複数持つ多量体構造の多価融合タンパク質を調製することができる。
免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質としては、抗ニワトリリゾチーム抗体(例えば、HyHEL-10、D1.3)、抗TNFα抗体(infliximab、adalimumab、golimumab)、抗HER2抗体(trastuzumab)、抗CD20抗体(rituximab)、抗VEGF抗体(bevacizumab)、抗EGFR抗体(cetuximab、panitumumab)等があげられる。
サブユニット構造となり得る別のタンパク質としては、ストレプトアビジン、ヒトp53由来の四量体化αへリックス構造、ロイシンジッパー構造、又はこれらの機能性断片等があげられる。なお、本明細書において、機能性断片とは、サブユニット構造となり得るタンパク質断片をいい、例えば、コア配列型ストレプトアビジンがあげられる。
本発明で用いる単量体タンパク質としては、具体的には、scFvとストレプトアビジンとの融合タンパク質等があげられる。より具体的には、HyHEL-10 scFvとストレプトアビジンとの融合タンパク質、D1.3 scFvとストレプトアビジンとの融合タンパク質又はHyHEL-10 scFvとコア配列型ストレプトアビジンとの融合タンパク質等があげられる。
本発明で用いる単量体タンパク質は、微生物の菌体内に不溶性の顆粒の形態である。以降、単に「単量体多量体タンパク質」と称した場合、免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質に、サブユニット構造となり得る別のタンパク質を融合させたタンパク質であって、微生物の菌体内に不溶性の顆粒の形態のものを意図する場合もある。
本発明で用いる単量体タンパク質は、当業界で公知の方法、例えば、Ueda et al, Gene. 1993, 129,129-34. Lin, Y. et al, Cancer Res. 2006, 66, 3884-3892.や、Fischmann, T.O. et al, J. Biol. Chem. 1991, 266, 12915-12920. Lin, Y. et al, Cancer Res. 2006, 66, 3884-3892.に記載の方法により、目的の単量体タンパク質の生産系を構築し、次いで定法により培養し、集菌することにより製造することができる。
■ 界面活性剤の種類
本発明において、単量体タンパク質の可溶化に用いる界面活性剤は、ラウロイルグルタミン酸(ラウロイル-Glu)又はその塩である。ラウロイル-Gluは、D体、L体、DL体のいずれであっても良い。ラウロイル-L-Gluが好ましい。
■ 界面活性剤の濃度
ラウロイル-Glu又はその塩は、好ましくは1〜10%、より好ましくは1〜8%の水溶液とする。このような濃度範囲であれば、単量体タンパク質の可溶化効率を十分に高めると共に、その次の操作である希釈の倍率を適度にとどめることができる。
■ pH
該水溶液の25℃におけるpHは、単量体タンパク質の性質に合わせ、好ましくはpH 6.5〜9.0、より好ましくはpH 7.0〜8.8の緩和な条件を選択できる。なお、本発明において、pHは、pH電極を装着したpHメーターにより測定できる。pH調整は、水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて行うことができる。該水溶液として緩衝液を使用してもよい。
斯様にして調製したラウロイル-Glu水溶液により、単量体タンパク質を可溶化させた溶液を得る。ラウロイル-Glu水溶液に単量体タンパク質を添加してもよいし、単量体タンパク質にラウロイル-Glu水溶液を添加してもよい。
その後、通常5〜40℃において、好ましくは15 〜40 ℃において放置してもよい。このような範囲であれば化学反応による単量体タンパク質の切断や酸化などの修飾が最小限に抑制されるので好ましい。
放置時間は通常10分〜3時間、好ましくは10分〜1時間である。このような範囲であれば、化学反応による単量体タンパク質の切断や酸化などの修飾が最小限に抑制されるので好ましい。接触中に攪拌してもよい。
タンパク質が可溶化されたかどうかは、例えば目視による濁度判定、あるいは280 nmなどでの紫外線吸収スペクトル法などにより確認することができる。
■ 希釈倍率
続いて、工程(B)で得られた単量体タンパク質を可溶化させた溶液を、添加剤としてアルギニン又はアルギニン誘導体を含む緩衝液に数10倍〜150倍程度の希釈倍率で希釈し、単量体タンパク質が天然状態の高次構造を回復するまで、そのまま維持する。希釈後のラウロイル-Gluの濃度を、好ましくは0.01〜0.5%、更に好ましくは0.02〜0.3%となるようにする。希釈は、1段、多段(ステップ勾配)又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。
このような範囲であれば、天然状態の高次構造回復が促進され、単量体タンパク質の安定性も確保されるので好ましい。単量体タンパク質が天然状態の高次構造を回復したかどうかは、CDスペクトルや蛍光スペクトルなどの分光測定、あるいはHPLCなどタンパク質の物理化学的特性を観察する方法、あるいは酵素活性等の高次構造指標により確認することができる。
添加剤として用いるアルギニンはL型でもD型でも良い。塩酸塩等の無機酸との塩、あるいは酢酸塩などの有機酸との塩を形成していてもよい。
アルギニン誘導体としては、アセチルアルギニン、N-ブチロイルアルギニン等の炭素数1〜6のアシル基を有するアルギニン;カルボキシル基を除去したアグマチン;αアミノ基の替わりに水酸基を導入したアルギニン酸等があげられる。アルギニン誘導体としては、アシル化アルギニンが好ましく、N-ブチロイルアルギニンがより好ましい。
添加剤としてはアルギニン塩酸塩が最も好ましい。
緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス塩酸塩等を用いることができる。pHは、天然状態を回復するタンパク質の性質に合ったpHであればよく、概ねpH 6.5〜9.0に収まる中性pHである。従って、工程(C)におけるpHはこの範囲にあればよく、工程(B)におけるpHと異なっていてもよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる。
添加剤濃度は、天然状態を回復するタンパク質の性質に応じて個別に選択されるが、希釈後の添加剤濃度が、好ましくは0.1〜1.5M、更に好ましくは0.2〜1.2Mとなるように調節する。このような範囲であれば、天然状態の高次構造回復が促進されるので好ましい。
希釈は、室温下で実施してもよく、目的タンパク質が天然状態を回復した際の熱安定性が十分に高くない場合は5〜10℃で実施してもよい。温度調節は、1段、多段(ステップ勾配)又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。
希釈後、数時間から数日間保持してもよい。好ましくは1時間〜5日間、より好ましくは1.5時間〜3日間、更に好ましくは2時間〜24時間保持するのが望ましい。漸次的に希釈してもよい。
工程(C)において得られた溶液の溶媒を、緩衝液と置換する。これにより、系からラウロイル-Gluが除かれる。
緩衝液による置換は、
(d1)ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びこれらの組合せからなる群から選ばれるカラムクロマトグラフィー;
(d2)限外ろ過法;
(d3)透析法;及び
(d4)(d1)〜(d3)の二以上の組合せ;
からなる群から選ばれる方法を用いて行う。このうち、(d1)のカラムクロマトグラフィーが好ましく、ゲルろ過クロマトグラフィーがより好ましい。
これらの操作方法は、当業界で用いられている慣用の方法であり、操作条件は、当業者であれば適宜選択・決定することができる。
