WO2009136568A1 - タンパク質のリフォールディング方法 - Google Patents

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良輔 弓岡
大輔 江島
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    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components

Definitions

  • the present invention relates to a method (refolding method) for restoring a higher-order structure in a natural state to a protein that has lost activity or stability due to insolubilization or loss of higher-order structure.
  • a denatured protein that is insoluble in water may be obtained.
  • proteins are also called denatured proteins. Since the denatured protein loses its activity and stability, it is necessary to guide the protein to have a higher-order structure in the natural state in order to use the protein as a pharmaceutical or the like.
  • Protein refolding methods are known as methods that can be used in such cases. However, since the reagent and operation method used for this refolding need to be appropriately selected for each protein, it is not a technique that can be easily implemented for those who do not have refolding experience. Even when sufficient experience has been obtained, if the protein has a complex higher-order structure and easily undergoes association / aggregation during refolding, the natural state may not be easily obtained.
  • Non-patent Document 1 a column refolding method for reducing the risk of aggregation aggregation using a chromatography column
  • Non-patent Document 2 an immobilized refolding method for suppressing aggregation aggregation by immobilizing a target substance on a carrier, acidic Or a basic buffer solution instead of a denaturing agent, solubilized in a partially denatured state
  • Non-patent Document 3 a method in which a molecular chaperone coexists (Non-patent Document 4), and a reverse micelle like a molecular chaperone Method used
  • Method using a micelle of surfactant Non-patent document 6
  • High pressure refolding method Extracting without using a denaturant under ultra-high pressure exceeding 3000 atm 7)
  • Non-patent Document 9 Non-patent Document 9
  • Non-patent Document 10 Non-patent Document 10
  • Patent Document 2 There is also a known method of solubilizing insoluble bovine growth hormone using a surfactant solution containing lauroyl-L-glutamic acid adjusted to a strong alkali, and then refolding it by reducing the surfactant concentration by ultrafiltration.
  • Patent Document 2 it is difficult to effectively recover the natural state of proteins other than growth hormone by this method.
  • Patent Document 2 when the protein is brought into contact with a strong alkaline pH, the protein undergoes a chemical change such as a deamidation reaction that cannot be repaired.
  • an object of the present invention is to provide a simple refolding method in which a surfactant is smoothly desorbed from a protein and at the same time, the protein is restored to a higher-order structure in a natural state.
  • a specific surfactant is solubilized only by diluting the denatured protein using a specific aqueous surfactant solution and diluting the solubilized solution in a buffer containing arginine or an arginine derivative. It was found that the denatured protein restores higher order structure at the same time as it desorbs from the denatured protein. That is, the present invention provides a method for producing a protein in which a higher-order structure in its natural state is recovered from a protein that has been insolubilized or has lost its higher-order structure.
  • a step of obtaining a solubilized solution of the protein by bringing the protein insolubilized or having lost its higher-order structure into contact with 1 to 3% aqueous solution at pH 6.5 to 9.0
  • Concentration of the surfactant in the obtained mixed solution by adding the obtained solubilized solution to a buffer solution of pH 6.5 to 9.0 containing 0.05 to 1.2 M arginine or arginine derivative. Reducing the content to 0.02 to 0.5%
  • the present invention also provides a method for recovering a native conformation of a protein that has been insolubilized or has lost its conformation.
  • a surfactant 1 selected from the group consisting of a dicarboxylic acid having a C 8 to C 16 acyl group, decanoyl sarcosine, decanoyl alanine, decanoic acid or a salt thereof, lauryltrimethylammonium chloride, and a mixture thereof Obtaining a solubilized solution of the protein by bringing the protein insolubilized or having lost its higher-order structure into contact with a 3% aqueous solution at pH 6.5 to 9.0, (2) Concentration of the surfactant in the obtained mixed solution by adding the obtained solubilized solution to a buffer solution of pH 6.5 to 9.0 containing 0.05 to 1.2 M arginine or arginine derivative. Reducing the content to 0.02 to 0.5%,
  • a method comprising the steps of:
  • the present invention also provides a method for obtaining a protein in which a higher-order structure in a natural state is restored from a protein that has been insolubilized or has lost a higher-order structure.
  • a protein solubilized solution obtained by contacting an insolubilized or lost higher-order structure protein with a 1 to 3% aqueous solution of lauroyl glutamic acid, lauroyl aspartic acid or lauroiliminodiacetic acid at pH 6.5 to 9.0 And obtaining (2) By adding the obtained solubilized solution to a buffer solution of pH 6.5 to 9.0 containing 0.1 to 1.2 M arginine or an arginine derivative, lauroyl glutamic acid, lauroyl aspartic acid or Reducing the concentration of lauroiliminodiacetic acid to 0.02-0.275%.
  • the present invention also provides a method for recovering a native conformation of a protein that has been insolubilized or has lost its conformation.
  • a protein solubilized solution obtained by contacting an insolubilized or lost higher-order structure protein with a 1 to 3% aqueous solution of lauroyl glutamic acid, lauroyl aspartic acid or lauroiliminodiacetic acid at pH 6.5 to 9.0 And obtaining (2) By adding the obtained solubilized solution to a buffer solution of pH 6.5 to 9.0 containing 0.1 to 1.2 M arginine or an arginine derivative, lauroyl glutamic acid, lauroyl aspartic acid or Reducing the concentration of lauroiliminodiacetic acid to 0.02-0.275%.
  • the present invention it is possible to simply and effectively refold proteins without requiring refolding experience or special equipment.
  • protein association / aggregation that can occur in the process of restoring the higher-order structure of the protein in the natural state can also be suppressed.
  • the protein usually associates and aggregates at the same time as the surfactant desorbs from the protein.
  • the protein is denatured using a specific surfactant.
  • the specific surfactant used in the present invention is released from the protein, and at the same time, the arginine or arginine derivative is associated / aggregated with the protein. It is thought that the property can be suppressed.
  • ⁇ protein ⁇ Proteins that can be used in the present invention are proteins that have been insolubilized or have lost their higher order structure.
  • An insolubilized protein cannot be clearly distinguished from a protein that has lost its higher order structure, and any protein whose higher order structure is different from that in the natural state can be used in the present invention.
  • the present invention can be applied to a protein whose secondary structure is mainly an ⁇ -helix (eg, IL-6), a ⁇ -sheet (eg, scFv or Fab), or a protein consisting of both (eg, transglutaminase). It can be applied to monomeric proteins (such as IL-6) or multimeric proteins (such as Fab).
  • an insoluble recombinant protein prepared using a microorganism such as Escherichia coli as a production host usually has a solubility in 100 g of water of 0.001 g or less (25 ° C.), and can be used in the present invention. It may be a protein insolubilized by some stress from the soluble state.
  • the form of the protein is not particularly limited, and may be, for example, granular, powdered, or fibrous.
  • Protein fragments can also be used. For example, it can be used in the present invention in a weight average molecular weight (measured by ultracentrifugation analysis or static light scattering analysis under room temperature conditions) from 5000 daltons to 150,000 daltons.
  • cytokines such as human interleukin-6; proteinaceous ligands that function by acquiring specific higher-order structures such as growth factors, various hormones, and differentiation-inducing factors; enzymes such as transglutaminase; Proteinaceous enzyme inhibitors; and antibody-related molecules having an immunoglobulin structure.
  • Antibody-related molecules include antibody variable region (Fv, fragment of variable region), single chain antibody variable region (scFv, single chain Fv), antigen binding site (Fab, fragment of antigen binding), antigen binding site (Fab ') , Antibody fragments such as bivalent antigen binding site (F (ab ') 2 ); bispecific single chain Fv or diabody exhibiting bispecificity, diabody, antibody variable region and antibody Fc Artificial antibodies such as artificial small antibodies (Minibody) that are dimerized by fusing part of the domain; single light chain or heavy chain derived domains that constitute the antigen binding site or antibody variable region Single-domain antibody consisting of these domains, Fc fusion protein in which a protein or peptide is fused to the antibody Fc domain, and the like.
  • Fv fragment of variable region
  • scFv single chain Fv
  • Fab fragment of antigen binding site
  • Fab ' antigen binding site
  • Fab ' antigen binding site
  • Antibody fragments such as bivalent anti
  • single chain antibody variable regions such as HyHEL-10 scFv, for example, Pexelizumab (scFv), Abciximab (trade name, ReoPro), ranibizumab (trade name, LUCENTIS) as the antigen binding site (Fab) Or Certolizumab (trade name, Cimzia), Fc fusion proteins such as anti-Fluorescein scFv Fc fusion (eg, romilostim (trade name, Nplate), rilonacept (trade name, ARCALYST), abatacept (trade name, ORENCIA) Alternatively, alefacept (trade name, AMEVIVE) or the like is insolubilized or has lost its higher order structure.
  • scFv such as HyHEL-10 scFv
  • Pexelizumab scFv
  • Abciximab trade name, ReoPro
  • ranibizumab trade name, LUCENTIS
  • Fc fusion proteins such as anti-
  • antibody fragments are preferred.
  • the structures of these antibody-related molecules are described in detail in known papers such as Holliger P. and Hudson PJ. Nature Biotechnology 23 (9), 1126-1136 (2005).
  • Artificial affinity molecules made of scaffold structures other than immunoglobulin structures such as ankyrin repeats, fibronectin type III domains, and lipocalins can also be used in the present invention.
  • the insolubilized protein or the protein having a higher order structure is a protein having an immunoglobulin structure as a domain. More preferably, the protein having the immunoglobulin structure as a domain is an antibody fragment having a part of an antibody domain, a diabody or a small antibody artificial antibody, or an Fc fusion protein.
  • the antibody fragment having a part of the antibody domain is preferably scFv, Fab, Fab ′ or (F (ab ′) 2 ).
  • the Fc fusion protein is preferably one in which a cytokine, receptor extracellular domain or peptide is fused to an antibody Fc domain.
  • Step (1) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • a dicarboxylic acid having a C 8 to C 16 acyl group decanoyl sarcosine (lauroyl sarcosine, lauroyl-Sar), decanoyl alanine (lauroyl alanine, lauroyl-Ala), decanoic acid or These or their salts (eg, sodium salt, potassium salt), lauryltrimethylammonium chloride (LTAC), and mixtures thereof can stretch insoluble or non-native forms of proteins that have lost higher order structure in water. It functions as a surfactant (solubilizer) that can be used.
  • the surfactant is preferably a dicarboxylic acid having a C 8 to C 16 acyl group, decanoyl sarcosine, decanoyl alanine, or a salt thereof.
  • a dicarboxylic acid having a C 8 to C 16 acyl group or a salt thereof is more preferable. More preferably, the dicarboxylic acid having a C 8 to C 16 acyl group is lauroylglutamic acid (lauroyl-Glu), lauroylalpartic acid (lauroyl-Asp), or lauroylumiminodiacetic acid.
  • Lauroyl-Glu, lauroyl-Asp, lauroyl-Sar, and lauroyl-Ala used in the present invention may be any of D-form, L-form, and DL-form.
  • the insolubilized protein or the protein having lost the higher-order structure is a cytokine such as IL-6 or an enzyme such as transglutaminase, lauroyl-Glu, lauroyl-Asp, lauroiliminodiacetic acid, or a salt thereof, or a mixture thereof It is preferable to use it.
  • lauroyl-L-Glu has excellent solubilizing power for any insoluble protein and can be easily removed without being bound to protein when diluted.
  • the reagent is particularly preferred because it can be obtained at low cost.
  • ⁇ Concentration of surfactant Lauroyl-Glu, Lauroyl-Asp, Lauroyl riminodiacetic acid, Lauroyl-Sar, Lauroyl-Ala, Decanoic acid or LTAC is 1 to 3%, preferably 1.5 to 2.8%, more preferably 1.75 to Use a 2.5% aqueous solution. Within such a concentration range, the solubilization efficiency of the protein can be sufficiently enhanced, and the dilution factor, which is the next operation, can be kept moderate.
  • ⁇ pH The pH of the aqueous solution at 25 ° C.
  • pH can be measured by a pH meter equipped with a pH electrode.
  • the pH adjustment can be performed using a base such as sodium hydroxide.
  • a buffer may be used as the aqueous solution.
  • the surfactant aqueous solution thus prepared is brought into contact with the denatured protein to obtain a protein solubilized solution.
  • the denatured protein may be added to the surfactant aqueous solution, or the surfactant aqueous solution may be added to the denatured protein.
  • the contact can be carried out by allowing to stand usually at 5 to 40 ° C., preferably at 15 to 40 ° C. Such a range is preferable because modifications such as cleavage and oxidation due to a chemical reaction are suppressed to a minimum.
  • the standing time is usually 0.1 to 3.0 hours, preferably 0.5 to 1.0 hours.
  • the amount of denatured protein or solubilized aqueous solution is preferably adjusted so that the solubilized protein concentration is 1 to 20 mg / ml, since the protein concentration does not extremely decrease in the subsequent dilution process. Whether the protein has been solubilized can be confirmed by, for example, visual turbidity determination or ultraviolet absorption spectrum method at 280 nm.
  • Step (2) Dilution with additive solution
  • a buffer solution containing arginine or an arginine derivative as an additive at a dilution factor of about 10 to several tens of times until the protein recovers its higher-order structure in the natural state. Keep it as it is.
  • the surfactant is diluted to a concentration of 0.02 to 0.5%, preferably 0.04 to 0.35%, more preferably 0.05 to 0.30%. Surfactants are immediately detached from the protein by this dilution, and the protein forms a higher order structure. Dilution can be performed by appropriately selecting one stage, multiple stages (step gradient), or linear gradient.
  • the concentration of the surfactant after dilution is 0.02 to 0.275%, preferably 0.04 to 0.125%, more preferably 0.05 to 0.10%. It is preferable to dilute it.
  • the dilution ratio may be smaller than that of the above-described cytokine or enzyme. Specifically, it is preferable to dilute the surfactant so that its concentration after dilution is 0.02 to 0.5%, preferably 0.05 to 0.4%, and more preferably 0.1 to 0.3%.
  • the dilution concentration is lower than these, the higher-order structure in the native state of the protein can be recovered as long as it is within the range defined by the present invention.
  • the antibody fragments, Fab, Fab ′, and F (ab ′) 2 may be diluted in one step, or may be diluted in two or more steps, but it is preferable to dilute in multiple steps. This is preferable because the refolding rate is further improved.
  • it is preferable to dilute the surfactant so that the concentration of the diluted surfactant is 0.02 to 0.08%, preferably 0.03 to 0.07%, more preferably 0.04 to 0.06%.
  • the dilution in the first stage can be performed at the same dilution ratio as in the case of scFv described above. It is preferable to dilute the final surfactant so that the concentration of the surfactant after dilution is 0.02 to 0.08%, preferably 0.03 to 0.07%, more preferably 0.04 to 0.06%. You may dilute gradually. In that case, it is preferable to dilute so that the final concentration after dilution is 0.02 to 0.08%, preferably 0.03 to 0.07%, more preferably 0.04 to 0.06%. Such a range is preferable because restoration of the higher-order structure in the natural state is promoted and the stability of the protein is ensured. Whether the protein has recovered to its higher-order structure in the natural state is confirmed by spectroscopic measurements such as CD spectrum and fluorescence spectrum, physicochemical properties of the protein such as HPLC, or higher-order structural indices such as enzyme activity can do.
  • Arginine used as an additive may be L-type or D-type.
  • a salt with an inorganic acid such as hydrochloride or an organic acid such as acetate may be formed.
  • Arginine derivatives include arginine having an acyl group having 1 to 6 carbon atoms such as acetylarginine and N-butyroylarginine; agmatine from which a carboxyl group is removed; arginic acid having a hydroxyl group introduced in place of an ⁇ -amino group, and the like .
  • acylated arginine is preferable, and N-butyroylarginine is more preferable.
  • the additive is most preferably arginine hydrochloride.
  • the buffer solution sodium phosphate, sodium citrate, Tris hydrochloride and the like can be used.
  • the pH may be any pH that matches the properties of the protein that restores its natural state, and is a neutral pH that generally falls within the range of pH 6.5 to 9.0. Therefore, the pH in the step (2) may be in this range, and may be different from the pH in the step (1).
  • the pH can be adjusted with, for example, hydrochloric acid or sodium hydroxide.
  • additive concentration is individually selected according to the nature of the protein that restores the natural state, but is 0.05 to 1.2 M, preferably 0.06 to 1.0 M, and more preferably 0.08 to 0.8 M. Such a range is preferable because restoration of the higher-order structure in the natural state is promoted and subsequent purification steps are not hindered.
  • the protein is a cytokine such as IL-6 or an enzyme such as transglutaminase
  • the additive concentration is preferably 0.1 to 1.2M, preferably 0.2 to 1.0M, and more preferably 0.4 to 0.8M.
  • the additive concentration is preferably 0.2 to 1.0 M, more preferably 0.4 to 0.8 M.
  • the additive concentration is preferably 0.05 to 0.3M, more preferably 0.08 to 0.12M.
  • the dilution in the first stage can be performed at the same dilution ratio as that of scFv described above.
  • the dilution in the final stage is preferably performed so that the concentration of the additive after dilution is 0.05 to 0.3 M, preferably 0.06 to 0.2 M, more preferably 0.08 to 0.12 M. Dilution can be performed by appropriately selecting one stage, multiple stages (step gradient), or linear gradient.
  • ⁇ Dilution temperature / holding time Dilution may be carried out at room temperature, and may be carried out at 5 to 10 ° C. if the target protein is not sufficiently high in thermal stability when it is restored to its natural state.
  • the target protein is not sufficiently high in thermal stability when it is restored to its natural state.
  • rhIL-6 human interleukin-6
  • transglutaminase it may be maintained at room temperature for 2 hours or more. If it is maintained at 5-10 ° C, it must be maintained for a longer time.
  • the target protein is an antibody-related molecule
  • it should be maintained at a lower temperature for a longer time than in the case of cytokines such as IL-6 and transglutaminase. good. By doing so, the refolding rate is further improved. It is particularly preferred to maintain at 5 to 48 ° C. for 1 hour to 5 days.