緩衝液には、アルギニン又はアルギニン誘導体を含ませてもよいし、NaCl等の無機塩やEDTA等のキレート剤を含ませてもよい。その場合の濃度は、例えば0.001〜1.2Mである。
緩衝液のpHは、6〜9であるのが好ましい。
タンパク質によっては、アルギニン又はアルギニン誘導体緩衝液で希釈する前に、リン酸緩衝溶液等を添加し、放置してもよい。具体的には、前記工程(B)と工程(C)との間に、界面活性剤の濃度が2〜5%になるようにリン酸緩衝液を添加し、その後、好ましくは5〜40℃で、好ましくは10分〜1時間放置することで、単量体タンパク質の抽出率を高め、溶解度を更に上げることができる。その結果タンパク質の高次構造の回復率を更に高めることができる。このとき得られた溶液の25℃におけるpHは、pH 6.5〜9.0の範囲にあればよい。
タンパク質によっては、単一の分子内にジスルフィド結合を有することがある。タンパク質に酸化還元反応をさせてこれらジスルフィド結合の形成を促進すると、リフォールディング率がより向上するので好ましい。
酸化還元反応は、チオール・ジスルフィド交換反応を促進して、分子内や分子間のジスルフィド結合を形成させるための酸化還元物質(例えば、酸化型グルタチオン(GSSG)と還元型グルタチオン(GSH)との混合物、又はシスチンとシステインの混合物、又はシスタミンとシステアミンの混合物、又は酸化型グルタチオンあるいはシスチンとメルカプトエタノールの混合物、など))や、空気酸化を促進するための銅イオンを共存させることにより行うことができるし、タンパク質の酸化還元電位を変化させることにより行うこともできる。酸化還元物質を使用するのが好ましい。
酸化還元反応は、前記工程(B)以降であればいつ行っても良く、例えば前記工程(C)において酸化還元物質を添加剤と共に、工程(A)で得られた溶液に添加することにより行っても良いし、前記工程(C)において希釈液を得た後に該希釈液に酸化還元物質を添加することにより行っても良い。
酸化還元物質や銅イオンの濃度は、天然状態を回復するタンパク質ごとに適正な濃度に調整される。
このときの25℃におけるpHは、pH 6.5〜9.0の範囲にあればよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる。
液温は、工程(B)で得られる溶液の温度と同程度でもよいし、工程(C)で得られる溶液の温度と同程度でもよい。酸化還元反応を促進させるには、5〜48℃程度が好ましい。
酸化還元反応後、5〜48℃で1時間〜5日間(120時間)程度放置してもよい。
〔任意工程(iii):精製〕
高次構造を回復したタンパク質は、通常の方法、例えば限外ろ過、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等によって精製することができる。
多量体タンパク質は、非共有結合で会合したいくつかのサブユニットを持つが、多量体タンパク質を、所定のアシルグルタミン酸界面活性剤(ラウロイル-L-Glu)を用いて所定pH下で可溶化しても、その後にアルギニン緩衝液で希釈するだけではリフォールディングを完了することができなかった。如何なる理論にも拘束されるものではないが、ラウロイル-L-Gluによって、サブユニット間の会合が抑制されたものと推測される。
本発明は、それを逆手にとったもので、如何なる理論にも拘束されるものではないが、本発明は、ラウロイル-L-Gluでサブユニット間の会合を抑制することにより、先にサブユニットの構造形成だけを進め、その後、会合を抑制する因子となっていると思われるラウロイル-L-Gluを緩衝液で置換することで除去し、その結果、サブユニット同士の会合を起こさせ、リフォールディングを完了させるものと推測される。
HyHEL-10 scFv SA full lengthの不溶性顆粒を含む沈殿物の調製
大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした、単鎖抗体可変領域(HyHEL-10 scFv)と全長型ストレプトアビジン(SA full length)との融合蛋白質(HyHEL-10 scFv SA full length)の生産系を構築した(Ueda et al, Gene. 1993, 129,129-34. Lin, Y. et al, Cancer Res. 2006, 66, 3884-3892.)。
構築した生産菌を、常法に従って、バッフル付き三角フラスコを用い、2×YT培地中で、28℃において18時間振とう培養し(4L)、HyHEL-10 scFv SA full lengthを、大腸菌の菌体内に不溶性顆粒として蓄積させた。その菌体を集め、20mMトリス塩酸塩、0.5M NaCl、pH 8.1に懸濁し、超音波破砕した。得られた懸濁液を、6000g、30分間の条件において遠心分離にかけ、HyHEL-10 scFv SA full length不溶性顆粒を含む沈殿物を回収した。
回収した沈殿物を、2% Triton X-100水溶液、アセトンで順次洗浄した。その後、精製水(ミリQ水)で洗浄してTriton X-100を完全に除去した。再び上記条件において遠心分離操作を行い、不溶性顆粒を含む沈殿物を得た。
得られた沈殿物を、100mgずつ、4本のエッペンドルフチューブに小分けした。各チューブを、チューブ1〜4と称する。
なお、本明細書において、特に記載の無い限り、単位「%」は「質量%」を意味する。
D1.3 scFv SA full lengthの不溶性顆粒を含む沈殿物の調製
参考例1において、単鎖抗体可変領域として、HyHEL-10 scFvに代えてD1.3 scFvを使用して、全長型ストレプトアビジン(SA full length)との融合蛋白質(D1.3 scFv SA full length)の生産系を構築した(Fischmann, T.O. et al, J. Biol. Chem. 1991, 266, 12915-12920. Lin, Y. et al, Cancer Res. 2006, 66, 3884-3892.)こと以外は参考例1と同様にして、D1.3 scFv SA full lengthの不溶性顆粒を含む沈殿物を得た。
(1)5%ラウロイル-L-Glu溶液(20mM リン酸ナトリウム、pH 8.5)を調製した。
(2)この溶液を、チューブ1に0.2ml、チューブ2に0.25ml、チューブ3に0.3ml、チューブ4に0.35ml加え、チューブ中の沈殿物を可溶化した。チューブ1〜4を室温でボルテックス後、軽く遠心分離して(10000rpm,1分)、生じた泡を消した。
(3)各チューブに、20mMリン酸ナトリウム(pH 7)を加えて0.5mlにメスアップし、チューブ1〜4の最終的なラウロイル-L-Glu濃度を、それぞれ2.0%、2.5%、3.0%、3.5%に調整した。微小pH電極を用いてチューブ内のpHを7.3付近に調整後、37℃において30分間加温し、沈殿物から不溶性顆粒を抽出し、溶解させた。なお、本明細書において、特に記載の無い限り、pHは25℃において測定した。
(4)得られた各溶液を、別のエッペンドルフチューブに移し、14000rpm(18700 x g)で10分間遠心分離し、上清1〜4を回収した。
(5)希釈用溶液として、0.404 M アルギニン塩酸塩溶液(1 mM EDTA、80 mMトリス塩酸塩、pH7.2)を調製した。
(6)この希釈用溶液 7.425mlを用いて、上で回収した上清1〜4 各0.075 mlを5 ℃において希釈し、最終的に、0.1%ラウロイル-L-Glu、0.4 M アルギニン塩酸塩(1 mM EDTA、80 mMトリス塩酸塩、pH 7.2、7.5 ml)にそれぞれ調整した。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(7)希釈した上清1〜4を5℃において18時間保持後、遠心分離型の限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、分子量分画 10 kDa;ミリポア製)で3倍濃縮して2.5 mlに調整した。