  • the antibody-related molecule is an antibody fragment, particularly scFv, it is at 5 ° C to 15 ° C, preferably at 7 ° C to 13 ° C, more preferably at 8 ° C to 12 ° C, for 10 hours to 24 ° C.
  • this diluted solution may be heated and maintained for several hours to several days. Preferably at 15 ° C to 48 ° C, preferably at 20 ° C to 46 ° C, more preferably at 23 ° C to 45 ° C, for 1 hour to 5 days, preferably 1.5 hours to 3 days, more preferably 2 hours. It is desirable to maintain for ⁇ 24 hours.
  • the antibody fragment when diluted in one step, it is preferably maintained at 5 to 15 ° C. for 10 to 72 hours. More preferably, the temperature is maintained at 7 to 13 ° C. for 12 to 20 hours.
  • the dilution in the first stage is 5 ° C. to 15 ° C., preferably 7 ° C. to 13 ° C., more preferably 8 ° C. to 12 ° C., preferably 10 hours to 24 hours, preferably It is desirable to maintain for 12 to 20 hours, more preferably 15 to 18 hours. During that time, aggregation of antibody-related molecules is suppressed.
  • this diluted solution may be heated and maintained for several hours to several days. Preferably at 15 ° C. to 48 ° C., preferably at 20 ° C. to 46 ° C., more preferably at 23 ° C. to 45 ° C., for 1 hour to 5 days, preferably 1.5 hours to 3 days, more preferably 2 hours. It is preferably maintained for up to 24 hours. Temperature adjustment can be performed by appropriately selecting one stage, multiple stages (step gradient), or linear gradient. You may dilute gradually. In that case, it is preferable to dilute at 5 to 15 ° C. over 10 to 72 hours.
  • the protein concentration after the final stage dilution is 0.05 to 1.0 ⁇ mg / mg by concentrating with an ultrafiltration membrane, for example, by an amount that offsets the dilution ratio after the final stage dilution.
  • ml preferably 0.1 to 0.5 mg / ml, more preferably 0.15 to 0.3 mg / ml, the formation of disulfide bonds between the heavy and light chains constituting the Fab is promoted.
  • the time required for the refolding of the antibody-related molecule is appropriately determined for each antibody-related molecule by measuring the activity of gel filtration HPLC, electrophoresis, or antibody-related molecule. be able to. In many cases, it is about 40 hours, which is much shorter than the conventional antibody-related molecular refolding method represented by step dialysis.
  • Some proteins may be diluted in advance by adding a phosphate buffer solution or the like prior to dilution to the above range. Specifically, it is desirable to dilute between step (1) and step (2) so that the concentration of the surfactant is 0.8 to 1.5%, preferably 1%. After dilution, it is preferably 5 to 40 ° C., more preferably 5 to 30 ° C., for example, at room temperature, and preferably allowed to stand for 0.5 hour or more, whereby the recovery rate of the higher order protein structure can be further increased. It is sufficient to leave it as long as the time used for solubilization.
  • the target protein is an antibody-related molecule and the antibody-related molecule is an antibody fragment, particularly scFv, it is 5 ° C to 15 ° C, preferably 7 ° C to 13 ° C, more preferably 8 ° C.
  • the antibody-related molecule approaches the natural state without allowing associated aggregation to proceed.
  • the antibody fragment is Fab, Fab ′ and F (ab ′) 2
  • it is diluted in a buffer containing arginine or an arginine derivative as an additive, and the lauroyl-Glu concentration is 0.05 to 0.5%, preferably 0.08 to 0.4%.
  • the arginine concentration is adjusted to 0.1 to 0.3%, 0.6 to 1.2 M, preferably 0.7 to 1.1 M, and more preferably 0.8 to 1.0 M.
  • the diluted solution obtained at this time may have a pH at 25 ° C. in the range of pH 6.5 to 9.0, and may be different from the pH in step (1).
  • the pH can be adjusted with, for example, hydrochloric acid or sodium hydroxide.
  • Optional Step (B): Formation of Disulfide Bond Some proteins may have disulfide bonds within a single molecule, and in the case of multimeric proteins, intermolecular disulfide bonds. It is preferable to cause the protein to undergo an oxidation-reduction reaction to promote the formation of these disulfide bonds, since the refolding rate is further improved.
  • a redox reaction promotes a thiol-disulfide exchange reaction to form an intramolecular or intermolecular disulfide bond (for example, a mixture of oxidized glutathione (GSSG) and reduced glutathione (GSH)).
  • a mixture of cystine and cysteine, or a mixture of cystamine and cysteamine, or oxidized glutathione or a mixture of cystine and mercaptoethanol, etc.)) or a copper ion for promoting air oxidation can also be carried out by changing the redox potential of the protein. It is preferred to use a redox material.
  • the oxidation-reduction reaction may be performed at any time after the step (1).
  • the oxidation-reduction substance may be added to the solubilized solution together with the additive, You may carry out by adding a redox substance to this dilution liquid after obtaining a dilution liquid in a process (2).
  • the concentration of the redox substance or copper ion is adjusted to an appropriate concentration for each protein that restores the natural state.
  • the pH at 25 ° C. may be in the range of pH 6.5 to 9.0.
  • the pH can be adjusted with, for example, hydrochloric acid or sodium hydroxide.
  • the liquid temperature may be the same as the temperature of the solubilized liquid obtained in the step (1) or the temperature of the solubilized liquid obtained in the step (2). In order to promote the oxidation-reduction reaction, about 5 to 48 ° C. is preferable. After the oxidation-reduction reaction, it may be left at 5 to 48 ° C. for 1 hour to 5 days (120 hours).
  • the refolding rate is at least 30%, often reaching 70%.
  • Optional step (C): Purification Proteins restored to higher order structure should be purified by conventional methods such as ultrafiltration, dialysis, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, etc. Can do. EXAMPLES The present invention will be specifically described below using examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • rhIL-6 human interleukin-6
  • Patent No. 3200850 human interleukin-6
  • the rhIL-6 is water-insoluble (solubility in 100 g of water at 25 ° C .: 0.001 g or less), and its form is granules.
  • the insoluble granules were dispensed into 4 mg portions of rhIL-6 per Eppendorf tube (polypropylene; Eppendorf).
  • the amount of rhIL-6 contained in the insoluble granules was quantified in advance by the reverse phase HPLC method described in the previous report (Japanese Patent No. 3200850).
  • the final concentration of lauroyl-L-Glu, lauroyl-L-Asp, lauroiriminodiacetic acid, decanoyl Sar, decanoyl L-Ala, decanoic acid or lauryltrimethylammonium chloride is 2%
  • rhIL-6 Add surfactant and pure water (MilliQ water) prepared in advance to 5% so that the extraction concentration is 4 mg / ml, adjust to 1 ml, and leave it at room temperature for 2 hours. Then, rhIL-6 was extracted from the insoluble granules to solubilize rhIL-6. For comparison, the same operation was performed using the following surfactants. When an anionic surfactant was used, the concentration of the aqueous solution was adjusted to pH 7.0 (25 ° C.) using NaOH.
  • Disulfide bond formation was performed by reversed-phase HPLC (column, Vydac 214-TP5410 (Separations Group); eluent, A / 0.1% TFA B / 0.1% TFA + 80% acetonitrile; flow rate, 1 ml / min; elution conditions, 30 % B to 50% B (linear gradient of 1.0% / min), and the change in peak retention time was confirmed as an index.
  • 3200850) by ion exchange HPLC is known to be rhIL-6 having a higher-order structure in the natural state (Biotechnology and Bioengineering 62, 301- 310 (1999)), the amount of rhIL-6 forming a higher-order structure in the natural state contained in the aqueous solution after dilution above was determined by ion exchange HPLC (column, SP-NPR (manufactured by Tosoh Corporation); Eluent, A / 0.01 M sodium acetate, pH 5.0 B / 0.5 M sodium acetate, pH 5.5; flow rate, 1 ml / min; elution conditions, 10% / min linear gradient from 20% B to 70% B).
  • Relative amount of rhIL-6 when solubilized with lauroyl-L-Asp and lauroylinminodiacetic acid is 100% relative to the amount of rhIL-6 when solubilized with lauroyl L-Glu as a surfactant ( Figure 1).
  • the relative amount of rhIL-6 when solubilized with a comparative surfactant was also shown (FIG. 1).
  • the amount of rhIL-6 when rhIL-6 is solubilized using lauroyl-Asp or lauroleuminodiacetic acid to restore the higher-order structure in the natural state is the same as that of lauroyl-Glu.
  • the amount of rhIL-6 was not inferior.
  • the amount of rhIL-6 that restored the higher-order structure in the natural state obtained when these three surfactants were used was higher than that obtained when the comparative surfactant was used.
  • CAC lauroyl-Sar and cetyltrimethylammonium chloride
  • Non-ionic surfactants such as Tween 20, Tween 80, and Triton X-100, which are often used for refolding due to their weak protein denaturation effect, have poor ability to extract rhIL-6 from insoluble granules. Since it could hardly be dissolved, the amount of rhIL-6 which restored the higher-order structure in the natural state was as low as 3 to 5%.
  • lauryltrimethylammonium chloride having an amount of rhIL-6 of 80% or more relative to lauroyl-L-Glu in Reference Example 1, lauroyl-Sar having the same lauroyl group, and acyl in lauroyl-L-Glu
  • undecanoyl L-Glu, tridecanoyl L-Glu and myristoyl L-Glu, and decanoic acid were used to confirm the influence of acyl chain.
  • the same insoluble granules of rhIL-6 used in Reference Example 1 were used, and 13 mg thereof was aliquoted into Eppendorf tubes.
  • the concentration of rhIL-6 that restored the higher-order structure in the natural state is the highest, and intramolecular such as lauroyl L-Asp, Even when a single-chain dihydrophilic surfactant having an amide bond was used, a high rhIL-6 concentration was exhibited.
  • the acyl chain length of lauroyl-L-Glu is shortened to C11 (undecanoyl) or extended to C13 (tridecanoyl) or C14 (myristoyl)
  • the rhIL-6 concentration is higher than when lauroyl-L-Glu is used.
  • rhIL-6 was completely extracted, the rhIL-6 extract concentration was adjusted to 4.3 mg / ml. After extraction, 10 mM dithiothreitol (DTT) was added to the supernatant, adjusted to pH 8, and heated at 37 ° C. for 30 minutes to reduce disulfide bonds.
  • DTT dithiothreitol
  • step (2) the optimum concentration of the surfactant when the protein extracted with the surfactant was diluted and refolded was examined. Since rhIL-6 gives a fluorescence spectrum that well reflects its higher-order structure, it is suitable for refolding by tracking the rhIL-6 maximum fluorescence intensity and its wavelength in each concentration of lauroyl-L-Glu. Lauroyl-L-Glu concentration was determined.
  • the rhIL-6 preparation (patent 3200850) was adjusted to 0.075 mg / ml in 10 mM sodium phosphate, pH 7.0, and the fluorescence spectrum was measured at room temperature with an excitation wavelength of 295 nm and a fluorescence wavelength of 315 to 420 nm.
  • Reference Example 5 The relationship between the concentration of lauroyl-L-Glu and the higher order structure of rhIL-6 found in Reference Example 4 starts from the rhIL-6 state dissolved in the surfactant, and is gradually diluted from there. In the process (refolding process), the same observation was confirmed.
  • the rhIL-6 preparation (Patent No. 3200850) was dissolved in 1 ml of 10 mM sodium phosphate (pH 7.0 (25 ° C.)) containing 2% lauroyl-L-Glu and adjusted to 3 mg / ml.
  • This solution was diluted stepwise with 10 mM sodium phosphate (pH 7.0 (25 ° C)) to prepare a dilution series in which the lauroyl-L-Glu concentrations were 1.0%, 0.3%, 0.1%, and 0.05%. .
  • the fluorescence spectrum of each diluted solution was measured, and the change in the maximum fluorescence wavelength accompanying the change in the lauroyl-L-Glu concentration was followed.
  • the same operation was performed using lauroyl-Sar instead of lauroyl-L-Glu. The results are shown in FIG.
  • Example 1 Solubilization of denatured protein with surfactant
  • lauroyl-L-Glu aqueous solution containing 10 mM sodium phosphate, pH 7 (25 ° C)
  • rhIL-6 was extracted from the insoluble granules and solubilized rhIL-6.
  • the solubilized solution obtained had a rhIL-6 concentration of 6.5 mg / ml.
  • Step (B): Formation of disulfide bond 10 ⁇ M reduced glutathione and 2 ⁇ M oxidized glutathione were added to the resulting solubilized solution and allowed to stand at room temperature for 18 hours to form intramolecular disulfide bonds.
  • Step (2): Dilution with additive solution arginine hydrochloride was added as an additive to a 10 mM aqueous sodium phosphate solution to prepare diluted solutions (pH 7.0 (25 ° C.)) with arginine hydrochloride concentrations of 0.4 M, 0.8 M, and 1.2 M.
  • a negative control a diluted solution prepared in the same manner except that no additive was added was prepared.
  • RhIL-6 was refolded by a method corresponding to the method described in Example 1 of Japanese Patent No. 3200850. Specifically, the same water-insoluble granules of rhIL-6 used in Example 1 were added to 5 ml of 6 M guanidine hydrochloride (pH 7 (25 ° C.)) and left at 37 ° C. for 1 hour. Then, rhIL-6 was extracted from the insoluble granules to solubilize rhIL-6. The resulting solubilized solution had a rhIL-6 concentration of 0.88 mg / ml.
  • Table 1 are relative values based on the refolding rate of rhIL-6 according to the prior art shown in Comparative Example 3.
  • the refolding rate was 125% of the prior art, and the superiority was clear.
  • the refolding rate reaches 166%, and when the arginine hydrochloride concentration is increased to 0.8 M and 1.2 M, the refolding rate dramatically increases to 174% and 176%. It was.
  • Example 2 [Step (1): Solubilization of denatured protein with surfactant] RhIL-6 was solubilized in the same manner as in Example 1 except that the lauroyl-L-Glu concentration of the aqueous solution of lauroyl-L-Glu was changed to 2.5% and the pH was changed to 8.5. The solubilized solution obtained had a rhIL-6 concentration of 6.5 mg / ml. [Step (B): Formation of disulfide bond] Subsequently, as in Example 1, the mixture was left at room temperature for 18 hours in the presence of 10 ⁇ M reduced glutathione and 2 ⁇ M oxidized glutathione.
  • Step (2) Dilution with additive solution
  • arginine hydrochloride or N- ⁇ -butyroyl-Lginine N ⁇ -Butyroyl-L-Arginine
  • the additive concentration is 0.4 M or 0.8 M dilution ( pH 7.0 (25 ° C.) was prepared.
  • N-Butyroylarginine was prepared by the following method: After arginine was dissolved in water / 2-propanol, the reaction system was adjusted to pH 11, 10 to 15 ° C. While maintaining the pH and temperature with an aqueous sodium hydroxide solution, butyroyl chloride was added dropwise to react.
  • Table 2 are relative values based on the refolding rate of rhIL-6 according to the prior art shown in Comparative Example 3.
  • the refolding rate is 115%.
  • the refolding rate dramatically increases to 157% and 188%. Increased.
  • the refolding rate reaches 179%.
  • arginine hydrochloride is at the same concentration ( Compared with the addition of 0.4 M), the refolding rate was greatly improved.
  • N-Butyroylarginine is zwitterionic at neutral pH and loses its total charge, so even if 0.4 M or more is added, it is directly ion exchange chromatographed without diluting the diluted solution. It can be considered that the refolded protein can be purified and recovered by loading to, so that it can be used more efficiently than arginine hydrochloride.
  • Water-insoluble granules of transglutaminase (protein-glutamine, ⁇ -glutamyltransferase, EC 2.3.2.13; US Patent No. 6833258) prepared using genetically modified Escherichia coli were mixed with 2.0% lauroyl-L-Glu aqueous solution (10 mM Tris hydrochloride). , 20 mM DTT, pH 8.5 (25 ° C.) was added to 5 ml and left at 37 ° C. for 1 hour to extract and solubilize transglutaminase.
  • the resulting solubilized solution had a transglutaminase concentration of 6.98 mg / ml.
  • Step (A): Dilution before dilution with additive solution 0.1 ml of the resulting solubilized solution was diluted 40-fold with 10 mM sodium phosphate (pH 7.0 (25 ° C.)), the lauroyl-L-Glu concentration was adjusted to 0.05%, and left at room temperature for 2 hours.
  • Step (2): Dilution with additive solution Arginine hydrochloride was added as an additive to the diluted solution (“No dilution to 1%” in Table 3). As a negative control, a diluted solution to which no additive was added was prepared.
  • the solubilized solution was diluted with 0.1 mM sodium phosphate (pH 7.0 (25 ° C.)) to adjust the lauroyl-L-Glu concentration to 0.05%.
  • 0.1 ml of the solubilized solution obtained was diluted 2-fold with 0.6 M sodium phosphate (pH 7.0 (25 ° C)), the lauroyl-L-Glu concentration was adjusted to 1.0%, and maintained at room temperature for 30 minutes. .
  • Arginine hydrochloride was added to the diluted solution as an additive (in Table 3, “with dilution to 1%”).
  • a diluted solution to which no additive was added was prepared.
  • 0.1 ml of the solubilized solution was diluted 2-fold with 0.6 M sodium phosphate (pH 7.0 (25 ° C.)), the lauroyl-L-Glu concentration was adjusted to 1.0%, and maintained at room temperature for 30 minutes. Subsequently, it diluted with 10 mM sodium phosphate (pH 7.0 (25 degreeC)), the lauroyl-L-Glu density
  • transglutaminase When arginine hydrochloride was not added to the diluted solution, it was confirmed by gel filtration HPLC both when diluted to 1% and then to 0.05%, and when diluted to 0.05% without being diluted to 1%. The concentration of transglutaminase did not reach 50 ⁇ g / ml. Moreover, it was found that when this diluted solution was kept at room temperature, transglutaminase gradually disappeared, so that the higher-order structure in the natural state of transglutaminase could not be recovered.
  • transglutaminase concentration tends to increase, especially when 1.2 M arginine hydrochloride is added, the transglutaminase concentration clearly increases from 127 ⁇ g / ml to 151 ⁇ g / ml. I understood. Based on the above, transglutaminase refolding can be performed efficiently by adding arginine hydrochloride at the time of dilution, diluting the lauroyl-L-Glu concentration to 1% after solubilization, and then further diluting. I knew it was possible.
  • Example 4 [Step (1): Solubilization of denatured protein with surfactant, Step (A): Dilution before dilution with additive solution]
  • the transglutaminase solubilized solution obtained in the same manner as in Example 3 was diluted 2-fold with 0.6 M sodium phosphate (pH 7.0 (25 ° C)) and kept at room temperature for 30 minutes. did.
  • [Step (2): Dilution with additive solution] Subsequently, it diluted 20 times with 10 mM sodium phosphate (pH 7.0 (25 degreeC)), and the lauroyl-L-Glu density
  • Arginine hydrochloride was previously added to sodium phosphate for the second dilution (20-fold dilution) so that arginine hydrochloride would be 0.8 M when adjusted to 0.05%.
  • the resulting diluted solution was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • the transglutaminase concentration in the diluted solution was reversed-phase HPLC (Vydac 214-TP54 (Separations Group); eluent, A / 0.1% TFA B / 0.1% TFA + 80% acetonitrile; flow rate, 1 ml / min; elution) Quantification was performed using 30% B to 50% B (linear concentration gradient method at 1.0% / min). Based on the transglutaminase concentration in the lysate, the refolding rate after addition of arginine hydrochloride was 77%.
  • Transglutaminase was refolded by a method corresponding to the method described in Example 9 of US. Patent No. 6833258. Specifically, the same water-insoluble granules of transglutaminase as used in Example 3 were dissolved with 8M urea, adjusted to pH 4.0 at 5 ° C. and then diluted with 50 to adjust the urea concentration to 0.16 M. After 2 hours, the structure was formed by adjusting the pH to 6.0. The transglutaminase concentration was quantified by reverse phase HPLC as in Example 4. Based on the transglutaminase concentration in the solution after dissolution with urea, the refolding rate after adjusting the pH to 6.0 was 29%.
  • Example 4 The refolding rate of Example 4 was 77%, which was dramatically higher than 29% of Comparative Example 4 using the conventional refolding technique.
  • the enzyme activity of the transglutaminase prepared by each refolding method was confirmed by the synthetic substrate method.
  • the enzyme activity of the transglutaminase prepared in Example 4 was 37.5 U / mg, and the transglutaminase prepared in Comparative Example 4 was used.
  • the enzyme activity was 36.8 U / mg, both of which were judged to have the same specific activity as that of natural transglutaminase.
  • Example 5 [Preparation of protein] A production system of a single chain antibody variable region (HyHEL-10 scFv) using E. coli BL21 strain (DE3) as a production host was constructed (Gene 129 (1), 129-134 (1993)). This production bacterium was cultured in a LB medium with shaking at 28 ° C. for 12 hours using a Sakaguchi flask, and HyHEL-10 scFv was accumulated in the microbial cells as insoluble granules. The bacterial cells were collected and subjected to ultrasonic disruption, and then the suspension was centrifuged at 5000 g for 20 minutes to collect HyHEL-10 scFv granules.
  • HyHEL-10 scFv single chain antibody variable region
  • HyHEL-10 scFv granules were washed twice with 1% Triton X-100 aqueous solution and then with purified water (Milli Q water) to remove Triton X-100. About 30 mg of the obtained granules were suspended in 1.5 ml of acetone to dissolve and remove the lipid component. Centrifugation was performed at 5000 g for 20 minutes, and the granules were collected and dried under reduced pressure overnight using a vacuum pump to obtain insoluble granule pellets.
  • Step (1) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • 15 mg of this pellet was weighed, and 0.5 ml of 5% lauroyl-L-Glu (containing 20 mM Na phosphate, pH 8.5) was added. After stirring and homogenizing, 20 mM Na phosphate, pH 8.5 was immediately added as appropriate, and adjusted to 1.0 ml using the scale of an Eppendorf tube. Solubilized at 37 ° C for 30 minutes. In order to determine the concentration of HyHEL-10 scFv in the solubilized solution obtained, centrifugation was performed at 22 ° C. and 11000 g for 10 minutes, and the resulting supernatant (Lauroyl-L-Glu2.
  • 0.2 ml of the solubilized solution obtained in step (1) 0.3 ml of 20 mM sodium phosphate, pH 8.0 was added to make the total solution volume 0.5 ml (lauroyl-L-Glu concentration 1.0%). After stirring, the temperature was maintained at 5 ° C. for 30 minutes.
  • Step (B): Formation of disulfide bond In addition to the lauroyl-L-Glu concentration 1.0% solution obtained in step (A), various concentrations of lauroyl-L-Glu containing arginine hydrochloride as an additive and oxidized and reduced glutathione as a redox substance are included.
  • a 0.38 mL solution was prepared. Thereto was added 0.02 mL of lauroyl-L-Glu concentration 1.0% obtained in step (A) to a final concentration of 0.4 mL (20-fold dilution). Lauroyl-L-Glu concentration at 20-fold dilution is 0.05%, 0.1%, 0.125%, 0.15%, 0.175%, 0.2%, 0.3%, 0.4% or 0.5%, arginine hydrochloride concentration is 0.8 M, oxidized type The reduced glutathione concentration was 1 mM, and the scFv concentration was 0.12 mg / ml. Thereafter, it was maintained at 5 ° C. for 17 hours. It was then maintained at 23 ° C. for 43 hours.
  • FIG. 6 shows the relationship between the lauroyl-L-Glu concentration at 20-fold dilution and the refolding rate. The refolding rate was remarkably dependent on the lauroyl-L-Glu concentration and was found to be almost quantitative at 0.2-0.5%.
  • Example 6 [Preparation of protein] A production system for a single-chain antibody variable region (anti-fluorescein scFv) using E. coli BL21 strain (DE3) as a production host was constructed (Journal of Molecular Biology 343, 685-701 (2004)). This production bacterium was cultured with shaking in LB medium at 28 ° C. for 12 hours using a Sakaguchi flask, and anti-fluorescein scFv was accumulated in the microbial cells as insoluble granules. After collecting the cells and sonicating, the suspension was centrifuged at 5000 g for 20 minutes to collect anti-fluorescein scFv granules.
  • the collected anti-fluorescein scFv granules were washed twice with 1% Triton X-100 aqueous solution and then washed with purified water (Milli-Q water) to remove Triton X-100. About 30 mg of the obtained granule was suspended in 1.5 ml of acetone to dissolve and remove the lipid component. Centrifugation was performed at 5000 g for 20 minutes, and the granules were collected and dried under reduced pressure overnight using a vacuum pump to obtain insoluble granule pellets.
  • Step (1) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • 15 mg of this pellet was weighed, and 0.5 ml of 5% lauroyl-L-Glu (containing 20 mM Na phosphate, pH 8.5) was added. After stirring and homogenizing, 20 mM Na phosphate, pH 8.5 was immediately added as appropriate, and adjusted to 1.0 ml using the scale of an Eppendorf tube. Solubilized at 37 ° C for 30 minutes. In order to determine the concentration of the solubilized anti-fluorescein scFv, the obtained solubilized solution was centrifuged at 22 ° C. and 11000 g for 10 minutes.
  • Step (B) Formation of disulfide bond
  • step (A) Thereto was added 0.02 mL of lauroyl-L-Glu concentration 1.0% obtained in step (A) to a final concentration of 0.4 mL (20-fold dilution).
  • arginine hydrochloride concentration 0 0.4 M or 0.8 M
  • Lauroyl-L-Glu concentration is 0.05%, 0.2% or 0.4% in all 9 types
  • the concentration of oxidized and reduced glutathione is In both cases, the concentration was 1 mM and the scFv concentration was 0.16 mg / ml. Thereafter, it was maintained at 10 ° C. for 17 hours. It was then maintained at 23 ° C. for 12 hours.
  • FIG. 8 shows the relationship between lauroyl-L-Glu concentration, arginine hydrochloride concentration, and refolding rate when diluted 20-fold. From FIG. 8, it was found that the anti-fluorescein scFv refolding rate was significantly dependent on both arginine hydrochloride and lauroyl-L-Glu. In particular, the highest refolding rate was obtained by setting arginine hydrochloride to 0.8 M and lauroyl-L-Glu to 0.2% or 0.4%.
  • Example 7 Solubilization of denatured protein with surfactant
  • a solubilized solution of anti-Fluorescein scFv insoluble granules, 8 mg / ml (lauroyl-L-Glu concentration, 2.5%) was obtained.
  • 0.68 ⁇ l of a 100 mM DTT solution (pH 7) was added to 0.08 ml of the solubilized solution to adjust to 0.8 mM DTT, and the mixture was heated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • a 0.18 mL solution was prepared.
  • the lauroyl-L-Glu solution had a lauroyl-L-Glu concentration of 0.150%, 0.225%, 0.300% or 0.375%.
  • Thereto was added 0.02 mL each of lauroyl-L-Glu concentration 1.0% obtained in step (A) to finally make 0.4 mL (10-fold dilution).
  • the arginine hydrochloride concentration at 10-fold dilution was 0.8 M
  • the oxidized and reduced glutathione concentrations were 1 mM and 3 mM, respectively
  • the scFv concentration was 0.32 mg / ml. Thereafter, it was maintained at 10 ° C. for 17 hours.
  • FIG. 9 shows the relationship between the lauroyl-L-Glu concentration at 10-fold dilution and the refolding rate.
  • the refolding rate increased depending on the lauroyl-L-Glu concentration, but the change between 0.225 and 0.375% was not so significant compared to the lauroyl-L-Glu concentration at 0.225-0.375%. After the refolding, it was found that an addition amount of about 0.3% by weight was preferable in consideration of the labor for removing lauroyl-L-Glu.
  • Example 8 Solubilization of denatured protein with surfactant
  • a solubilized solution of anti-fluorescein scFv insoluble granules, 6 mg / ml (lauroyl-L-Glu concentration, 2.5%) was obtained.
  • 1.6 ⁇ l of 100 mM DTT solution (pH 7) was added to 0.2 ml of the solubilized solution to adjust to 0.8 mM DTT, followed by heating at 37 ° C. for 60 minutes.
  • Example 9 Solubilization of denatured protein with surfactant
  • a solubilized solution of anti-fluorescein scFv insoluble granules, 6 mg / ml (lauroyl-L-Glu concentration, 2.5%) was obtained.
  • 0.4 ⁇ l of 100 mM DTT solution (pH 7) was added to 0.05 ml of the solubilized solution to adjust to 0.8 mM DTT, followed by heating at 37 ° C. for 60 minutes.
  • Step (2) Dilution with additive, Step (B): Formation of disulfide bond Lauroyl-L-Glu solution 1.08 mL containing arginine hydrochloride as additive and oxidized and reduced glutathione as redox substance in 0.12 mL of lauroyl-L-Glu concentration 1.0% solution obtained in step (A) Added (diluted 10 times) to make a total volume of 1.2 mL. At 10-fold dilution, the lauroyl-L-Glu concentration was 0.1%, the arginine hydrochloride concentration was 0.8 M, the oxidized and reduced glutathione concentrations were both 1 mM, and the scFv concentration was 0.24 mg / ml.
  • Each 0.4 ml was divided into 3 portions and maintained at 5 ° C., 10 ° C. or 15 ° C. for 18.5 hours, respectively.
  • Each refolding rate is shown in FIG.
  • 0.2 ml each was divided into two, one was heated at 45 ° C. for 4 hours, and the other was maintained at 23 ° C. for 24 hours and then heated at 45 ° C. for 4 hours.
  • the respective refolding rates are shown in FIG.
  • the refolding rate is 18.5 hours at 5 ° C, 10 ° C or 15 ° C. It was significantly higher than when heated to 45 ° C immediately after maintenance. At that time, it was found that when the initial maintenance was performed at 10 ° C., the refolding rate was higher than when it was maintained at 15 ° C., and finally the refolding rate was 45% (FIG. 12). From the above, it was found that the refolding rate of scFv was the highest when heated at 45 ° C for 4 hours after being maintained at 10 ° C for 18.5 hours and at 23 ° C for 24 hours.
  • Example 10 [Preparation of protein] About 55 mg (18.2 mg / ml, 3 ml) of anti-von Willebrand factor monoclonal antibody (WO96 / 17078) dissolved in digestive enzyme (papain) reaction buffer (20 mM sodium phosphate, 10 mM EDTA) The solution was diluted 2-fold with the same buffer to which mM Cys was added, and the Cys concentration was adjusted to 10 mM. To this was added 2 ml of a suspension of immobilized papain gel (Pierce) that had been previously activated. The mixture was shaken at 37 ° C. for 14 hours, and centrifuged (2000 g, 5 minutes) to remove the immobilized papain gel.
  • immobilized papain gel Pieris
  • Step (1) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • An equal amount of 5% lauroyl-L-Glu (containing 20 mM sodium phosphate, pH 8.5) was added to 0.5 ml of the obtained Fab to make a total volume of 1 ml (2.5% lauroyl-L-Glu solution). This was heated at 37 ° C. for 30 minutes to obtain a solubilized solution.
  • 1.46 ⁇ l of a 100 mM DTT solution (pH 7) was added to adjust to 1.2 mM DTT, and then heated at 37 ° C. for 60 minutes (reduced modified Fab, 5.75 mg / ml).
  • 0.18 ml of 20 mM Na phosphate, pH 8.0 was added to adjust to 0.3 ml (lauroyl-L-Glu concentration, 1.0%). After stirring, the temperature was maintained at 5 ° C. for 30 minutes.
  • Step (B): Formation of disulfide bond In addition to the lauroyl-L-Glu concentration 1.0% solution obtained in step (A), 0.18 mL of lauroyl-L-Glu solution containing arginine hydrochloride as an additive and oxidized and reduced glutathione as a redox substance was added. Got ready.
  • the lauroyl-L-Glu concentration in the diluted solution was adjusted to 0.05%, the arginine hydrochloride concentration was adjusted to 0.08 M, and the oxidized and reduced glutathione concentrations were adjusted to 1 mM and 5 mM, respectively. Thereafter, the temperature was maintained at 5 ° C. for 3 hours. Subsequently, the solution was concentrated 10 times using an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra-15, molecular weight fraction 10 kDa, manufactured by Millipore) and maintained at 8.5 ° C. for 72 hours. In other words, the 10-fold dilution and the 10-fold concentration offset each other, and the Fab concentration during this period was maintained at 0.23 mg / ml, which was the same as at the first dilution. The Fab band refolded by non-reducing SDS-PAGE was observed.
  • the sharpness of the Fab band varied greatly depending on the composition at the first dilution. If no arginine hydrochloride was added at the first dilution, the Fab was hardly refolded after the second dilution (lane numbers 2-4). On the other hand, when 0.4 M (lane numbers 8 to 10) or 0.8 M (lane numbers 11 to 13) of arginine hydrochloride was added at the first dilution, the Fab band was observed most strongly after the second dilution.
  • the lauroyl-L-Glu concentration at the first dilution should be 0.1% (lane numbers 8, 11), 0.2% (lane numbers 9, 12), and 0.3% (lane numbers 10, 13).
  • Step (B): Formation of disulfide bond In addition to the lauroyl-L-Glu concentration 1.0% solution obtained in step (A), 0.135 mL of lauroyl-L-Glu solution containing arginine hydrochloride as an additive and oxidized and reduced glutathione as an oxidation-reduction substance was added. Got ready.
  • the lauroyl-L-Glu solution has a lauroyl-L-Glu concentration of 0.1%, an arginine hydrochloride concentration of 0.8 M, a Fab concentration of 0.23 mg / ml, and an oxidized glutathione concentration of 1 mM, 2 mM, or 5 mM.
  • reduced glutathione 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, or 5 mM was used.
  • Thereto was added 0.15 mL each of lauroyl-L-Glu concentration 1.0% obtained in step (A) to a final volume of 1.5 mL. Thereafter, it was maintained at 10 ° C. for 17 hours and then at 23 ° C. for 6 hours.
  • each diluted solution contains glutathione at the same concentration as oxidized and reduced glutathione, diluted 10-fold with a buffer solution appropriately added with lauroyl-L-Glu, and lauroyl-L-Glu to 0.05%,
  • the arginine hydrochloride concentration was adjusted to 0.08 M, and the reduced glutathione concentration of 1 mM, 2 mM, or 5 mM was adjusted to all 6 types of reduced glutathione 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, or 5 mM. Thereafter, the temperature was maintained at 8.5 ° C. for 15 hours.
  • Fab bands were not formed under reducing conditions, and Fabs were refolded by increasing the concentration of oxidized glutathione. Unlike scFv, Fab refolding required oxidative conditions. As described above, it was found that Fab can be refolded in about 41 hours from the start of the first dilution by adjusting the redox conditions.
  • Example 12 [Preparation of protein] Construction of Fc fusion protein (anti-fluorescein scFv Fc fusion) production system of single chain antibody variable region (anti-fluorescein scFv; Journal of Molecular Biology 343, 685-701 (2004)) using E. coli BL21 strain (DE3) as production host .
  • This production bacterium was cultured with shaking in a LB medium at 28 ° C. for 12 hours using a Sakaguchi flask, and anti-fluorescein scFv Fc fusion was accumulated in the cell form as insoluble granules.
  • the bacterial cells were collected and subjected to ultrasonic disruption, and then the suspension was subjected to centrifugation at 5000 g for 20 minutes to recover anti-Fluorescein scFv Fc fusion insoluble granules.
  • the recovered insoluble granules were washed twice with 1% Triton X-100 aqueous solution and then with Milli-Q water to remove Triton X-100. About 30 mg of the obtained granule was suspended in 1.5 ml of acetone to dissolve and remove the lipid component.