(8)3倍濃縮液各2.5 mlを、緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 7.2)であらかじめ平衡化しておいたゲルろ過用カラム(PD-10カラム、GEヘルスケア製)に負荷し、次いで、同じ緩衝液の3.0 mlで展開し、濃縮液の全量を回収した。これにより、カラム内の濃縮液を緩衝液で置換した。
(9)これらを5℃において18時間保持後、14000 rpm(18700 x g)で10分間遠心分離した。その上清30μLを、ゲルろ過HPLC(カラム、Superdex 200 10/300 GL、GEヘルスケア製;展開液、0.1 Mリン酸ナトリウム、0.8 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8;検出法、225 nmにおける紫外吸収;定量用標品、精製抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体(WO96/17078))に供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。結果を表1に示す。
(1)2%のラウロイル-L-Glu溶液(20mM リン酸ナトリウム、pH 8.5)を調製した。
(2)(1)で得られた溶液を用い、実験1と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgに加え、該沈殿物を可溶化した。
(3)アルギニン塩酸塩を含有する希釈用溶液を調製した。
(4)(2)で得られた溶液を、(3)で調製した希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に0.02 %ラウロイル-L-Glu、0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、80 mMトリス塩酸塩、1 mM還元型グルタチオン、1 mM酸化型グルタチオン、pH 8.0の30 mlに調整した。タンパク質濃度は0.02 mg/mlに調整した。
(5)(4)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮して10mlに調整した。
(6)(5)で得られた3倍濃縮液の40μlを、14000 rpm(18700 x g)で10 分間遠心分離し、得られた上清の10 μlを実験1と同様にゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(7)別途、(5)で得られた3倍濃縮液の2.5 mlを、緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.2 Mアルギニン塩酸塩、1 mM EDTA、pH 6.6)であらかじめ平衡化しておいたPD-10カラムに負荷し、次いで、同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(8)(7)の回収物を、実験1と同様にして、保持及び遠心分離後、その上清の12 μlを同様にゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。結果を表2に示す。
(1)実験1と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)この溶液の0.15 mlずつを、実験1と同様に希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に、pH 7.2及びpH 8.4にそれぞれ調整した(0.05 %ラウロイル-L-Glu、0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、80 mMトリス塩酸塩、15 ml)。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(3)(2)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮してそれぞれ5 mlに調整した。
(4)このうち2.5 mlずつを、実験1と同じ緩衝液を用いてPD-10カラムに負荷し、次いで、同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(5)これを実験1と同様に、保持及び遠心分離後、ゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(1)実験1と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)種々の濃度のアルギニン塩酸塩を含む希釈用溶液を調製した。
(3)(1)で得られた溶液を0.075 mlずつ分取し、(2)で調製した希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に、ラウロイル-L-Glu濃度を0.02%、0.05%、0.07%、0.1%、0.2%又は0.3%にした(0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、pH 7.2、7.5 ml)。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(4)(3)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮してそれぞれ2.5 mlに調整した。
(5)(4)で得られた3倍濃縮液の2.5 mlを、実験1と同じ緩衝液を用いてPD-10カラムに負荷し、次いで、同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(6)これを実験1と同様に、保持及び遠心分離後、ゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(1)実験1と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)種々の濃度のアルギニン塩酸塩を含む希釈用溶液を調製した。
(3)(1)で得られた溶液を0.075 mlずつ分取し、(2)で調製した希釈用溶液で100倍希釈して、最終的にアルギニン塩酸塩濃度を0.4M、0.8M、1.0M、1.2Mにした(0.025%ラウロイル-L-Glu、1 mM EDTA 、80 mMトリス塩酸塩、pH 7.2、7.5 ml)。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(4)(3)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮してそれぞれ2.5 mlに調整した。
(5)(4)で得られた3倍濃縮液各2.5 mlを、実験1と同じ緩衝液を用いてPD-10カラムに負荷し、次いで、同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(6)これを実験1と同様に、保持及び遠心分離後、ゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(1)実験1と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)還元型グルタチオン濃度及び酸化型グルタチオン濃度を種々変化させたアルギニン塩酸塩を含む希釈用溶液を調製した。