  • the granules were collected by centrifugation at 5000 g for 20 minutes, and then dried under reduced pressure overnight using a vacuum pump to obtain insoluble granule pellets.
  • Step (1) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • 15 mg of the pellet obtained above was weighed, and 0.5 ml of 5% lauroyl-L-Glu (containing 20 mM sodium phosphate, pH 8.5) was added. After stirring and homogenizing, 20 mM Na phosphate, pH 8.5 was immediately added as appropriate, and adjusted to 1.0 ml using the scale of an Eppendorf tube. Solubilization was carried out at 37 ° C. for 30 minutes to obtain a solubilized solution. The sample was centrifuged at 11000 g for 10 minutes at 22 ° C.
  • Step (2) Dilution with additive
  • a buffer solution containing arginine hydrochloride as an additive and oxidized glutathione and reduced glutathione as redox substances was added to make the total volume 6.0 mL (10 times) Dilution).
  • This solution has a lauroyl-L-Glu concentration of 0.1%, an arginine hydrochloride concentration of 0.8 M, oxidized glutathione and reduced glutathione concentrations of 1 mM and 5 mM, respectively, and an anti-fluorescein scFv Fc fusion concentration of 0.12 mg.
  • the anti-fluorescein scFv Fc fusion band refolded by non-reducing SDS-PAGE was observed in the same manner as in Example 5 at 48 hours and 120 hours after the start of maintenance at each temperature.
  • the anti-fluorescein scFv Fc fusion band was observed at 48 hours (position indicated by the arrow), and the band intensity further increased at 120 hours.
  • maintaining at 10 ° C for 17 hours maintaining at 23 ° C rather than maintaining at 8.5 ° C resulted in a stronger band intensity both when maintained for 48 hours and when maintained for 120 hours. It was found that the progress of refolding can be promoted by maintaining at 10 ° C for 17 hours after dilution and then increasing to 23 ° C.
  • Step (1) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • 0.3 ml of a solubilized solution of HyHEL-10 scFv (lauroyl-L-Glu concentration, 2.5%, scFv concentration, 3.0 mg / ml) was obtained.
  • Step (2) Dilution with additive
  • Step (B): Formation of disulfide bond Add 0.65 ml of each buffer plus 5.85 ml and dilute 10-fold, lauroyl-L-Glu concentration to 0.3%, arginine hydrochloride concentration to 0.8 M, oxidized glutathione and reduced glutathione Were adjusted to 1 mM and HyHEL-10 scFv concentration to 0.12 mg / ml, respectively. After maintaining at 10 ° C for 17 hours, the mixture was heated at 35 ° C for 2 hours.
  • Step (C): Purification The solution obtained above was concentrated 15 times using an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra-15, molecular weight fraction 10 kDa, manufactured by Millipore), and 0.1 M sodium phosphate, 0.2 M arginine hydrochloride, pH 6.8. The equilibrated Superdex 75 GL (10 mm x 300 mm) was loaded and fractionated purified scFv.
  • Step (1) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • Step (2) Solubilization of denatured protein with surfactant
  • Step (3) Dilution before dilution with additives
  • To the resulting solubilized solution 2.1 ml of 20 mM sodium phosphate, pH 8.0 was added, and after stirring, maintained at 5 ° C. for 30 minutes (lauroyl-L-Glu, 1%).
  • Step (2) Dilution with additive
  • a buffer solution containing arginine hydrochloride as an additive and oxidized glutathione and reduced glutathione as redox substances was added to make a total volume of 34.50 mL (10-fold dilution).
  • This solution has a lauroyl-L-Glu concentration of 0.3%, an arginine hydrochloride concentration of 0.8 M, oxidized glutathione and reduced glutathione concentrations of 1 mM, and an anti-fluorescein scFv concentration of 0.2 mg / ml, respectively. It was adjusted.
  • Superdex 75 pg (2.6 cm x 60 cm) was loaded to fractionate anti-Fluorescein scFv.
  • the obtained fraction was subjected to gel filtration HPLC and non-reducing SDS-PAGE used in Example 5, and it was confirmed that anti-fluorescein scFv had high purity.
  • the obtained fraction was further subjected to field flow fractionation equipped with a multi-angle light scattering apparatus, and an observed value of molecular weight 35200 was obtained. From this, it was confirmed that anti-fluorescein scFv formed a monomer in an aqueous solution.
  • This purified anti-fluorescein scFv (7.9 ⁇ M) was further added dropwise to a 0.6 ⁇ M Fluorescein (Wako Pure Chemicals) solution dissolved in 100 mM Tris hydrochloride and maintained at 23 ° C. for 1 hour, and then fluorescein fluorescence (excitation wavelength, 480 nm; fluorescence wavelength, 515 nm).
  • Fluorescein fluorescence decreased according to the amount of anti-Fluorescein scFv dropped. From this, it was found that anti-fluorescein scFv was able to reconstitute the target natural state structure.
  • the analysis results are shown in FIG.
  • HyHEL-10 and anti-fluorescein scFv were refolded using the step dialysis method of Tsumoto et al. (The Journal of Biological Chemistry 278 (11), 8979-8987 (2003)).
  • the insoluble granules of HyHEL-10 and anti-Fluorescein scFv used in Example 5 and Example 9 (containing 8.8 mg and 1.83 mg of scFv, respectively) were mixed with 20 mM sodium phosphate containing 6M guanidine hydrochloride, pH 8.5, 43.75 each. Suspended in 9.13 ml and solubilized at 37 ° C. for 30 minutes.
  • DTT was added to a final concentration of 13 mM and heated at 37 ° C. for 1 hour to reduce SS bonds.
  • 0.5 ml was dialyzed sequentially against 8.5 ml of 100 ml of external dialysis solution 1 to 6, and the dialyzed solution was collected at 65 hours.
  • composition of the dialysis solution is as follows: 1. 10 mM sodium phosphate, 6 M guanidine hydrochloride, pH 8 2. 10 mM sodium phosphate, 3 M guanidine hydrochloride, pH 8 3. 10 mM sodium phosphate, 2 M guanidine hydrochloride, pH 8 4. 20 mM sodium phosphate, 1 M guanidine hydrochloride, 0.4 M arginine hydrochloride, 1 mM oxidized glutathione, 1 mM reduced glutathione, pH 8 5.
  • the dialyzed internal solution was centrifuged (12000 g, 10 minutes), and the obtained supernatant was subjected to gel filtration HPLC (column: Superdex 75 GL, 10 ⁇ 300 mm, manufactured by GE Healthcare Biosciences; developed as in Example 5).
  • Solvent 0.1 M sodium phosphate, 0.2 M arginine hydrochloride, pH 6.8; flow rate: 0.8 ml / min; HyHEL-10 2.02 cm 2 / mg, anti-fluorescein scFv 1.3 cm2 / mg as extinction coefficient for quantification) And the refolding rate was calculated.
  • HyHEL-10 was 9.9% and anti-fluorescein scFv was 5.5%, respectively, and the refolding rates of Example 5 (quantitative scFv recovery rate, FIG. 6) and Example 9 (45%, FIG. 12) were large. Below.
  • the amount of rhIL-6 solubilized with various surfactants (Reference Example 1) is shown.
  • the amount of rhIL-6 solubilized with various surfactants (Reference Example 2) is shown.
  • concentration has on the amount of rhIL-6 solubilization is shown.
  • concentration, the maximum fluorescence wavelength, and the maximum fluorescence intensity is shown.
  • concentration is shown.
  • concentration has on the refolding rate of HyHEL-10 scFv is shown.
  • the influence (Example 5) which the ratio of an oxidized glutathione and a reduced glutathione has on the refolding rate of HyHEL-10 scFv is shown.
  • concentration has on the refolding rate of anti- Fluorescein scFv is shown.
  • Example 8 The influence (Example 8) which the heating time has on the refolding rate of anti- Fluorescein scFv is shown.
  • the anti-fluorescein scFv refolding rate (Example 9) when maintained at 5 ° C, 10 ° C or 15 ° C for 18.5 hours, further maintained at 23 ° C for 24 hours, and further maintained at 45 ° C for 4 hours. Show.
  • FIG. 13 shows changes in the Fab band when lane numbers 2 to 13 in FIG. 13 are diluted 10-fold and concentrated 10-fold (Example 10).
  • the anti-Fluorescein scFv Fc fusion band (Example 12) is shown when maintained at 8.5 ° C or 23 ° C for 48 hours or 120 hours after being maintained at 10 ° C for 17 hours.
  • a gel filtration HPLC diagram of HyHEL-10 scFv after purification by an ultrafiltration membrane and a HELHyHEL-10 scFv band (Example 13) are shown.
  • a diagram of gel filtration HPLC of anti-Fluorescein scFv after purification with an ultrafiltration membrane and an anti-Fluorescein scFv band (Example 14) are shown.

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Abstract

　本発明により、ラウロイルグルタミン酸等特定の界面活性剤の1～3％水溶液に、高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得、得られた可溶化液を0.1～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸等の特定の界面活性剤を0.02～0.275％に低下させることにより、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を製造する方法を提供する。本発明によれば、タンパク質から界面活性剤を円滑に脱離すると同時に、タンパク質に天然状態の高次構造を簡便に回復させることができる。

Description

タンパク質のリフォールディング方法
　本発明は、不溶化したか又は高次構造を失ったために、活性や安定性を失ったタンパク質に天然状態の高次構造を回復させる方法（リフォールディング方法）に関する。
　大腸菌等を生産宿主に用いて遺伝子組み換えタンパク質を調製すると、水に不溶性の変性タンパク質が得られることがある。このようなタンパク質は変性タンパク質とも呼ばれる。変性タンパク質は活性や安定性を失っているため、そのタンパク質を医薬品等として用いるには、天然状態の高次構造を有するよう導く必要がある。タンパク質のリフォールディング方法は、このような場合に用いることができる方法として知られている。
　しかし、このリフォールディングに使用する試薬や操作方法は、タンパク質ごとに適切に選択する必要があるため、リフォールディングの経験を有さないものにとっては簡単に実行できる技術ではない。また、十分な経験を有している場合でも、タンパク質が複雑な高次構造を持ち、リフォールディングの途中で会合・凝集を起こしやすい場合は、容易には天然状態を獲得できないこともある。
　これら問題を解決するため、いくつかの新しいリフォールディング方法が提案されてきた。例えば、クロマトグラフィーカラムを用いて会合凝集リスクを下げるカラムリフォールディング法（非特許文献１）、目的物を担体に固定化して会合凝集を抑制する固定化リフォールディング法（非特許文献２）、酸性や塩基性緩衝液を変性剤の代わりに用いて部分変性状態で可溶化するpH抽出法（非特許文献３）、分子シャペロンを共存させる方法（非特許文献４）、逆ミセルを分子シャペロン様に使用する方法（非特許文献５）、界面活性剤のミセルを利用する方法（非特許文献６）、3000気圧を超える超高圧下で変性剤を用いずに抽出する高圧リフォールディング法（非特許文献７）、これらの併用法あるいは変法がこれまでに報告されている。
　これらの中でもっとも注目を集めた技術は、変性剤抽出したタンパク質を、界面活性剤を含む緩衝液に希釈して会合凝集を抑制しつつ部分的に構造を回復させ、次のステップでシクロデキストリンなどの界面活性剤結合剤を使ってタンパク質から界面活性剤を強制的に脱離させて構造形成を完了させる、多段式リフォールディング法の「人工シャペロン系」であった。この技術の長所は、試行錯誤実験をほとんど必要とせず、決められた方法に従っていくつかの条件を検索するだけで、もっとも深刻な問題である会合凝集を効果的に抑制できるということであるとされていた。この技術でリフォールディングに成功した例も報告され、この方法の変法も引き続き研究されている（非特許文献８）。
　しかしながら、人工シャペロン系の適用例が増えるに従い、添加された界面活性剤をタンパク質から脱離するのは報告されていたほど簡単ではないこと、適正な操作条件を見出すための煩雑な実験が依然として必要なことなどがわかってきた。又、多段操作がプロセスの煩雑さにつながり、工業生産への利用に制限を与えるとの指摘も出た（非特許文献９）。
　このように、もっとも評価の高かった人工シャペロン系ですら、経験を有さない者が、容易かつ効果的にタンパク質をリフォールディングする方法としては不十分であった。
　他方、アシル化サルコシンを用いてタンパク質をリフォールディングさせる方法が知られているが、アシル化サルコシンは、希釈しただけではタンパク質から脱離できず、特別の方法で除去しなければ、タンパク質の天然状態の高次構造を回復させることができない（非特許文献１０、特許文献１）。強アルカリに調整されたラウロイル-L-グルタミン酸を含む界面活性剤溶液を用いて不溶性ウシ成長ホルモンを可溶化し、限外ろ過法によって界面活性剤濃度を下げてリフォールディングする方法も知られているが（特許文献２）、この方法では成長ホルモン以外のタンパク質の天然状態を効果的に回復することは難しい。また、強度のアルカリ性pHにタンパク質を接触させることでタンパク質に修復不能な、脱アミド反応などの化学変化を起こしてしまう。
EP 0263902 A US Patent 6410694 A. Jungbauer, W. Kaar, R. Schlegl: Current opinion in Biotechnology 15, 487-494 (2004) M Matsubara, et al.: FEBS LETT., 342, 193-196 (1994) S. M. Singh and A. K. Panda: Journal of Bioscience and Bioengineering 99, 303-310 (2005) D. Rozeman and S. H. Gellman: Journal of Biological Chemistry 271, 3478-3487 (1996) A. J. Hagen, T. A. Hatton, and D. I. C. Wang: Biotechnol Bioeng. 35, 955-965 (1990) G. Zardeneta and P. H. Horowitz: Analytical Biochemistry 223, 1-6 (1994) M. B. Seefeldt, Y. S. Kim, J. Carpenter, T. W. Randolph: Protein Science 14, 2258-2266 (2005) S. Machida, S. Ogawa, S. Xiaohua, T. Takaha, K. Fujii, K. Hayashi: FEBS Lett. 486, 131-135 (2000) H. Lanckriet and A. P. J. Middelberg: Biotechnology Progress 20, 1861-1867 (2004) Richard Burgess: Methods in Enzymology. 273, 145-149 (1996)
　従って、本発明は、タンパク質から界面活性剤を円滑に脱離すると同時に、タンパク質に天然状態の高次構造を回復させる、簡便なリフォールディング方法を提供することを目的とする。
　本発明者らが鋭意検討した結果、特定の界面活性剤水溶液を用いて変性タンパク質を可溶化し、その可溶化液をアルギニンやアルギニン誘導体を含む緩衝液に希釈するだけで、特定界面活性剤を変性タンパク質から脱離するのと同時に該変性タンパク質に高次構造を回復させることを見出した。
　すなわち、本発明は、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を製造する方法において、
（1）Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤の1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
（2）得られた可溶化液を、0.05～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02～0.5％に低下させる工程、
（3）その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を回収する工程、
を含む、前記製造方法を提供する。
　本発明はまた、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
（1）Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
（2）得られた可溶化液を、0.05～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02～0.5％に低下させる工程、
を含む前記方法を提供する。
　本発明はまた、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を得る方法において、
（1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
（2）得られた可溶化液を0.1～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02～0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法を提供する。
　本発明はまた、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
（1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
（2）得られた可溶化液を0.1～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02～0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法を提供する。
　本発明によれば、リフォールディングの経験や特別な装置も必要とせず、簡便かつ効果的にタンパク質をリフォールディングすることができる。本発明によればまた、タンパク質が天然状態の高次構造を回復する過程で起こり得るタンパク質の会合・凝集を抑制できる。
　如何なる理論にも拘束されるものではないが、通常は、界面活性剤がタンパク質から脱離するのと同時にタンパク質が会合・凝集してしまうが、本発明により、特定の界面活性剤を用いて変性タンパク質を伸ばした後、希釈し、その希釈液にアルギニン又はアルギニン誘導体を添加すると、本発明で用いる特定の界面活性剤がタンパク質から脱離するのと同時に、アルギニン又はアルギニン誘導体がタンパク質の会合・凝集性を抑制することができるものと考えられる。
〔タンパク質〕
　本発明において使用できるタンパク質は、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質である。不溶化したタンパク質と高次構造を失ったタンパク質とは明確には区別できず、その高次構造が天然状態のものと異なるものであれば本発明において使用できる。2次構造が主にα－ヘリックスからなるタンパク質（例えばIL-6）、β－シートからなるタンパク質（例えばscFvやFab）、又は双方からなるタンパク質（例えばトランスグルタミナーゼ）に適用できる。単量体タンパク質（IL-6など）であっても、多量体タンパク質（Fabなど）であっても適用できる。分子内あるいは分子間にジスルフィド結合を有さないタンパク質（例えばトランスグルタミナーゼ）であっても、該結合を有するタンパク質（例えばIL-6、scFv、Fab）であっても適用できる。
　例えば、大腸菌などの微生物を生産宿主にして調製された不溶性の遺伝子組み換えタンパク質は、通常、100gの水に対する溶解度が0.001g以下（25℃）であるので、本発明において使用できる。可溶性状態からなんらかのストレスを受けて不溶化したタンパク質でもよい。タンパク質の形態は特に制限されず、例えば顆粒状でも粉末状でも線維状でもよい。タンパク質の一次構造や二次構造の特徴で制限されることはない。単量体かオリゴマー構造のいずれかも関係しない。タンパク質の断片でも使用できる。例えば、重量平均分子量（室温条件下、超遠心分析法や静的光散乱分析法で測定）にして5000ダルトンのものから150000ダルトンのものまで本発明において使用することができる。
　具体的には、ヒトインターロイキン-6のようなサイトカイン；成長因子、各種ホルモン、分化誘導因子などの特定の高次構造を獲得することで機能を発揮するタンパク質性リガンド；トランスグルタミナーゼなどの酵素；タンパク質性酵素阻害剤；及びイムノグロブリン構造を持つ抗体関連分子があげられる。
　抗体関連分子としては、抗体可変領域（Fv、fragment of variable region）、単鎖抗体可変領域（scFv、single chain Fv）、抗原結合部位（Fab、fragment of antigen binding）、抗原結合部位（Fab'）、2価の抗原結合部位（F(ab')2）等の抗体断片；二重特異性を示す単鎖抗体可変領域（bispecific single chain Fv）又はダイアボディ（Diabody）、抗体可変領域と抗体Fcドメインの一部を融合させて2量体化させた人工的な小型抗体（Minibody）等の人工抗体；抗原結合部位又は抗体可変領域を構成するドメインのうちの軽鎖由来か重鎖由来の単独のドメインからなるシングルドメイン抗体（single-domain antibody）、タンパク質やペプチドを抗体Fcドメインに融合させたFc融合タンパク質（Fc Fusion Protein）などがあげられる。
　より具体的には、HyHEL-10 scFvのような単鎖抗体可変領域（scFv）、例えばPexelizumab（scFv）、抗原結合部位（Fab）としてAbciximab(商品名、ReoPro)、ranibizumab（商品名、LUCENTIS）又はCertolizumab（商品名、Cimzia）、抗Fluorescein scFv Fc fusionのようなFc融合タンパク質（Fc Fusion Protein）、例えばromiplostim （商品名、Nplate）、rilonacept（商品名、ARCALYST）、abatacept（商品名、ORENCIA）又はalefacept（商品名、AMEVIVE）などが不溶化したか又は高次構造を失ったものがあげられる。特に、抗体断片が好ましい。これら抗体関連分子の構造は、公知論文、例えばHolliger P. and Hudson PJ. Nature Biotechnology 23 (9), 1126-1136 (2005)に詳しく述べられている。
　イムノグロブリン構造以外の例えばアンキリンリピートやフィブロネクチンタイプIIIドメインやリポカリンなどを足場構造にして作られた人工的な親和性分子もまた本発明において使用することができる。
  前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質が、イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質であるのが好ましい。
　前記イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質が、抗体ドメインの一部を有する抗体断片、ダイアボディまたは小型抗体の人工抗体又はFc融合タンパク質であるのがより好ましい。
　前記抗体ドメインの一部を有する抗体断片は、scFv、Fab、Fab'又は（F(ab')2）であるのが好ましい。
　前記Fc融合タンパク質は、サイトカイン、受容体細胞外ドメイン又はペプチドを、抗体Fcドメインに融合させたものであるのが好ましい。
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
■　界面活性剤の種類
　本発明において、Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン（ラウロイルサルコシン、ラウロイル-Sar）、デカノイルアラニン（ラウロイルアラニン、ラウロイル-Ala）、デカン酸又はこれらの又はこれらの塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド（LTAC）及びこれらの混合物は、不溶化したか又は高次構造を失って非天然形状になったタンパク質を水中で引き伸ばすことのできる界面活性剤（可溶化剤）として機能する。
　前記界面活性剤が、Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン又はこれらの塩であるのが好ましい。Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸又はその塩であるのがより好ましい。前記Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸が、ラウロイルグルタミン酸（ラウロイル-Glu）、ラウロイルアルパラギン酸（ラウロイル-Asp）又はラウロイルイミノジ酢酸であるのがさらに好ましい。
　本発明に用いるラウロイル-Glu、ラウロイル-Asp、ラウロイル-Sar、ラウロイル-Alaは、D体、L体、DL体のいずれであっても良い。不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質がIL-６等のサイトカインやトランスグルタミナーゼ等の酵素の場合、ラウロイル-Glu、ラウロイル-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸、又はこれらの塩、或いはこれらの混合物を用いるのが好ましい。界面活性剤としては、ラウロイル-L-Gluがあらゆる不溶性タンパク質の可溶化力に優れ、希釈されたときにタンパク質に結合し続けることなく容易に除去できることに加えて、高純度のラウロイル-L-Glu試薬を安価に入手できることから、特に好ましい。
■　界面活性剤の濃度
　ラウロイル-Glu、ラウロイル-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸、ラウロイル-Sar、ラウロイル-Ala、デカン酸またはLTACは、1～3％、好ましくは1.5～2.8％、更に好ましくは1.75～2.5％の水溶液とする。このような濃度範囲であれば、タンパク質の可溶化効率を十分に高めると共に、その次の操作である希釈の倍率を適度にとどめることができる。
■　ｐＨ
　該水溶液の25℃におけるpHは、変性タンパク質の性質に合わせ、pH 6.5～9.0、好ましくはpH 7.0～8.5の緩和な条件を選択できる。なお、本発明において、pHは、pH電極を装着したpHメーターにより測定できる。pH調整は、水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて行うことができる。該水溶液として緩衝液を使用してもよい。
■　接触温度及び時間
　斯様にして調製した界面活性剤水溶液と、変性タンパク質とを接触させて、タンパク質の可溶化液を得る。界面活性剤水溶液に変性タンパク質を添加してもよいし、変性タンパク質に界面活性剤水溶液を添加してもよい。接触は、通常5～40℃において、好ましくは15 ～40 ℃において放置することにより行うことができる。このような範囲であれば化学反応による切断や酸化などの修飾が最小限に抑制されるので好ましい。放置時間は通常0.1～3.0時間、好ましくは0.5～1.0時間である。このような範囲であれば、化学反応による切断や酸化などの修飾が最小限に抑制されるので好ましい。接触中に攪拌してもよい。
　変性タンパク質又は可溶化水溶液の量は、可溶化されたタンパク質濃度が1～20 mg/mlになるように調整すると、続く希釈過程においても極端にタンパク質濃度が低下しないので好ましい。
　タンパク質が可溶化されたかどうかは、例えば目視による濁度判定、あるいは280 nmでの紫外線吸収スペクトル法などにより確認することができる。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
■　希釈倍率
　続いて、この可溶化液を、添加剤としてアルギニン又はアルギニン誘導体を含む緩衝液に10～数10倍程度の希釈倍率で希釈し、タンパク質が天然状態の高次構造を回復するまで、そのまま維持する。希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02～0.5％、好ましくは0.04～0.35%、更に好ましくは0.05～0.30%となるように希釈する。界面活性剤は、この希釈によってタンパク質から直ちに脱離し、タンパク質は高次構造を形成する。希釈は、１段、多段（ステップ勾配）又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。
　前記タンパク質がIL-６等のサイトカインやトランスグルタミナーゼ等の酵素の場合、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02～0.275％、好ましくは0.04～0.125％、更に好ましくは0.05～0.10％となるように希釈するのが好ましい。
　前記タンパク質が抗体断片の場合、中でもscFvの場合、上述したサイトカインや酵素の場合よりも希釈倍率は小さくても良い。具体的には、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02～0.5％、好ましくは0.05～0.4％、更に好ましくは0.1～0.3％となるように希釈するのが好ましい。希釈濃度がこれらより低い場合でも、本発明で規定する範囲内であれば、タンパク質の天然状態の高次構造を回復させることができることは言うまでもない。
　前記抗体断片の中でもFab、Fab'及びF(ab')2の場合、一段階で希釈してもよいし、二段階以上の多段階で希釈してもよいが、多段階で希釈した方がリフォールディング率がより向上するので好ましい。一段階で希釈する場合、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02～0.08 ％、好ましくは0.03～0.07 ％、更に好ましくは0.04～0.06 ％となるように希釈するのが好ましい。多段階で希釈する場合、第一段階における希釈は、上述したscFvの場合と同程度の希釈倍率で行うことができる。最終段階における希釈が、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02～0.08％、好ましくは0.03～0.07 ％、更に好ましくは0.04～0.06 ％となるように希釈するのが好ましい。漸次的に希釈してもよい。その場合、希釈後の最終濃度が0.02～0.08％、好ましくは0.03～0.07 ％、更に好ましくは0.04～0.06 ％となるように希釈するのが好ましい。
　このような範囲であれば、天然状態の高次構造回復が促進され、タンパク質の安定性も確保されるので好ましい。タンパク質が天然状態の高次構造を回復したかどうかは、CDスペクトルや蛍光スペクトルなどの分光測定、あるいはHPLCなどタンパク質の物理化学的特性を観察する方法、あるいは酵素活性等の高次構造指標により確認することができる。
■　添加剤の種類
　添加剤として用いるアルギニンはL型でもD型でも良い。塩酸塩等の無機酸との塩、あるいは酢酸塩などの有機酸との塩を形成していてもよい。アルギニン誘導体としては、アセチルアルギニン、N-ブチロイルアルギニン等の炭素数１～６のアシル基を有するアルギニン；カルボキシル基を除去したアグマチン；αアミノ基の替わりに水酸基を導入したアルギニン酸等があげられる。アルギニン誘導体としては、アシル化アルギニンが好ましく、N-ブチロイルアルギニンがより好ましい。添加剤としてはアルギニン塩酸塩が最も好ましい。
■　ｐＨ
　緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス塩酸塩等を用いることができる。pHは、天然状態を回復するタンパク質の性質に合ったpHであればよく、概ねpH 6.5～9.0に収まる中性pHである。従って、工程（2）におけるpHはこの範囲にあればよく、工程（1）におけるpHと異なっていてもよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる。
■　添加剤濃度
　添加剤濃度は、天然状態を回復するタンパク質の性質に応じて個別に選択されるが、0.05～1.2M、好ましく0.06～1.0M、更に好ましくは0.08～0.8Mである。このような範囲であれば、天然状態の高次構造回復が促進され、続く精製工程を阻害することがないので好ましい。
　タンパク質がIL-６等のサイトカインやトランスグルタミナーゼ等の酵素の場合、添加剤濃度は好ましくは0.1～1.2M、好ましく0.2～1.0M、更に好ましくは0.4～0.8Mである。
　前記タンパク質が抗体断片、中でもscFvの場合、添加剤濃度は好ましくは0.2～1.0 M、更に好ましくは0.4 ～0.8 Mである。
　前記抗体断片の中でもFab、Fab'及びF(ab')2の場合、添加剤濃度は好ましくは0.05～0.3M、更に好ましくは0.08～0.12 Mである。二段階以上に分けて希釈する場合、第一段階における希釈は、上述したscFvの場合と同程度の希釈倍率で行うことができる。最終段階における希釈が、希釈後の添加剤の濃度を、0.05～0.3 M、好ましくは0.06～0.2 M、更に好ましくは0.08～0.12 Mとなるように希釈するのが好ましい。希釈は、１段、多段（ステップ勾配）又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。
■　希釈温度・保持時間
　希釈は、室温下で実施してもよく、目的タンパク質が天然状態を回復した際の熱安定性が十分に高くない場合は5～10℃で実施してもよい。たとえば、ヒトインターロイキン-6（rhIL-6）の場合、添加剤溶液で希釈後、室温で1分間程度維持すればよい。トランスグルタミナーゼの場合、室温では2時間以上維持すればよい。5～10℃で維持する場合は更に長い時間維持する必要がある。
　一般に、高めの温度で維持すると維持時間は短くなるが、目的タンパク質が抗体関連分子の場合、IL-6やトランスグルタミナーゼ等のサイトカインの場合よりも低めの温度で長い時間をかけて維持するのが良い。こうすることで、リフォールディング率がより向上する。５～４８℃で１時間～５日間維持するのが特に好ましい。
　特に、抗体関連分子が抗体断片の場合、中でもscFvの場合は、5 ℃～15 ℃にて、好ましくは7 ℃から13 ℃にて、更に好ましくは8 ℃～12 ℃にて、10時間～24時間、好ましくは12時間～20時間、更に好ましくは15時間～18時間維持するのが望ましい。その間の抗体関連分子の会合凝集は抑制されている。
　その後、この希釈液を加温し、さらに数時間から数日間維持してもよい。好ましくは15℃～48 ℃にて、好ましくは20 ℃～46 ℃にて、更に好ましくは23 ℃～45 ℃にて、1時間～5日間、好ましくは1.5時間～3日間、更に好ましくは2時間～24時間維持するのが望ましい。
　抗体断片がFab、Fab'及びF(ab')2の場合、一段階で希釈する場合は5～15 ℃において、10～72時間維持するのが好ましい。7～13 ℃において12～20時間維持するのがより好ましい。多段階で希釈する場合、第一段階における希釈は5 ℃～15 ℃にて、好ましくは7 ℃から13 ℃にて、更に好ましくは8 ℃～12 ℃にて、10時間～24時間、好ましくは12時間～20時間、更に好ましくは15時間～18時間維持するのが望ましい。その間の抗体関連分子の会合凝集は抑制されている。
　その後、この希釈液を加温し、さらに数時間から数日間維持してもよい。好ましくは15 ℃～48 ℃にて、好ましくは20 ℃～46 ℃にて、更に好ましくは23 ℃～45 ℃にて、1時間～5日間、好ましくは1.5時間～3日間、更に好ましくは2時間～24時間維持するのが好ましい。温度調節は、１段、多段（ステップ勾配）又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。
　漸次的に希釈してもよい。その場合、５～１５℃に１０～７２時間かけて希釈するのが好ましい。
　希釈を数段階に分けて行う場合は、最終段階の希釈の後に希釈倍率を相殺する分だけ、例えば限外ろ過膜により濃縮することで、最終段階の希釈後のタンパク質濃度を0.05～1.0 mg/mlに、好ましくは0.1～0.5 mg/mlに、更に好ましくは0.15～0.3 mg/mlに保ち、Fabを構成する重鎖と軽鎖のジスルフィド結合形成を促進する。
　なお、従来の抗体関連分子のリフォールディングでは、分子を構成するドメインごとのリフォールディング速度が不ぞろいなため、リフォールディング中に会合凝集が起こりやすく、リフォールディング率は低値にとどまっていた。この問題を解決するために、津本らは段階透析法によるリフォールディング方法（The Journal of Biological Chemistry 278 (11), 8979-8987 (2003)）を提案した。この方法は、変性タンパク質（単鎖抗体可変領域、scFv）溶液中の高濃度のタンパク質変性剤（塩酸グアニジン）を6段階の透析操作によって、ゆっくりと段階的に除去することで、単純な希釈法などでは頻繁に生じた会合凝集によるタンパク質の損失を防ぐことのできた、優れた方法であった。しかし、この方法は6段階もの透析を行うためにリフォールディング操作時間が長く、その間にタンパク質が化学修飾を受けたり、凝集性の高い構造形成中間状態の形成される場合は、逆に会合凝集を促進してしまう懸念もあった。植田らは、津本らの方法を一部改良することで、抗原結合部位（Fab）のリフォールディングを可能としたが（The Journal of Biochemistry 141 (5), 699-707 (2007)、この場合は4段階の透析を行うために130時間という長時間を要した上に、リフォールディング率は最高で24 %であり、効率の良いリフォールディング方法とはいえなかった。
　しかし、以上述べたとおり、本発明によると、抗体関連分子のリフォールディングに必要な時間は、ゲルろ過HPLCや電気泳動又は抗体関連分子の活性を測定することで、抗体関連分子ごとに適切に決めることができる。多くの場合は40時間程度であり、段階透析法を代表とする従来の抗体関連分子リフォールディング方法よりも大幅に短縮される。
〔任意工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
　タンパク質によっては、上記範囲に希釈するのに先立ち、リン酸緩衝溶液等を添加することにより予め希釈してもよい。具体的には、前記工程（1）と工程（2）との間に、界面活性剤の濃度が0.8～1.5％に、好ましくは1％になるように希釈するのが望ましい。希釈後、好ましくは5～40℃、より好ましくは5～30℃、例えば室温で、好ましくは0.5時間以上放置することで、タンパク質の高次構造の回復率を更に高めることができる。可溶化に用いた時間と同程度以上放置すれば十分である。界面活性剤の濃度が0.8～1％になるように希釈し、得られた希釈液を5～40℃で30分以上維持するのが特に好ましい。
　特に、目的タンパク質が抗体関連分子であって、該抗体関連分子が抗体断片の場合、中でもscFvの場合、5 ℃～15 ℃にて、好ましくは7 ℃から13 ℃にて、更に好ましくは8 ℃～12 ℃にて、10時間～24時間、好ましくは12時間～20時間、更に好ましくは15時間～18時間、維持する。維持される間に、抗体関連分子は会合凝集を進行させることなく、天然状態に近づく。
　抗体断片がFab、Fab'及びF(ab')2の場合、添加剤としてアルギニン又はアルギニン誘導体を含む緩衝液に希釈し、ラウロイル-Glu濃度を0.05～0.5 %に、好ましくは0.08～0.4 %に、更に好ましくは0.1～0.3 %に、アルギニン濃度を0.6～1.2 Mに、好ましくは0.7～1.1 Mに、更に好ましくは0.8～1.0 Mに調整する。