(3)(1)で得られた溶液を0.075 mlずつ分取し、それぞれ(2)で調製した希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に、還元型グルタチオン濃度、酸化型グルタチオン濃度を、無添加から5 mMまで変化させた(0.05 %ラウロイル-L-Glu、1.2 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、80 mMトリス塩酸塩、pH 8.4、7.5 ml)。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(4)(3)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮してそれぞれ2.5 mlに調整した。
(5)(4)で得られた3倍濃縮液の2.5 mlを、緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.4 Mアルギニン塩酸塩、1 mM EDTA、pH 8.0)であらかじめ平衡化しておいたPD-10カラムに負荷し、次いで、同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(6)これを実験1と同様に、保持及び遠心分離後、ゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(1)実験2と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)アルギニン塩酸塩を含有する希釈用溶液を調製した。
(3)(1)で得られた溶液を0.3 mlずつ分取し、それぞれ上記希釈用溶液で希釈し、最終的に0.02 %ラウロイル-L-Glu、0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、1 mM還元型グルタチオン、1 mM酸化型グルタチオン、80 mMトリス塩酸塩、pH 8.0の30 mlに調整した。タンパク質濃度は0.02 mg/mlに調整した。
(4)(3)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮して10 mlに調整した。
(5)50 mMトリス塩酸塩及び1 mM EDTAに加え、0.2 M NaCl又はアルギニン塩酸塩を含有し、pH 6.6又はpH 7.6である合計4種類の緩衝液を調製した。
(6)(4)で得られた3倍濃縮液2.5 mlずつを、上記緩衝液であらかじめ平衡化しておいたPD-10カラムに負荷し、次いで、それぞれ同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(7)これを実験1と同様に、保持及び遠心分離後、ゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(1)実験2と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)アルギニン塩酸塩を含有する希釈用溶液を調製した。。
(3)(1)で得られた溶液の0.45 mlを、上記希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に0.02 %ラウロイル-L-Glu、0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、80 mMトリス塩酸塩、pH 8.0、45 mlに調整した。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(4)(3)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮して15 mlに調整した。
(5)緩衝液として、pH 6.5、pH 7.2、pH 8.4の合計3種類を調製した。但し、pH 6.5の緩衝液は、0.2 Mアルギニン塩酸塩、1 mM EDTA及び25 mMリン酸ナトリウムを含む。pH 7.2及びpH8.4の緩衝液は、25 mMリン酸ナトリウムに代えて50 mMトリス塩酸塩を含む。
(6)(4)で得られた3倍濃縮液2.5 mlずつを、上記緩衝液であらかじめ平衡化しておいたPD-10カラムに負荷し、次いで、それぞれ同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(7)これを実験1と同様に、保持及び遠心分離後、ゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(1)実験2と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)アルギニン塩酸塩を含有する希釈用溶液を調製した。。
(3)(1)で得られた溶液の0.45 mlを、上記希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に0.02 %ラウロイル-L-Glu、0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、1 mM還元型グルタチオン、1 mM酸化型グルタチオン、80 mMトリス塩酸塩、pH 8.0、45 mlに調整した。タンパク質濃度は0.02 mg/mlに調整した。
(4)(3)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮して15 mlに調整した。
(5)緩衝液として、アルギニン塩酸塩濃度を0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.8 Mまで変化させた合計6種類を調製した。但し、いずれの緩衝液も、25 mM リン酸ナトリウム、1 mM EDTA、pH 6.6である。
(6)(4)で得られた3倍濃縮液2.5 mlずつを、上記緩衝液であらかじめ平衡化しておいたPD-10カラムに負荷し、次いで、それぞれ同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(7)これを5 ℃で18時間保持後、遠心分離型の限外ろ過膜(アミコンウルトラ4、分画分子量 10 kDa)でそれぞれ5倍濃縮して0.6mlに調整した。
(8)このうち0.5 mlを緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0)であらかじめ平衡化しておいたPD MiniTrap G-25(GEヘルスケア製)に負荷し、同じ緩衝液の0.9 mlで展開して全量を回収した。
(9)更に、(8)で使用したのと同じ緩衝液であらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP;GEヘルスケア製)に負荷し、カラム素通り画分の全量を回収した。このようにして凝集体を除去した。
(10)素通り画分を限外ろ過膜(アミコンウルトラ4、分画分子量 10 kDa)で0.5 mlに濃縮し、14000 rpm(18700 x g)で10 分間遠心分離後、その上清の30 μlをゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
(1)実験2と同様にして、参考例1で得られた沈殿物100mgを可溶化した。
(2)アルギニン塩酸塩を含有する希釈用溶液を調製した。
(3)(1)で得られた溶液の3.8 mlを、上記希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に0.02 %ラウロイル-L-Glu、0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、1 mM還元型グルタチオン、1 mM酸化型グルタチオン、80 mMトリス塩酸塩、pH 8.0の380 mlに調整した。タンパク質濃度は0.02 mg/mlに調整した。
(4)(3)で得られた溶液を5 ℃で18時間保持後、限外ろ過膜(ペリコン3、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で75 mlに濃縮した。