　このとき得られた希釈液の25℃におけるｐＨは、pH 6.5～9.0の範囲にあればよく、工程（1）におけるpHと異なっていてもよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる
　この希釈によって高次構造の回復されたタンパク質の濃度は、希釈に用いたタンパク質の量と性質、希釈の倍率と関係して、0.02～1mg/mlに達する。
〔任意工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　タンパク質によっては、単一の分子内に、多量体タンパク質の場合は分子間にジスルフィド結合を有することがある。タンパク質に酸化還元反応をさせてこれらジスルフィド結合の形成を促進すると、リフォールディング率がより向上するので好ましい。
　酸化還元反応は、チオール・ジスルフィド交換反応を促進して、分子内や分子間のジスルフィド結合を形成させるための酸化還元物質（例えば、酸化型グルタチオン（GSSG）と還元型グルタチオン（GSH）との混合物、又はシスチンとシステインの混合物、又はシスタミンとシステアミンの混合物、又は酸化型グルタチオンあるいはシスチンとメルカプトエタノールの混合物、など））や、空気酸化を促進するための銅イオンを共存させることにより行うことができるし、タンパク質の酸化還元電位を変化させることにより行うこともできる。酸化還元物質を使用するのが好ましい。
　酸化還元反応は、前記工程（1）の後であればいつ行っても良く、例えば前記工程（2）において酸化還元物質を添加剤と共に可溶化液に添加することにより行っても良いし、前記工程（2）において希釈液を得た後に該希釈液に酸化還元物質を添加することにより行っても良い。
　酸化還元物質や銅イオンの濃度は、天然状態を回復するタンパク質ごとに適正な濃度に調整される。
　このときの25℃におけるｐＨは、pH 6.5～9.0の範囲にあればよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる。
　液温は、工程（1）で得られる可溶化液の温度と同程度でもよいし、工程（2）で得られる可溶化液の温度と同程度でもよい。酸化還元反応を促進させるには、５～４８℃程度が好ましい。
　酸化還元反応後、５～４８℃で１時間～５日間（１２０時間）程度放置してもよい。
　本発明の方法によれば、リフォールディング率は少なくとも30 ％であり、多くの場合70％に達する。
〔任意工程（C）：精製〕
　高次構造を回復したタンパク質は、通常の方法、例えば限外ろ過、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等によって精製することができる。
　以下に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
（参考例１）
　タンパク質として、遺伝子組み換え大腸菌を用いて調製されたヒトインターロイキン-6（rhIL-6；特許第3200850号）を用いた。該rhIL-6は水不溶性（25℃の水100ｇに対する溶解度：0.001 g以下）であり、その形態は顆粒である。該不溶性顆粒をエッペンドルフチューブ（ポリプロピレン製；エッペンドルフ社）の1本あたりにrhIL-6で4 mgずつ小分け分注した。該不溶性顆粒に含有されるrhIL-6量は、既報（特許第3200850号）に記載された逆相HPLC法によって予め定量しておいた。
　ここへ、ラウロイル-L-Glu、ラウロイル-L-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸、デカノイルSar、デカノイルL-Ala、デカン酸又はラウリルトリメチルアンモニウムクロリドの最終濃度が2％になるよう、また、rhIL-6抽出濃度が4mg/mlになるように、予め5 %に調製された界面活性剤と純水（ミリQ水）を適宜添加して最終的に1 mlに調整し、室温で2時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。
　比較のために、以下に示す界面活性剤を用いて同様の操作を行った。アニオン性界面活性剤を使用する場合、NaOHを用いて水溶液の濃度をpH 7.0（25℃）に調整した。
　比較に用いた界面活性剤：ウンデカノイルL-Glu、トリデカノイルL-Glu、ミリストイルL-Glu、ラウロイルDL-Glu、ラウロイルγ-Glu-Glu、ラウロイルα-Glu-Glu、デカノイル-L-Asp、デカノイル-DL-Asp、ミリストイルSar、ラウロイルL-Ala、ミリストイルL-Ala、ラウロイルDL-Ala、ラウロイルGly、ラウロイルL-Val、ラウロイルL-Leu、ラウロイルL-Ile、ラウロイルL-The、ラウロイルL-Phe、ラウロイルL-Tyr、ラウロイルL-Met、ラウロイルL-Gln、ラウロイルL-PCA、ラウロイルL-Pro、ラウロイルL-GABA、ラウロイルL-Cit、ラウリルコハク酸（以上はすべて味の素（株）にて調製）、ラウロイル-Sar（ナカライテスク製）、POE(20)モノオレイン酸ソルビタン（Tween-80；ナカライテスク製）、POE(9,10)ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（Triton X-100；ナカライテスク製）、POE(20)モノパルミチン酸ソルビタン（Tween-20；バイオラッド製）、ラウロイル-N-Me-タウリン（ニッコールLMT；日光ケミカル製）、ラウロイル-N-Me-β-Ala（川研ファインケミカル製）、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタン（ソフダゾリンLPB；川研ファインケミカル製）、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロリド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ラウリン酸（以上は東京化成製）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬製）、SLES（Sodium laurylethersulfate、エマール 270 D/B；花王製）、ラウリルアミノベタイン（アンヒトール20 AB；花王製）、ミリスチルアミノベタイン（アンヒトール24 AB；花王製）、ラウリルスルホベタイン（SB-12；シグマ・アルギニンドリッチ製）、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸（CHAPS；同仁化学研究所製）。
　各抽出液に、還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンをそれぞれ最終的に10μM、2μMになるよう添加し、室温で終夜放置して分子内ジスルフィド結合を形成させた。ジスルフィド結合の形成は逆相HPLC法（カラム、Vydac 214-TP5410（Separations Group）；溶離液、A/0.1 ％ TFA 　B/0.1 ％ TFA + 80 ％アセトニトリル；流速、1 ml/min；溶出条件、30 ％ Bから50 ％ Bまで1.0 ％/minのリニアグラジエント）において、ピーク保持時間の変化を指標に確認した。得られた溶液50μlに、10mM リン酸ナトリウム水溶液950μl（pH 7.0、25℃）を添加して20倍希釈した（最終容量1 ml；最終界面活性剤濃度0.1 ％）。
　イオン交換HPLCにてrhIL-6標品（特許第3200850号）と同じ保持時間を示すピークが、天然状態の高次構造を有するrhIL-6であるとわかっている（Biotechnology and Bioengineering 62, 301-310 (1999)）ので、上で希釈した後の水溶液に含まれる天然状態の高次構造を形成しているrhIL-6量をイオン交換HPLCで求めた（カラム、SP-NPR（東ソー製）；溶離液、A/0.01 M 酢酸ナトリウム、ｐH 5.0　B/0.5 M 酢酸ナトリウム、pH 5.5；流速、1 ml/min；溶出条件、20％ Bから70％ Bまで10％/minのリニアグラジエント）。
　界面活性剤としてラウロイルL-Gluを用いて可溶化した場合のrhIL-6量を100％として、ラウロイル-L-Asp及びラウロイルインミノジ酢酸を用いて可溶化した場合のrhIL-6量を相対的に示した（図1）。比較用界面活性剤を用いて可溶化した場合のrhIL-6量も同様に相対的に示した（図1）。
　図１から明らかなように、ラウロイル-Asp又はラウロイルイミノジ酢酸を使用してrhIL-6を可溶化し、天然状態の高次構造を回復させた場合のrhIL-6量は、ラウロイル-Gluを使用してrhIL-6を可溶化し、天然状態の高次構造を回復させた場合のrhIL-6量に遜色がなかった。これら３種の界面活性剤を用いた場合に得られる天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は、比較用界面活性剤を用いた場合に比べて高かった。
　タンパク質のリフォールディングに従来用いられることの多かったラウロイル-Sarとセチルトリメチルアンモニウムクロライド（CTAC）を用いた場合に得られる天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は、それぞれ5％、21％と低かった。rhIL-6を含有する不溶性顆粒からrhIL-6を抽出させる力に富むと予想されたラウリルエーテル硫酸Na（SLES）やラウリン酸等のアニオン界面活性剤及び両性界面活性剤を用いた場合に得られる天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は低く、いずれも20％未満であった。タンパク質変性効果が弱いため、リフォールディングに用いられることの多いTween 20、Tween 80、Triton X-100といった非イオン性界面活性剤は、不溶性顆粒からrhIL-6を抽出する力に乏しく、不溶性顆粒を溶解させることがほとんどできなかったため、天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は3～5 ％と低かった。
（参考例２）
　不溶性顆粒から抽出、可溶化する際のrhIL-6濃度を高めた場合でも、ラウロイル-L-Glu、ラウロイル-L-Asp及びラウロイルイミノジ酢酸が、不溶化rhIL-6の天然状態の高次構造の回復に有効であるかどうかを調べた。比較のために、参考例1にてラウロイル-L-Gluに対して80 ％以上のrhIL-6量を示したラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、同じラウロイル基を持つラウロイル-Sar、ラウロイル-L-Gluにおけるアシル鎖長の効果を確認するためにウンデカノイルL-Glu、トリデカノイルL-Glu及びミリストイルL-Glu、アシル鎖の影響を確認するためにデカン酸を使用した。
　参考例１で用いたのと同じrhIL-6の不溶性顆粒を用い、その13 mgをエッペンドルフチューブに小分けした。各界面活性剤を最終濃度が2％となるようエッペンドルフチューブに添加し、10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0（25℃）の溶液1mlを得、該溶液をpH 7.0、室温で2時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。抽出濃度は13 mg/mlに調整されたことになる。参考例1と同様に、還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンをそれぞれ最終的に10 μM、2 μMになるよう添加し、室温で終夜放置して分子内ジスルフィド結合を形成させた。
　この25μlに10 mM リン酸ナトリウム水溶液（pH 7.0（25℃））975μlを添加して40倍希釈し（最終容量1 ml；最終界面活性剤濃度0.05％）、参考例１に記載したのと同様にして、高次構造を形成しているrhIL-6量をイオン交換HPLCで求めた。結果を図2に示す。
　図２から明らかなように、ラウロイル-L-Gluを使用した場合に、天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6濃度が最も高く、ラウロイルL-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸といった、分子内にアミド結合をもつ、一鎖二親水型界面活性剤を使用した場合にも高いrhIL-6濃度を示した。ラウロイル-L-Gluのアシル鎖長をC11（ウンデカノイル）へ短くしたり、C13（トリデカノイル）又はC14（ミリストイル）へ伸ばしたりすると、ラウロイル-L-Gluを使用した場合に比べてrhIL-6濃度が下がったので、アシル鎖長はC12（ラウロイル）が最適であるとわかった。アシル鎖だけのデカン酸を使用した場合にはわずかな量のrhIL-6しか回収できなかった。G-CSF（顆粒球コロニー刺激因子：Granulocyte colony-stimulating factor；US patent 5849883）や成長ホルモン（EP 0263902 A）のリフォールディングに有効とされたラウロイル-Sarは、ラウロイル-L-Gluに比べて明瞭に劣った。
（参考例３）
　不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、可溶化するための界面活性剤の濃度を検討した。
　参考例１で用いたのと同じrhIL-6の水不溶性顆粒を用い、その12.6 mgをエッペンドルフチューブに小分けした。ラウロイル-L-Gluの最終濃度が1.5％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％、3.00％となるようエッペンドルフチューブに添加し、10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0（25℃）の溶液3 mlを得た。該溶液を室温で2時間放置することにより、不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。rhIL-6が完全に抽出されたとすると、rhIL-6の抽出濃度は4.3 mg/mlに調整されたことになる。
　抽出後、上清にジチオスレイトール（DTT） 10 mMを添加し、pH 8に調整後、37 ℃で30分間加温してジスルフィド結合を還元した。この上清を逆相HPLC（カラム、Vydac 214-TP5410（Separations Group）；溶離液、A/0.1 ％ TFA 　B/0.1 ％ TFA + 80 ％アセトニトリル；流速、1 ml/min；溶出条件、30 ％ Bから50 ％ Bまで1.0 ％/minのリニアグラジエント）に供し、不溶性顆粒から可溶化されたrhIL-6量を測定した（Biotechnology and Bioengineering 62, 301-310 (1999)）。ラウロイル-L-Glu最終濃度が3.00％のときのrhIL-6量を100 ％として、各濃度におけるrhIL-6相対量を図3に示した。
　図３から明らかなように、ラウロイル-L-Glu濃度が1.50％の場合、3.00％で抽出及び可溶化した場合のrhIL-6量には及ばないものの、その80 ％弱の抽出量が得られることがわかった。ラウロイル-L-Glu濃度が1.75％以上の場合、3.00％で抽出及び可溶化した場合とほぼ同じ抽出量が得られた。この結果から、rhIL-6と同程度の疎水性を有するタンパク質であれば、1.50％のラウロイル-L-Glu濃度で抽出可能であり、3.00％のラウロイル-L-Glu濃度においても同様に抽出可能とわかった。
（参考例４）
　工程（2）において、界面活性剤で抽出されたタンパク質を希釈してリフォールディングするときの界面活性剤至適濃度を検討した。rhIL-6は、その高次構造をよく反映した蛍光スペクトルを与えるため、各濃度のラウロイル-L-Glu中でのrhIL-6最大蛍光強度とその波長を追跡することで、リフォールディングに適したラウロイル-L-Glu濃度を決定した。
　rhIL-6標品（特許第3200850号）を10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0中で0.075 mg/mlに調整し、室温において、励起波長 295 nm、蛍光波長 315～420 nmで蛍光スペクトルを測定した（FP-6500分光蛍光光度計、JASCO製）。結果を図4に示した。
　ラウロイル-L-Glu濃度が0 ％～0.1 ％の間は、rhIL-6の最大蛍光波長も蛍光強度もほとんど変化しなかった。このことから、この濃度範囲では、ラウロイル-L-Gluの結合はほとんどなく、仮にわずかに結合したとしても、rhIL-6構造が天然状態から別の状態に変化することはないとわかった。
　ラウロイル-L-Glu濃度が0.125 ％～0.275 ％の間では、最大蛍光波長は徐々に、かつ連続的に紫外側にシフトした。このことから、この濃度範囲では、ラウロイル-L-GluがrhIL-6に結合することで、一定の最大蛍光強度とその波長をもつ構造状態へと変わっていくことがわかった。
　ラウロイル-L-Glu濃度が0.967％を越えると、最大蛍光波長が赤外側にシフトした。このことから、この濃度範囲では、rhIL-6の高次構造がよりオープンに、すなわちrhIL-6高次構造が失われ始めたことがわかった。
　以上の結果より、ラウロイル-L-Glu濃度を0.1 ％よりも低くなるよう希釈することで、タンパク質の高次構造を完全に天然状態へと導けること、0.125 ％～0.275 ％に希釈することで、天然状態に近い状態へと導けることがわかった。
（参考例５）
　参考例４で判明したラウロイル-L-Glu濃度とrhIL-6高次構造との関係が、界面活性剤中に溶解されたrhIL-6状態を開始点とし、そこから段階的に希釈されていく過程（リフォールディング過程）においても、同様に観察されることを確認した。
　rhIL-6標品（特許第3200850号）を、2 ％のラウロイル-L-Gluを含む10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））1ml中に溶解させ、3 mg/mlに調整した。この溶液を、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で段階的に希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度が、1.0 ％、0.3 ％、0.1 ％、0.05 ％である希釈列を準備した。各希釈溶液のrhIL-6濃度を0.075 mg/mlに調整した後に、各希釈溶液の蛍光スペクトルを測定し、ラウロイル-L-Glu濃度の変化に伴う最大蛍光波長の変化を追跡した。
　比較のために、ラウロイル-L-Gluの代わりにラウロイル-Sarを用いた同様の操作を行った。結果を図5に示した。
　ラウロイル-L-Glu濃度が2 ～0.3 ％の間は、最大蛍光波長は340 nm付近であり、rhIL-6高次構造は依然として天然状態と異なる状態にあったが、0.1 ％、0.05 ％では350 nmに達し、この濃度のラウロイル-L-GluによってrhIL-6が実際に天然状態の高次構造を回復できた、すなわちリフォールディングされたとわかった。比較のために実施したラウロイル-Sarでは、rhIL-6の最大蛍光波長は検討した濃度範囲で全く変化せず、リフォールディングは認められなかった。
（実施例１）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　参考例１で用いたのと同じrhIL-6の水不溶性顆粒を、2.5 ％ラウロイル-L-Glu水溶液（10 mMリン酸ナトリウム含有、pH 7（25℃））5 mlに添加し、37 ℃で1時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。得られた可溶化液のrhIL-6濃度は6.5 mg/mlであった。
〔工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　得られた可溶化液に、10 μM還元型グルタチオン及び2 μM酸化型グルタチオンを添加後、室温で18時間放置し、分子内ジスルフィド結合を形成させた。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
　他方、10 mMリン酸ナトリウム水溶液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩を添加し、アルギニン塩酸塩濃度が0.4 M、0.8 M及び1.2 Mの希釈液（pH 7.0（25℃））を調製した。陰性対照として、添加剤を添加しないこと以外は同様にして調製した希釈液を用意した。
　18時間放置後の可溶化液0.1 mlを、これら希釈液で50 倍に希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。
　参考例１と同様にして、添加剤濃度とrhIL-6のリフォールディング率との関係をイオン交換HPLCで評価した。結果を表1に示す。
（比較例１～２）
　添加剤として、アルギニン塩酸塩に替えてスクロース及びグリセロールを使用したこと以外は実施例１と同様にして、添加剤濃度とrhIL-6のリフォールディング率との関係をイオン交換HPLCで評価した。結果を表1に示す。
（比較例３）
　特許第3200850号の実施例1に記載の方法に相当する方法で、rhIL-6のリフォールディングを行った。具体的には、実施例１で用いたのと同じrhIL-6の水不溶性顆粒を、6 M塩酸グアニジン（pH 7（25℃））5 mlに添加し、37 ℃で1時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。得られた可溶化液のrhIL-6濃度は0.88 mg/mlであった。
　次いで、得られた可溶化液をセファデックスG-25カラムを用いて10 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0へと緩衝液置換した。実施例１と同様にして、rhIL-6のリフォールディング率をイオン交換HPLCで評価した。結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の値は、比較例３に示した従来技術によるrhIL-6のリフォールディング率を基準にした相対的な値である。
　陰性対照の場合（添加剤無添加の希釈液を使用した場合）、リフォールディング率は従来技術の125 ％となり、優位性は明確であった。
　希釈液にアルギニン塩酸塩を0.4 M加えると、リフォールディング率は166 ％に達し、アルギニン塩酸塩濃度を0.8 M、1.2 Mと高くすると、リフォールディング率は174％、176％へと飛躍的に高まった。
　一方、タンパク質のリフォールディングを促進すると言われているスクロース又はグリセロールを添加しても、その改善効果はアルギニン塩酸塩の場合に比べて軽微であった（比較例１～２）。
　以上より、ラウロイル-L-Gluでタンパク質を可溶化し、可溶化液を希釈してリフォールディングする際に、アルギニン塩酸塩を希釈液に添加することでタンパク質のリフォールディング率を高められることがわかった。
（実施例２）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　ラウロイル-L-Glu水溶液のラウロイル-L-Glu濃度を2.5％に、pHを8.5に変更したこと以外は実施例１と同様にしてrhIL-6を可溶化した。得られた可溶化液のrhIL-6濃度は6.5 mg/mlであった。
〔工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　次いで、実施例１と同様、10μM還元型グルタチオン及び2 μM酸化型グルタチオン存在下で、室温で18時間放置した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
　他方、10 mMリン酸ナトリウム水溶液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩又はN-α-ブチロイルアルギニン（Nα-Butyroyl-L-Arginine）を添加し、添加剤濃度が0.4 M又は0.8 Mの希釈液（pH 7.0（25℃））を調製した。なお、N-ブチロイルアルギニンは以下の方法で調製した：アルギニンを水/2-プロパノールに溶解後、反応系をpH 11、10～15 ℃に調整した。水酸化ナトリウム水溶液にてpH、温度を保持したまま、ブチロイルクロライドを滴下し反応させた。反応終了後、陽イオン交換樹脂にて精製し、白色固体を得た。逆相HPLC、1H-NMRにて構造、純度を確認した。陰性対照として、添加剤を添加しないこと以外は同様にして調製した希釈液を用意した。
　室温で18時間放置後の可溶化液0.1 mlを、これら希釈液で40 倍に希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。
　実施例１と同様にして、添加剤濃度とrhIL-6のリフォールディング率との関係をイオン交換HPLCで評価した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の値は、比較例３に示した従来技術によるrhIL-6のリフォールディング率を基準にした相対的な値である。
　希釈液に添加剤を何も加えなかった場合のリフォールディング率は115％であり、添加剤としてアルギニン塩酸塩を0.4 M又は0.8 M添加すると、リフォールディング率は157 ％、188 ％へと飛躍的に高まった。
　一方、添加剤としてN-ブチロイルアルギニンを0.4 M添加するとリフォールディング率は179 ％に達し、希釈液に添加剤を何も加えなかった場合の115 ％の場合や、アルギニン塩酸塩を同濃度（0.4 M）添加した場合に比べ、リフォールディング率は大きく改善された。
　N-ブチロイルアルギニンは、中性pH下で両イオン性を示し、総荷電を失うため、仮に0.4 M以上添加されても、これを含む希釈液を希釈することなく、直接にイオン交換クロマトグラフィーに負荷することで、リフォールディングされたタンパク質を精製、回収できるため、アルギニン塩酸塩よりも更に効率的に使用することができるものと考えられる。
（実施例３）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　遺伝子組み換え大腸菌を用いて調製したトランスグルタミナーゼ（protein-glutamine、γ-glutamyltransferase, EC 2.3.2.13；US Patent No. 6833258）の水不溶性顆粒を、2.0 ％ラウロイル-L-Glu水溶液（10 mMトリス塩酸塩、20 mM DTT、pH 8.5（25℃））5 mlに添加し、37 ℃で1時間放置することにより、トランスグルタミナーゼを抽出し、可溶化した。得られた可溶化液のトランスグルタミナーゼ濃度は6.98 mg/mlであった。
〔工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
　得られた可溶化液0.1 mlを、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で40倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整し、室温で２時間放置した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
　希釈液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩を添加した（表３中「１％への希釈なし」）。陰性対照として、添加剤を添加しない希釈液を用意した。可溶化液0.1 mlに、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。
　他方、得られた可溶化液0.1 mlを、0.6 M リン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で2倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を1.0 ％に調整し、室温で30分間維持した。次いで、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整し、室温で２時間放置した。希釈液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩を添加した（表３中「１％への希釈あり」）。陰性対照として、添加剤を添加しない希釈液を用意した。可溶化液0.1 mlを0.6 M リン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で2倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を1.0 ％に調整し、室温で30分間維持した。次いで、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整し、室温で２時間放置した（希釈液に添加剤を添加せず）。
　アルギニン塩酸塩濃度とトランスグルタミナーゼのリフォールディング率との関係をゲルろ過HPLCで確認した（カラム、Superdex 75HR 10/30、GEヘルスケアバイオサイエンス製；展開液、0.2 M リン酸ナトリウム、ｐH 7.0；流速、1 ml/min）。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　希釈液にアルギニン塩酸塩を添加しなかった場合、１％に希釈してから0.05％に希釈した場合も、１％に希釈せずに0.05％に希釈した場合も、ゲルろ過HPLCで確認されたトランスグルタミナーゼの濃度は50 μg/mlに達しなかった。しかも、この希釈液を室温に保持し続けると、トランスグルタミナーゼは徐々に消失したため、トランスグルタミナーゼの天然状態の高次構造を回復できていなかったことがわかった。
　他方、希釈時にアルギニン塩酸塩を0.4、0.8、1.2 M添加しておくと、トランスグルタミナーゼの濃度はアルギニン塩酸塩添加濃度に依存して上昇し、そのまま室温に保持し続けても消失することは無かった。
　また、同じアルギニン塩酸塩濃度を添加した場合でも、2.0 ％ラウロイル-L-Glu抽出液を1 ％へと2倍希釈した後に0.05 ％へと希釈した場合、１％に希釈せずに0.05％に希釈した場合に比べて、トランスグルタミナーゼ濃度が高まる傾向を示し、特に、1.2 Mアルギニン塩酸塩を添加した場合のトランスグルタミナーゼ濃度を比較すると、127 μg/mlから151 μg/mlへと明瞭に高まることがわかった。
　以上より、希釈時にアルギニン塩酸塩を添加しておくことと、可溶化後に一旦ラウロイル-L-Glu濃度を1 ％へ希釈し、それから更に希釈することで、トランスグルタミナーゼのリフォールディングが効率的に実施できることがわかった。
（実施例４）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化、工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
　実施例3と同様にして得たトランスグルタミナーゼの可溶化液（トランスグルタミナーゼ濃度6.67 mg/ml）を、0.6 Mリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で2倍希釈し、室温で30分間保持した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
　次いで、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で20倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。0.05 %に調整されたとき、アルギニン塩酸塩が0.8 Mになるように、2回目の希釈（20倍希釈）用のリン酸ナトリウムに予めアルギニン塩酸塩を添加しておいた。
　得られた希釈液を、室温で2時間放置した。放置後、希釈液中のトランスグルタミナーゼ濃度を逆相HPLC（Vydac 214-TP54（Separations Group）；溶離液、A/0.1 ％ TFA 　B/0.1 ％ TFA + 80 ％アセトニトリル；流速、1 ml/min；溶出条件、30 ％ Bから50 ％ Bまで1.0 ％/分の直線濃度勾配法）を用いて定量した。可溶化液中のトランスグルタミナーゼ濃度を基準とすると、アルギニン塩酸塩添加後のリフォールディング率は77％となった。
（比較例４）
　US. Patent No.6833258の実施例9に記載の方法に相当する方法で、トランスグルタミナーゼのリフォールディングを行った。具体的には、実施例３で用いたのと同じトランスグルタミナーゼの水不溶性顆粒を、8M 尿素で溶解させ、5 ℃下でpH 4.0へpH調整後に50希釈して尿素濃度を0.16 Mに調整し、2時間後にpHを6.0へ調整することで構造形成させた。実施例４と同様にしてトランスグルタミナーゼ濃度を逆相HPLCで定量した。尿素で溶解した後の溶液中のトランスグルタミナーゼ濃度を基準とすると、pHを6.0に調整後のリフォールディング率は29％であった。
　実施例４のリフォールディング率は77 ％であり、従来のリフォールディング技術による比較例４の29 ％に比べて飛躍的に高まった。
　それぞれのリフォールディング法によって調製されたトランスグルタミナーゼの酵素活性を合成基質法で確認したところ、実施例４で調製されたトランスグルタミナーゼの酵素活性は37.5 U/mg、比較例４で調製されたトランスグルタミナーゼの酵素活性は36.8 U/mgとなり、双方とも天然のトランスグルタミナーゼと同じ比活性と判断される、30 U/mgを上回る酵素活性を有することが示された。
（実施例５）
〔タンパク質の調製〕
　大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした単鎖抗体可変領域（HyHEL-10 scFv）の生産系を構築した（Gene 129 (1), 129-134 (1993)）。この生産菌を、坂口フラスコを用いてLB培地中で28 ℃、12時間振とう培養し、HyHEL-10 scFvを菌体内に不溶性顆粒として蓄積させた。菌体を集めて超音波破砕後、懸濁液を5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、HyHEL-10 scFv顆粒を回収した。回収されたHyHEL-10 scFv顆粒を1 % Triton X-100水溶液で2回洗浄後、精製水（ミリQ水）で洗浄してTriton X-100を除去した。得られた顆粒約30mgをアセトン1.5 ml中に懸濁させ、脂質成分を溶解除去した。5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、顆粒を回収後、真空ポンプを用いて一晩減圧乾燥し、不溶性顆粒ペレットを得た。
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　このペレット15 mgを秤量し、5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na 含有、pH 8.5）を0.5 ml添加した。攪拌均一化した後、直ちに20 mMリン酸Na、pH 8.5を適宜添加し、エッペンチューブの目盛りを使って1.0 mlに調整した。37 ℃で30分間可溶化した。
　得られた可溶化液中のHyHEL-10 scFvの 濃度を決定するために、22 ℃下、11000 g、10分間の条件で遠心分離操作を行い、得られた上清（ラウロイル-L-Glu2.5%、pH8.5）の0.2 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の2.4 μlを添加して1.2 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。この溶液を還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10～20 %T、およびCBB染色）に供し、タンパク質濃度の判明した抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体（WO96/17078）を比較対照にして定量、可溶化されたHyHEL-10 scFv の濃度は6 mg/mlと決定した。
〔工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
　工程（1）で得られた可溶化液0.2 mlに、0.3 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して全液量を0.5 mlとした（ラウロイル-L-Glu濃度1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈、工程（Ｂ）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、種々の濃度のラウロイル-L-Glu溶液0.38mLを準備した。
　そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.4ｍLとした（20倍希釈）。20倍希釈時のラウロイル-L-Glu 濃度は0.05％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.3％、0.4％又は0.5％とし、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.12 mg/mlとした。その後、5 ℃で17時間維持した。次いで、23℃で43時間維持した。
〔リフォールディング率の測定〕
　その後、ゲルろ過HPLC（カラム：Superdex 75 GL、10 x 300 mm、GEヘルスケアバイオサイエンス製；展開溶媒：0.1 M リン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8；流速：0.8 ml/分；scFvの280 nm吸光係数、2.02 cm2/mg）でHyHEL-10 scFvのリフォールディング率を求めた。図６に、20倍希釈時のラウロイル-L-Glu濃度とリフォールディング率との関係を示した。リフォールディング率はラウロイル-L-Glu濃度に著しく依存し、0.2～0.5 %でほぼ定量的な値を示すことがわかった。
　工程（3）において得られた、ラウロイル-L-Gluの20倍希釈溶液（ラウロイル-L-Glu濃度：0.125 %、アルギニン塩酸塩濃度：0.8 M、scFv濃度：0.12 mg/ml）を用いて、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの割合がリフォールディング率に与える影響を検討した。20倍希釈溶液を5 ℃で17時間維持した後、23 ℃で43時間維持し、非還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10～20 %T、およびCBB染色）に供して、HyHEL-10のリフォールディング進行度を、酸化型scFvバンド強度を指標に検討した。図７に結果を示した。
　還元型グルタチオン添加量が酸化型グルタチオンに対して優位な場合（5 mM/1 mM ～ 2 mM/1 mM、レーン番号4～6）、SDS-PAGE上で易動度の大きく表れる酸化型scFv（リフォールディングされたscFv、図中のレーン8に矢印で示した）が十分に濃くならなかった。一方、酸化型グルタチオンの添加量比を高めると（還元型、酸化型それぞれを1 mM/1 mM ~ 1 mM/3 mM、レーン番号8～11）、易動度の大きいscFvバンドが濃くなったが、酸化型グルタチオン添加量が高まりすぎるとscFvバンドのフォーカスが鈍り（1 mM /2 mM（レーン番号10）、1 mM /3 mM（レーン番号11））、scFvのジスルフィド結合になんらかの変化が生じたことがわかった。
　したがって、HyHEL-10 scFvの場合、還元型と酸化型グルタチオンをそれぞれ1 mM（レーン番号8））添加するのが適切とわかった。
（実施例６）
〔タンパク質の調製〕
　大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした単鎖抗体可変領域（抗Fluorescein scFv）の生産系を構築した（Journal of Molecular Biology 343, 685-701 (2004)）。この生産菌を、坂口フラスコを用いてLB培地中で28 ℃、12時間振とう培養し、抗Fluorescein scFv を菌体内に不溶性顆粒として蓄積させた。菌体を集めて超音波破砕後、懸濁液を5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、抗Fluorescein scFv顆粒を回収した。回収された抗Fluorescein scFv顆粒を1 % Triton X-100水溶液で2回洗浄後、精製水（ミリQ水）で洗浄してTriton X-100を除去した。得られた顆粒、約30mgをアセトン1.5 ml中に懸濁させ、脂質成分を溶解除去した。5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、顆粒を回収後、真空ポンプを用いて一晩減圧乾燥し、不溶性顆粒ペレットを得た。
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　このペレット15 mgを秤量し、5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na 含有、pH 8.5）を0.5 ml添加した。攪拌均一化した後、直ちに20 mMリン酸Na、pH 8.5を適宜添加し、エッペンチューブの目盛りを使って1.0 mlに調整した。37 ℃で30分間可溶化した。
　可溶化された抗Fluorescein scFv の濃度を決定するために、得られた可溶化液を22 ℃、11000 g、10分間の条件で遠心分離操作を行った。得られた上清（ラウロイル-L-Glu2.5%、pH 8.5）の0.2 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の1.6 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。この溶液を還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10～20 %T、およびCBB染色）に供して実施例５と同様に定量し、可溶化された抗Fluorescein scFv の濃度は8 mg/mlと決定した。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　この可溶化液0.2 mlに0.3 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.5 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度1.0 %）、攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液0.38ｍLを準備した。
　そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.4ｍLとした（20倍希釈）。20倍希釈時、アルギニン塩酸塩濃度0、0.4 M又は0.8 Mに対して、ラウロイル-L-Glu 濃度が0.05％、0.2％又は0.4％の全９種類とし、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.16 mg/mlとした。その後、10 ℃で17時間維持した。次いで、23 ℃において12時間維持した。
〔リフォールディング率の測定〕
　その後、実施例５と同様にして、ゲルろ過HPLC（ただし、scFvの280 nm吸光係数、1.30 cm2/mgを使用）で抗Fluorescein scFvのリフォールディング率を求めた。図８に、20倍希釈時のラウロイル-L-Glu濃度、アルギニン塩酸塩濃度とリフォールディング率との関係を示した。図８から、抗Fluorescein scFvリフォールディング率はアルギニン塩酸とラウロイル-L-Gluの双方に著しく依存するとわかった。特に、アルギニン塩酸塩を0.8 Mに、ラウロイル-L-Gluを0.2 %、あるいは0.4 %に設定することで最も高いリフォールディング率を得た。
（実施例７）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　実施例６と同様にして抗Fluorescein scFv不溶性顆粒の可溶化液、8 mg/ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %）を得た。該可溶化液0.08 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の0.64 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　この可溶化液0.08 mlに0.12 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.2 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）、攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、種々の濃度のラウロイル-L-Glu溶液0.18mLを準備した。該ラウロイル-L-Glu溶液は、ラウロイル-L-Glu 濃度が0.150％、0.225％、0.300％又は0.375％とした。
　そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.4ｍLとした（10倍希釈）。10倍希釈時のアルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はそれぞれ1mM、3mM、scFv濃度は0.32 mg/mlとした。その後、10℃で17時間維持した。
〔リフォールディング率の測定〕
　17時間経過後に実施例６と同じゲルろ過HPLCで抗Fluorescein scFvのリフォールディング率を求めた。図９に、10倍希釈時のラウロイル-L-Glu濃度とリフォールディング率との関係を示した。
　ラウロイル-L-Glu濃度が0.15 %時に比べ、0.225～0.375 %ではリフォールディング率はラウロイル-L-Glu濃度に依存して高まったが、0.225～0.375 %間の変化はさほど顕著ではなかった。リフォールディング終了後、ラウロイル-L-Glu を除去する手間を考慮すると、0.3 %程度の添加量が好ましいとわかった。
（実施例８）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　実施例６と同様にして抗Fluorescein scFv不溶性顆粒の可溶化液、6 mg/ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %）を得た。該可溶化液0.2 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の1.6 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　この可溶化液0.2 mlに0.3 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.5 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液0.5ｍLに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液4.5mLを添加した（10倍希釈）。10倍希釈時のラウロイル-L-Glu 濃度が0.1％、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.24mg/mlとした。その後、8.5 ℃で17時間維持した。その後、45 ℃で4時間加熱した。
〔リフォールディング率の測定〕
　次いで、実施例６と同様にしてゲルろ過HPLCで経時的に抗Fluorescein scFvのリフォールディング率を求めた。その結果を図１０に示した。リフォールディング率は、45 ℃で加熱することによって少なくとも10%となり、4時間加熱することにより20 %を越えた。
（実施例９）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　実施例６と同様にして抗Fluorescein scFv不溶性顆粒の可溶化液、6 mg/ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %）を得た。該可溶化液0.05 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の0.4 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　この可溶化液0.05 mlに0.075 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.125 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）、攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液0.12ｍLに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液1.08 mLを添加し（10倍希釈）、全量を1.2ｍLとした。10倍希釈時のラウロイル-L-Glu 濃度が0.1％、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.24mg/mlとした。0.4 mlずつ3分割し、それぞれ5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持した。それぞれのリフォールディング率を図１１に示した。