(5)これを、緩衝液(25 mMリン酸ナトリウム、0.1 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA、pH 6.6)であらかじめ平衡化しておいたセファデックスG-25カラム(5 cmφ x 6.5 cm;GEヘルスケア製)に、25 mlずつ3回に分けて負荷し、次いで、同緩衝液で展開し、280 nmの紫外吸収を指標にタンパク質画分を得た。
(6)得られたタンパク質画分、合計105 mlを5 ℃で18時間保持後、限外ろ過膜(ペリコンXL、再生セルロース膜、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で36 mlまで、約3倍濃縮した。
(7)これを、緩衝液(50 mM トリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0)であらかじめ平衡化しておいたスーパーデックス200 pg 26/60(2.6 cmφ x 60 cm;GEヘルスケア製)に、12 mlずつ3回に分けて負荷し、280 nmの紫外吸収を指標にHyHEL-10 scFv SA full length画分を回収した。
(8)画分を合一後、ゲルろ過HPLCによる定量で920 μgのHyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質を確認した。この画分を限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、分画分子量 30 kDa)で10 mlに濃縮した。
(9)ここに含まれる凝集体を除去するため、(7)で使用したのと同じ緩衝液であらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換カラム(HiTrap CaptoQ、5 ml;GEヘルスケア製)に負荷し、凝集体の除かれたカラム素通り画分の全量を回収した。ゲルろ過HPLCによる定量で450 μgのHyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質を確認した。
(10)2.5 mlに濃縮後、緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0)であらかじめ平衡化しておいたスーパーデックス200 pg 16/60(1.6 cmφ x 60 cm;GEヘルスケア製)に全量を負荷し、280 nmの紫外吸収を指標にHyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質を回収した。ゲルろ過HPLCによる定量で150 μgのHyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質を確認した。
(11)精製されたHyHEL-10 scFv SA full length 多量体タンパク質は、還元SDSゲル電気泳動で45 kDa付近に単一バンドを示し(図1)、ゲルろ過HPLCで分子量230 kDaの単一ピークを示したことから、想定通り、4量体を形成したことがわかった(図2)。
(12)精製されたHyHEL-10 scFv SA full lengthの卵白リゾチーム阻害活性を、既報(Ueda et al, Gene. 1993, 129,129-34.)に基づいて調べた。
測定用の緩衝液には50 mMリン酸溶液(pH 6.2)200 mM NaClを用いた。ニワトリ卵白リゾチーム(生化学工業株式会社Code No.100940)を最終濃度1.5 μMに調整し、HyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質とリゾチームとの相対濃度が[HyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質]/[リゾチーム] = 0〜2.0となるように混合溶液を作製した。これを28 ℃で1時間加温した後、この30μl を、540 nmでの吸光度が1.0となるように調整した微生物懸濁液(Micrococcus lysodeiktius ATCC No.4698;M3770-5G、シグマアルドリッチ製)の970μlと混合し、直ちに測定波長540 nmで吸光度変化を5分間測定した。
HyHEL-10 scFv SA full lengthの添加量を増すと、ニワトリ卵白リゾチームによる微生物の溶菌活性が顕著に抑制され、精製されたHyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質がリゾチーム阻害活性を有することがわかった。
(1)参考例2で得られたD1.3 scFv SA full length不溶性顆粒を含む沈殿物570 mgを、実験1と同様の可溶化処理に供し、最終的に2 %のラウロイル-L-Glu溶液、1.8 mlを得た。
(2)この溶液を希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に0.02 %ラウロイル-L-Glu、0.8 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、1 mM還元型グルタチオン、1 mM酸化型グルタチオン、80 mMトリス塩酸塩、pH 8.0の180 mlに調整した。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(3)5 ℃で18時間保持後、限外ろ過膜(ペリコン3、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で50 mlに濃縮した。
(4)これを、緩衝液(25 mMリン酸ナトリウム、0.2 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA、pH 6.6)であらかじめ平衡化しておいたセファデックスG-25カラム(5 cmφ x 6.5 cm;GEヘルスケア製)に25 mlずつ2回に分けて負荷し、次いで、同緩衝液で展開し、280 nmの紫外吸収を指標にタンパク質画分を得た。
(5)得られたタンパク質画分、合計70 mlを5 ℃で18時間保持後、限外ろ過膜(ペリコンXL、再生セルロース膜、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で24 mlまで、約3倍に濃縮した。
(6)これを、緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0)であらかじめ平衡化しておいたスーパーデックス200 pg 26/60(2.6 cmφ x 60 cm;GEヘルスケア製)に12 mlずつ2回に分けて負荷し、280 nmの紫外吸収を指標にD1.3 scFv SA full length画分を回収した。
(7)この画分を限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、分画分子量 30 kDa)で6 mlに濃縮した。(6)で用いたのと同じ緩衝液であらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換カラム(HiTrap Capto Q、5 ml;GEヘルスケア製)に負荷し、凝集体の除かれたカラム素通り画分の全量を回収した。ゲルろ過HPLCによる定量で220 μgのD1.3 scFv SA full length多量体タンパク質を確認した。
(8)2.0 mlに濃縮後、緩衝液(50 mM トリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0)であらかじめ平衡化しておいたスーパーデックス200 pg 16/60(1.6 cmφ x 60 cm;GEヘルスケア製)に全量を負荷し、280 nmの紫外吸収を指標にD1.3 scFv SA full length多量体タンパク質を回収した。ゲルろ過HPLCによる定量で64 μgの精製D1.3 scFv SA full lengthを確認した。
(9)精製D1.3 scFv SA full length多量体タンパク質は、還元SDSゲル電気泳動で45 kDa付近に単一バンドを示し(図3)、ゲルろ過HPLCで200 kDaの単一ピークを示したことから、想定通り、4量体を形成したとわかった(図4)。
(10)実験10と同様の酵素阻害評価に、(8)で得られた精製D1.3 scFv SA full length多量体タンパク質を供した結果、前記多量体タンパク質が卵白リゾチーム阻害活性を有することがわかった。
(1)8M塩酸グアニジン、20mM リン酸ナトリウム、pH 8.5の溶液を調製した。
(2)参考例1で得られた不溶性顆粒を含む沈殿物100 mgに、上記溶液0.375 mlを加え、沈殿物を可溶化した。室温でボルテックス後、軽く遠心分離して生じた泡を切った。
(3)そこに、20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.5を微量添加し、0.5 mlに調整した。37 ℃で30分間加温し、ボルテックスに供し、不溶性顆粒が十分に溶解したことを確認した。
(4)その溶液を14000 rpm(18700 x g)で10分間遠心分離し、0.25 mlの上清を回収した。
(5)この上清0.05 mlを希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に6 M 塩酸グアニジン、0.2 M NaCl、50 mM トリス塩酸塩、1 mM EDTA 、pH 8.0の5 mlに調整した。タンパク質濃度は0.02 mg/mlに調整した。
(6)これを段階透析法(Tsumoto et al, Journal of Immunological Methods, 219, 119-129 (1998))により透析した。具体的には、表10に示す透析番号1〜5の透析外液1000 mlに対して5 ℃で所定時間透析し、最終的に5.5 mlの透析内液を回収した。回収した透析内液を14000 rpm(18700 x g)で10 分間遠心分離後、その上清の30 μlをゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。その結果、HyHEL-10 scFv SA full多量体タンパク質のピークを確認できなかった(図示せず)。
(1)8M塩酸グアニジン、20mM リン酸ナトリウム、pH 8.5の溶液を調製した。
(2)参考例1で得られた不溶性顆粒を含む沈殿物100 mgに、上記溶液0.375 mlを加え、沈殿物を可溶化した。それを室温でボルテックス後、軽く遠心分離して生じた泡を切った。
(3)そこに、20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.5を微量添加し、0.5 mlに調整した。37 ℃で30分間加温し、ボルテックスに供し、不溶性顆粒が十分に溶解したことを確認した。
(4)その溶液を14000 rpm(18700 x g)で10分間遠心分離し、0.32 mlの上清を回収した。
(5)希釈用溶液として、ラウロイル-L-Gluを無添加又は添加、還元型および酸化型グルタチオンを無添加又は添加した、合計4種類の希釈用溶液を調製した。但し、いずれの希釈用溶液も、0.06 M 塩酸グアニジン、0.2 Mアルギニン塩酸塩、80 mM トリス塩酸塩、1 mM EDTA 、pH 7.2とした。
(6)(4)で得られた上清0.075 mlずつを、各希釈用溶液で100倍希釈して、最終的に0.06 M 塩酸グアニジン、0.2 Mアルギニン塩酸塩、80 mM トリス塩酸塩、1 mM EDTA 、pH 7.2、各7.5 mlに調製した。但し、最終的に、ラウロイル-L-Glu濃度が0%又は0.05 %、還元型および酸化型グルタチオン濃度が0mM又は1mMの合計4種類になるように調整した。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。
(7)(6)で得られた溶液を、実験1と同様に、保持後、遠心分離型限外ろ過膜で3倍濃縮してそれぞれ2.5 mlに調整した。
(8)これらを、緩衝液(50 mM トリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 7.2)であらかじめ平衡化しておいたPD-10カラムに負荷し、次いで、同じ緩衝液の3.0 mlで展開して濃縮液の全量を回収した。
(9)これを5 ℃で18時間保持後、14000 rpm(18700 x g)で10 分間遠心分離し、その上清の30 μlを同様にゲルろ過HPLCに供して、4量体構造を形成したHyHEL-10 scFv SA full lengthを定量した。
その結果、ラウロイル-L-Gluに代えてタンパク質変性剤(塩酸グアニジン)を用いて不溶性顆粒を可溶化した場合、HyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質のピークを全く確認できなかった(図示せず)。希釈用溶液にラウロイル-L-Glu又はグルタチオンを添加しても、HyHEL-10 scFv SA full length多量体タンパク質の回収率を高めることはできなかった(図示せず)。
HyHEL-10 scFv SAcoreの不溶性顆粒を含む沈殿物の調製
参考例1と同様に、大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした、単鎖抗体可変領域(HyHEL-10 scFv)と天然に存在する野生型コア配列ストレプトアビジン(natural core Streptavidin)との融合蛋白質(HyHEL-10 scFv SAcore)の生産系を構築した。natural core Streptavidinのアミノ酸配列は、既報(Takeshi Sano, et al. The journal of biological chemistry 270, 47, 28204-28209 (1995)に従った。
構築した生産菌を、常法に従って培養フラスコを用い、LB培地中で37 ℃において振とう培養した。数時間培養後660nmの吸光度が約0.8であることを確認し、IPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)1mMとなるように添加後、さらに4〜5時間培養し、HyHEL-10 scFv SAcoreを大腸菌の菌体内に不溶性顆粒として蓄積させた。
250ml分の培養液より菌体を回収し、20 mlの20 mMトリス塩酸塩、30 mM NaCl、5 mM EDTA、pH 7.5に懸濁後、氷冷下で60 W、3分間の超音波破砕に供した。得られた菌体破砕液を、5 ℃下、4400 g、10分間の遠心分離に供し、得られた沈殿物を20 mlの20mMトリス塩酸塩、30 mM NaCl、5 mM EDTA、pH 7.5に再び懸濁した。5 ℃下、6500 g、10分間の遠心分離に供して沈殿物を得た。同様の操作を更に1回繰り返し、最終的に1.11 gのHyHEL-10 scFv SAcore不溶性顆粒を含む沈殿物を得た。
(1)実験2と同様にして、参考例3で得られたHyHEL-10 scFv SAcore沈殿物1.11 gを可溶化し、4.75 mlの可溶化液を得た。ただし、最終的に含まれるラウロイル-L-Glu濃度を2.5 %に調整した。
(2)アルギニン塩酸塩を含有する希釈用溶液を調製した。
(3)(1)で得られた可溶化液、4.75 mlのうちの2.9 mlを上記希釈用溶液で50倍希釈して、最終的に0.05 %ラウロイル-L-Glu、1.2 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、80 mMトリス塩酸塩、pH 7.6の145 mlに調整した。タンパク質濃度は0.05 mg/mlに調整した。HyHEL-10 scFv SAcoreの場合、分子内ジスルフィド結合形成がすでに進行していたため、グルタチオンなどの酸化還元物質によるジスルフィド結合形成促進反応は必要なかった。
(4)(3)で得られた溶液を5 ℃で18時間保持後、限外ろ過膜(ペリコン3、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で50 mlに濃縮した。
(5)これを、緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.2 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA、pH 7.8)であらかじめ平衡化しておいたセファデックスG-25カラム(5 cmφ x 6.5 cm;GEヘルスケア製)に、25 mlずつ2回に分けて負荷し、次いで、同緩衝液で展開し、280 nmの紫外吸収を指標にタンパク質画分を得た。これにより、カラム内の濃縮液を緩衝液で置換した。
(6)得られたタンパク質画分、合計68 mlを5 ℃で3日間保持後、限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、再生セルロース膜、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で15 mlまで、約3倍濃縮した。
(7)これを緩衝液(20 mM トリス塩酸塩、0.2 M NaCl、pH 8.0)で6倍希釈して90mlに調整し、同緩衝液であらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP、5 ml;GEヘルスケア製)に負荷し、凝集体の除かれたカラム素通り画分の全量、95 mlを回収し、5 ℃に1日保持した。この全量を限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、再生セルロース膜、分画分子量 30 kDa;ミリポア製)で10 mlまで濃縮し、ゲルろ過HPLCによる定量で1.2 mgのHyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質を確認した。これを5 ℃に2日間保持した。
(8)濃縮液、10 mlのうち、5 mlを緩衝液(20 mM トリス塩酸塩、pH 8.0)で10倍希釈し、50 mlに調整した。これを同緩衝液であらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP、5 ml;GEヘルスケア製)に負荷し、2.5 ml/minの流速で、溶出用緩衝液(20 mM トリス塩酸塩、0.5 M NaCl、pH 8.0)への20分間の直線濃度勾配溶出に供した。280 nmの紫外吸収を指標にタンパク質画分、6.5 mlを得た。
残りの濃縮液、5 mlを同様に処理し、タンパク質画分、7.8 mlを得た。2つのタンパク質画分を合一、限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、再生セルロース膜、分画分子量 30 kDa;ミリポア製)で2 mlまで濃縮し、ゲルろ過HPLCによる定量で0.76 mgのHyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質を確認した。これを5 ℃に2日間保持した。
(9)濃縮液、2 mlを緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0)であらかじめ平衡化しておいたスーパーデックス200 pg 16/60(2.6 cmφ x 60 cm;GEヘルスケア製)に負荷し、280 nmの紫外吸収を指標にHyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質を回収した。限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、再生セルロース膜、分画分子量 30 kDa;ミリポア製)で1 mlまで濃縮し、ゲルろ過HPLCによる定量で0.39 mgのHyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質を確認した。
可溶化液からの総回収率は5.3 %であった。
精製されたHyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質は、ゲルろ過HPLCで単分散性の高いことを意味するシャープなピークを与え(図5)、0.1 M リン酸ナトリウム、pH 6.8を展開溶媒に用いるフィールド・フロー・フラクショネーション/静的光散乱法で178 kDaの分子量を与えた(図6)。リソースQ、1 ml(GEヘルスケア製)を用いる陰イオン交換HPLCで1本のシャープなピークを示した(図7)。
以上より、想定通りの4量体構造を有するHyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質が得られたと結論した。
測定用の緩衝液(50 mMリン酸緩衝液、12 mM NaCl、pH 6.2)を用い、ニワトリ卵白リゾチーム(Code No. L-6876、シグマ・アルドリッチ製)の最終濃度を0.09 μMに、精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質の最終濃度を0.0056〜0.045 μMの7段階に調整した100 μlの混合溶液を作製し、28 ℃下で30分間、保持した。精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質は分子内に4個の抗リゾチーム抗体ドメイン(HyHEL-10 scFv)を有するため、これら混合溶液中のリゾチーム:HyHEL-10 scFv混合モル比は1:0.25〜1:2に相当する。
リゾチーム活性の陽性対照として、精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質を添加しない混合溶液を作製した。
各混合溶液の100 μlへ、540 nmでの吸光度が1.78となるように50 mM リン酸緩衝液、pH 6.2で調整した微生物懸濁液(Micrococcus lisodeikicus、ATCC4698、SIGMA M-3770、シグマ・アルドリッチ製)の100μlを加え、直ちに28 ℃下、5分ごとに1時間にわたり、測定波長540 nmで吸光度を測定した。各測定ポイントにおける吸光度減少率(傾き)をリゾチーム活性とし、精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質とニワトリリゾチームの混合モル比とリゾチーム活性阻害率との関係を調べた。
ニワトリリゾチーム:HyHEL-10 scFv混合モル比が1:1の場合、リゾチーム活性の50 %が阻害され、混合モル比が1:2の場合、リゾチーム活性はほぼ阻害された(図8)。
このことから、HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質1分子の有する4個のscFvのうち、2個のscFvがリゾチームに結合してその活性を阻害する能力を有することが示された。
緩衝液(50 mM TrisHCl、0.2 M NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0)を用い、精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質の最終濃度を1.24 μMに、ニワトリ卵白リゾチームの最終濃度を無添加、2.48 μM、4.95 μMの3段階に調整した混合溶液、600 μlを調製した。精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質は分子内に4個の抗リゾチーム抗体ドメイン(HyHEL-10 scFv)を有するため、これら混合溶液中のリゾチーム:HyHEL-10 scFv混合モル比は0:1、0.5:1、1:1にそれぞれ相当する。5 ℃下で24時間保持後、各混合溶液の70 μlをフィールド・フロー・フラクショネーションに供し、ピークの保持時間と静的光散乱法による分子量の変化を追跡した。
リゾチーム混合比が上昇するに従ってピーク保持時間は延長し、リゾチームの結合による分子サイズの増加を支持した。分子量は、それぞれ163.4 kDa、188.1kDa、225.0kDaと計算され、精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質1分子あたり、ニワトリ卵白リゾチームがそれぞれ0分子(リゾチーム無添加)、1.7分子、4.3分子結合したことを示した。
このことから、4価の結合能を有する精製HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質は、設計通り、1分子あたりに4分子のリゾチームを結合できると分かった。しかし、上記(10)の酵素活性阻害評価で示された通り、実際にリゾチーム活性を阻害されたものは、結合したリゾチーム分子の1/2に相当する2分子にとどまるとわかった。
(1)実験12に用いたものと同じ、HyHEL-10 scFv SAcore可溶化液の0.15 mlをアルギニン塩酸塩を含有する希釈用溶液で50倍希釈して、最終的に0.05 %ラウロイル-L-Glu、1.2 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA 、80 mMトリス塩酸塩、pH 7.6の7.5 mlに調整した。タンパク質濃度は0.03 mg/mlに調整した。
得られた溶液を5 ℃で18時間保持後、限外ろ過膜(アミコンウルトラ15、再生セルロース膜、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で2.5 mlに濃縮し、緩衝液(50 mMトリス塩酸塩、0.3 M アルギニン塩酸塩、1 mM EDTA、pH 7.8)であらかじめ平衡化しておいたPD-10カラム(GEヘルスケア製)に負荷し、3 mlの同緩衝液で展開して全量を回収した。これにより、カラム内の濃縮液を緩衝液で置換した。
得られたタンパク質画分を5 ℃で1日保持後、限外ろ過膜(アミコンウルトラ4、再生セルロース膜、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で1 mlまで3倍濃縮し、5 ℃で2日間保持した。これを緩衝液(20 mM トリス塩酸塩、0.2 M NaCl、pH 8.0)で6倍希釈して6 mlに調整し、同緩衝液であらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP、1 ml;GEヘルスケア製)に負荷し、凝集体の除かれたカラム素通り画分の全量、7 mlを回収した。
直ちに限外ろ過膜(アミコンウルトラ4、再生セルロース膜、分画分子量 10 kDa;ミリポア製)で1mlまで7倍濃縮し、ゲルろ過HPLCによる定量で0.038 mgのHyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質を確認した。可溶化液からの総回収率は17.0 %であった。
このSDS-PAGEでは、2 % SDSを含む希釈用緩衝液で各サンプルを0.03 μg/mlに希釈調整した後、すでに形成されていた4量体構造を解離させずに4量体バンドとして観察できるよう、サンプル前処理用の加熱条件を45 ℃、2分間に緩和した。この穏和な加熱条件でサンプル処理されたSDS-PAGE分析では、natural core Streptavidinの4量体構造が壊されることなく観察されることは、既報(Jody Schultz, Donald. Axworthy et al, Cancer Research 60, 6663-6669 (2000))などによって示されている。
図9に示したとおり、可溶化段階、アルギニン塩酸塩を含有する希釈用緩衝液による50倍希釈段階では、HyHEL-10 scFv SAcore多量体タンパク質のバンドは観察されなかった。ラウロイル-L-Gluの完全に除去された、アルギニン塩酸塩含有緩衝液への置換段階において初めて4量体構造の形成されたことがわかった(図中に←で示したバンド)。
このことは、ラウロイル-L-Gluでサブユニット間の会合を抑制することにより、先にサブユニットの構造形成だけを進め、その後、ラウロイル-L-Gluを緩衝液で置換することで除去し、サブユニット同士の会合促進とフォールディングの完了を達成するという、本発明の特性を具体的に示したものである。
Claims (6)
- 免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質と、サブユニット構造となりうるタンパク質又はその機能性断片を融合させた単量体タンパク質からなる多量体タンパク質の調製方法であって、
(A)免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質に、サブユニット構造となり得る別のタンパク質を融合させた単量体タンパク質であって、微生物の菌体内に不溶性の顆粒の形態であるタンパク質を準備する工程、
(B)ラウロイルグルタミン酸又はその塩を含む水溶液により、工程(A)で準備した単量体タンパク質を可溶化する工程、
(C)工程(B)で得られた溶液を、アルギニン又はアルギニン誘導体を含む緩衝液中で希釈し、ラウロイルグルタミン酸又はその塩の濃度を下げる工程、及び
(D)工程(C)において得られた溶液の溶媒を、
(d1)ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びこれらの組合せからなる群から選ばれるカラムクロマトグラフィー;
(d2)限外ろ過法;
(d3)透析法;及び
(d4)(d1)〜(d3)の二以上の組合せ;
からなる群から選ばれる方法を用いて緩衝液に置換する工程、
を含む、前記調製方法。 - 単量体タンパク質が、scFvとストレプトアビジンとの融合タンパク質である請求項1記載の方法。
- 前記scFvが、HyHEL-10 scFv及びD1.3 scFvからなる群から選ばれる請求項2記載の方法。
- ストレプトアビジンが、完全長ストレプトアビジンであるか又はその機能性断片である請求項2又は3記載の方法。
- アルギニン又はアルギニン誘導体が、炭素数1〜6のアシル基を有するアルギニン、アルギニンブチルエステル、アグマチン及びアルギニン酸からなる群から選ばれる請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- アルギニン又はアルギニン誘導体が、アルギニン塩酸塩である請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
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WO2009136568A1 (ja) * | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 味の素株式会社 | タンパク質のリフォールディング方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
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JPN6012048838; Protein Eng. vol.9, no.2, 1996, pp.203-211 * |
JPN6012048840; Bull. Korean Chem. Soc. vol.30, no.5, 2009, pp.1101-1106 * |
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