　更にそれぞれを0.2 mlずつ2分割し、一方を45 ℃で４時間加熱し、残る一方を23 ℃で24時間維持した後に45 ℃で4時間加熱した。それぞれのリフォールディング率を図１２に示した。
　5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持した段階では、その温度に応じてリフォールディング率の高まることがわかったが、いずれも10 %を少し超える程度であった。それらを45 ℃で4時間加熱すると、リフォールディング率は加熱前の維持温度に依存して高まった。15 ℃において維持したものが45 ℃加熱後に最も高いリフォールディング率を示したが、10 ℃において維持したものと大差なかった（図１１）。
　一方、5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持後、更に23 ℃において24 時間維持し、次いで45 ℃で4時間加熱すると、リフォールディング率は、5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持後に直ちに45℃に加熱したときよりも顕著に高まった。その際、最初の維持を10 ℃で行うと、15 ℃で維持した場合よりもリフォールディング率が高まり、最終的に45 %のリフォールディング率を示すことがわかった（図１２）。
　以上より、10 ℃で18.5 時間、23 ℃で24時間維持した後に45 ℃で4時間加熱することで、scFvのリフォールディング率が最も高まるとわかった。
（実施例１０）
〔タンパク質の調製〕
　消化酵素（パパイン）反応用緩衝液（20 mM リン酸ナトリウム、10 mM EDTA）に溶解した抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体（WO96/17078）の約55 mg（18.2mg/ml、3 ml）を20 mM Cysを添加した同緩衝液で2倍希釈し、Cys濃度を10 mMに調整した。ここに、予め活性化処理を施した固定化パパインゲル（ピアース製）の懸濁液2 mlを添加した。37 ℃で14時間振とうし、遠心分離（2000 g、5分間）して固定化パパインゲルを除いた。これを、PBSで平衡化したHiTrap rProtein A FF（GEヘルスケアバイオサイエンス製）に負荷して素通り画分を回収後、限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画30 kDa、ミリポア製）で濃縮して、約30 mg（11.5 mg/ml）のFab（抗原結合部位）を得た。
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　得られたFabの0.5 mlに、等量の5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na含有、pH 8.5）を添加して全量を1mlとした（2.5 %ラウロイル-L-Glu溶液）。これを37 ℃で30分間加熱し、可溶化液とした。この可溶化液0.12 mlに、100 mM DTT溶液（pH 7）の1.46 μlを添加して1.2 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した（還元変性Fab、5.75 mg/ml）。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　得られた還元変性Fabの0.12 mlに、0.18 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.3 mlに調整した（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液0.18ｍLを準備した。
　そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.2ｍLとした（10倍希釈）。10倍希釈時、アルギニン塩酸塩濃度0、0.2 M、0.4 M又は0.8 Mに対して、ラウロイル-L-Glu 濃度が0.1％、0.2％又は0.3％の全１２種類とし、酸化型と還元型グルタチオン濃度はそれぞれ1mM及び5 mM、Fab濃度は0.23 mg/mlとした。その後、10 ℃で17時間維持した。次いで、23 ℃において24時間維持した。
　その後、実施例５と同じ非還元SDS-PAGEでFabバンドを観察した。図１３に結果を示した。アルギニン塩酸塩を全く添加しない場合（レーン番号2）、高分子量の会合凝集体が形成した。一方、アルギニン塩酸塩を0.4 M以上、あるいはラウロイル-L-Gluを0.2 %以上添加すると、会合凝集体の形成は顕著に抑制され（レーン番号8～13）、両成分を適度に共存させることによってFabの会合凝集を抑制できるとわかった。しかし、目的のFabバンドはいずれの条件でも明瞭には観察されなかった。
　これら全１２種類の各サンプルを再び10倍希釈した。希釈後の溶液中のラウロイル-L-Glu濃度は0.05 %、アルギニン塩酸塩濃度は0.08 M、酸化型及び還元型グルタチオン濃度はそれぞれ1mMと5 mMに調整した。その後、5 ℃で3時間維持した。次いで、限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて10 倍濃縮し、8.5 ℃で72時間維持した。つまり、10倍希釈と10倍濃縮が相殺して、この間のFab濃度は最初の希釈時と同じ0.23 mg/mlに維持されたことになる。非還元SDS-PAGEでリフォールディングされたFabのバンドを観察した。
　図１４に示すとおり、全てのサンプルにおける最終組成が同じにも関わらず、最初の希釈時の組成に応じてFabバンドの鮮明さが大きく変動した。最初の希釈時にアルギニン塩酸塩を添加しないと、2回目の希釈後もFabは殆どリフォールディングされなかった（レーン番号2～4）。一方、1回目の希釈時にアルギニン塩酸塩を0.4 M（レーン番号8～10）、あるいは0.8 M（レーン番号11～13）添加した場合、2回目の希釈後にFabバンドが最も強く観察されたが、1回目希釈時のラウロイル-L-Glu濃度は0.1 %が良く（レーン番号8，11）、0.2％（レーン番号9，12）、0.3 %（レーン番号10，13）と高めるとFabバンドは希薄になった。
　以上より、最初の希釈でアルギニン塩酸塩を0.8 Mに、ラウロイル-L-Glu濃度を0.1 %に調整して維持し、次の希釈でアルギニン塩酸塩濃度を0.08 Mに、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 %に調整して維持することで、Fabのリフォールディングがより効率的に行えることがわかった。
（実施例１１）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　実施例１０と同様にしてFabの可溶化液（2.5 %ラウロイル-L-Glu溶液）0.4 mlを得た。該可溶化液100 mM にDTT溶液（pH 7）4.85 μlを添加して1.2 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した（還元変性Fab、5.75 mg/ml）。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　得られた還元変性Fabの0.4 mlに0.6 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して1.0 mlに調整した（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液0.135ｍLを準備した。該ラウロイル-L-Glu溶液のラウロイル-L-Glu 濃度は0.1％、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、Fab濃度は0.23 mg/mlであり、酸化型グルタチオン濃度1 mM、2 mM又は5 mMに対して還元型グルタチオン0.5mM、1 mM、2 mM又は5 mMの全６種類とした。
　そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.15mLずつ添加し、最終的に1.5ｍLとした。
　その後、10 ℃で17時間維持し、次いで23 ℃で6時間維持した。その後、各希釈液の酸化型および還元型グルタチオンと同じ濃度のグルタチオンを含み、ラウロイル-L-Gluの適宜添加された緩衝液を用いて10倍希釈し、ラウロイル-L-Gluを0.05 %に、アルギニン塩酸塩濃度を0.08 Mに、酸化型グルタチオン濃度1 mM、2 mM又は5 mMに対して還元型グルタチオン0.5mM、1 mM、2 mM又は5 mMの全６種類に調整した。
　その後、8.5 ℃で15時間維持した。限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて10 倍濃縮して8.5 ℃で3時間維持し、実施例５と同じ非還元SDS-PAGEでリフォールディングされたFabのバンドを観察した。
　図１５に示すとおり、還元的な条件下ではFabバンドは形成されず、酸化型グルタチオンの濃度が高めることでFabがリフォールディングされた。scFvとは異なり、Fabのリフォールディングには酸化的な条件が必要であった。以上、レドックス条件を整えることで、最初の希釈開始から41時間程度でFabをリフォールディングできることがわかった。
（実施例１２）
〔タンパク質の調製〕
　大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした単鎖抗体可変領域（抗Fluorescein scFv；Journal of Molecular Biology 343, 685-701 (2004)）のFc融合タンパク質（抗Fluorescein scFv Fc fusion）生産系を構築した。この生産菌を、坂口フラスコを用いてLB培地中で28 ℃、12時間振とう培養し、抗Fluorescein scFv Fc fusionを菌体内に不溶性顆粒状に蓄積させた。菌体を集めて超音波破砕後、懸濁液を5000 g、20分間の遠心分離に供して抗Fluorescein scFv Fc fusion不溶性顆粒を回収した。回収された不溶性顆粒を1 % Triton X-100水溶液で2回洗浄後、ミリQ水で洗浄してTriton X-100を除去した。得られた顆粒、約30mgをアセトン1.5 ml中に懸濁させ、脂質成分を溶解除去した。5000 g、20分間の遠心分離に供して顆粒を回収後、真空ポンプを用いて一晩減圧乾燥し、不溶性顆粒ペレットを得た。
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　上でえられたペレット15 mgを秤量し、0.5 mlの5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na含有、pH 8.5）を添加した。攪拌均一化した後、直ちに20 mMリン酸Na、pH 8.5を適宜添加し、エッペンチューブの目盛りを使って1.0 mlに調整した。37 ℃で30分間可溶化し、可溶化液を得た。
　22 ℃下、11000 g、10分間の遠心分離に供した。得られた上清の0.27 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の2.7 μlを添加して1.0 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。この溶液を還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10～20 %T、およびCBB染色）に供して実施例５と同様に定量し、可溶化された抗Fluorescein scFv Fc fusionの濃度を3 mg/mlと決定した。しかし、この生産系では培養中に抗Fluorescein scFv Fc fusionの分解が進行し、不溶性顆粒中の抗Fluorescein scFv Fc fusion含量は30 %以下となった。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　得られた還元変性Fabの0.27 mlに0.405 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.675 mlにした（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　工程（A）で得られた液体0.6 mlに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを含む緩衝液5.4 mlを添加して全量を6.0ｍL とした（10倍希釈）。この溶液のラウロイル-L-Glu濃度は0.1 %に、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 Mに、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの濃度はそれぞれ1 mMと5 mMに、抗Fluorescein scFv Fc fusion濃度は0.12 mg/mlにそれぞれ調整した。
　その後、10 ℃で17時間維持後、0.3 mlずつ2本に分割し、一方を8.5 ℃で120時間維持し、残る一方を23 ℃で120時間維持した。
　各温度で維持を開始してから48時間目及び120時間目に、実施例５と同様にして、非還元SDS-PAGEでリフォールディングされた抗Fluorescein scFv Fc fusionバンドを観察した。
　図１６に示すとおり、48時間目に抗Fluorescein scFv Fc fusionバンドを観察し（矢印で示した位置）、120時間目には更にそのバンド強度が強まった。10℃において17時間維持後、8.5℃で維持するよりも23℃で維持する方が、48時間維持の場合も120時間維持の場合もバンド強度が強くなった。希釈後に10 ℃で17時間維持した後、23 ℃に高めることでリフォールディングの進行を促進できることわかった。
（実施例１３）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　実施例５と同様にしてHyHEL-10 scFvの可溶化液0.3 ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %、scFv濃度、3.0 mg/ml）を得た。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　得られた可溶化液に0.45 mlの20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0を添加し、攪拌後、5 ℃で30分間維持した（ラウロイル-L-Glu、1 %）。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　この0.65 mlに各添加剤を加えた緩衝液、5.85 mlを加えて10倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.3 %に、アルギニン塩酸塩濃度を0.8 Mに、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの濃度を共に1 mMに、HyHEL-10 scFv濃度を0.12 mg/mlにそれぞれ調整した。10 ℃で17時間維持した後、35 ℃で2時間加熱した。
　その後、50 mMリン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH9 8.0で平衡化したPD-10カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス製）に負荷して緩衝液を置換し、得られた7.5 mlを8.5 ℃に12時間維持した。
〔工程（C）：精製〕
　上で得られた溶液を、限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて15倍濃縮し、0.1 Mリン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8で平衡化されたSuperdex 75 GL（10 mm x 300 mm）に負荷し、精製scFvを分画した。
　得られた画分を、実施例５で用いたゲルろ過HPLC及び非還元SDS-PAGEに供し、限外ろ過膜で精製したscFvが高純度であることを確認した。SDS-PAGEでは、実線の矢印で示す位置のscFvに加え、点線の矢印で示す低分子量の成分が見られたが、これは生産宿主に用いた大腸菌由来の残留プロテアーゼによって分解されたscFv断片であり、今回のリフォールディングとは関係がない。上で得られた画分を、さらに多角度光散乱装置を装備したフィールドフローフラクショネーションに供したところ、分子量33334の観測値を得た。これにより、精製scFvが水溶液中で単量体を形成していることを確認した。分析結果を図17に示した。
（実施例１４）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
　実施例６と同様にして抗Fluorescein scFvの可溶化液1.4 ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %、scFv濃度、5.0 mg/ml）を得た。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
　得られた可溶化液に、2.1 mlの20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0を添加し、攪拌後、5 ℃で30分間維持した（ラウロイル-L-Glu、1 %）。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
　得られた希釈液3.45 mlに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを含む緩衝液31.05 mlを加えて全量を34.50ｍLとした（10倍希釈）。この溶液のラウロイル-L-Glu濃度は0.3 %に、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 Mに、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの濃度はいずれも1 mMに、抗Fluorescein scFv濃度は0.2 mg/mlにそれぞれ調整した。
　8.5 ℃で17時間維持後、23 ℃で24時間維持し、さらに45 ℃で4時間加熱した。その後、0.2 Mアルギニン塩酸塩を含むPBSで平衡化させたSephadex G25カラム（5 cm x 10 cm；GEヘルスケアバイオサイエンス製）に負荷して緩衝液を置換し、得られた42 mlを8.5 ℃に12時間維持した。
〔工程（C）：精製〕
　このうち35 mlを限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて3.7倍濃縮し、0.1 Mリン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8で平衡化されたSuperdex 75 pg （2.6 cm x 60 cm）に負荷し、抗Fluorescein scFvを分画した。
　得られた画分を、実施例５で用いたゲルろ過HPLC及び非還元SDS-PAGEに供し、抗Fluorescein scFvが高純度であることを確認した。得られた画分をさらに、多角度光散乱装置を装備したフィールドフローフラクショネーションに供したところ、分子量35200の観測値を得た。このことから、抗Fluorescein scFvが水溶液中で単量体を形成していることを確認した。この精製抗Fluorescein scFv（7.9 μM）をさらに、100 mMトリス塩酸塩に溶解した0.6 μM Fluorescein（和光純薬製）溶液に滴下し、23 ℃で1時間維持したのち、Fluorescein蛍光（励起波長、480 nm；蛍光波長、515 nm）を測定した。その結果、抗Fluorescein scFvの滴下量に応じてFluorescein蛍光が減じた。このことから、抗Fluorescein scFvは、目的とする天然状態の構造を再構成できたことがわかった。分析結果を図１８に示した。
（比較例５）
　従来技術のリフォールディング例として、津本らの段階透析法（The Journal of Biological Chemistry 278 (11), 8979-8987 (2003)）を用いて、HyHEL-10及び抗Fluorescein scFvのリフォールディングを行った。
　実施例５及び実施例９で用いたHyHEL-10及び抗Fluorescein scFvの不溶性顆粒（それぞれ8.8 mg、1.83 mgのscFvを含む）を、6M 塩酸グアニジンを含む20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.5のそれぞれ43.75 ml、9.13 mlに懸濁し、37 ℃で30分間可溶化した。
　ここへ、最終的に13 mMになるようにDTTを加え、37 ℃で1時間加熱し、SS結合を還元した。このうち0.5 mlを100 mlの透析外液1から6に対して8.5 ℃で順次透析し、65 時間目に透析内液を回収した。
　透析外液の各組成は以下の通りである：
　　1．10 mMリン酸ナトリウム、6 M塩酸グアニジン、pH 8
　　2．10 mMリン酸ナトリウム、3 M塩酸グアニジン、pH 8
　　3．10 mMリン酸ナトリウム、2 M塩酸グアニジン、pH 8
　　4．20 mMリン酸ナトリウム、1 M塩酸グアニジン、0.4 Mアルギニン塩酸塩、
　　　　1 mM酸化型グルタチオン、1 mM 還元型グルタチオン、pH 8
　　5．20 mMリン酸ナトリウム、0.5 M塩酸グアニジン、0.4 Mアルギニン塩酸塩、
　　　　1 mM酸化型グルタチオン、1 mM 還元型グルタチオン、pH 8
　　6．20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0。
　透析内液を遠心分離し（12000 g、10分間）、得られた上清を、実施例５と同じゲルろ過HPLC（カラム：Superdex 75 GL、10 x 300 mm、GEヘルスケアバイオサイエンス製；展開溶媒：0.1 M リン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8；流速：0.8 ml/分；HyHEL-10は2.02 cm2/mg、抗Fluorescein scFvは1.3 cm2/mgを定量用吸光係数とした）に負荷してリフォールディング率を求めた。その結果、HyHEL-10は9.9 %、抗Fluorescein scFvは5.5 %と、それぞれ実施例５（定量的なscFv回収率、図６）、実施例９（45 %、図１２）のリフォールディング率を大きく下回った。
種々の界面活性剤を用いて可溶化したrhIL-6の量（参考例１）を示す。 種々の界面活性剤を用いて可溶化したrhIL-6の量（参考例２）を示す。 ラウロイル-L-Glu濃度がrhIL-6可溶化量に与える影響（参考例３）を示す。 ラウロイル-L-Glu濃度と最大蛍光波長及び最大蛍光強度との関係（参考例４）を示す。 ラウロイル-L-Glu濃度の変化に伴う最大蛍光波長の変化（参考例５）を示す。 ラウロイル-L-Glu濃度が HyHEL-10 scFv のリフォールディング率に与える影響（実施例５）を示す。 酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの割合が HyHEL-10 scFv のリフォールディング率に与える影響（実施例５）を示す。 ラウロイル-L-Glu濃度及びアルギニン塩酸塩濃度が、抗Fluorescein scFvのリフォールディング率に与える影響（実施例６）を示す。 ラウロイル-L-Glu濃度が、抗Fluorescein scFv のリフォールディング率に与える影響（実施例７）を示す。 加熱時間が抗Fluorescein scFvのリフォールディング率に与える影響（実施例８）を示す。 5℃、10℃又は15℃において18.5時間維持し、それらを更に45℃において4時間維持したときの抗Fluorescein scFvのリフォールディング率（実施例９）を示す。 5℃、10℃又は15℃において18.5時間維持し、それらを更に23℃において24時間維持し、それらを更に45℃において4時間維持したときの抗Fluorescein scFvのリフォールディング率（実施例９）を示す。 ラウロイル-L-Glu濃度及びアルギニン塩酸塩濃度の変化に伴う抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体のFab バンドの変化（実施例１０）を示す。 図１３のレーン番号２～１３を10倍希釈し、10倍濃縮した場合のFab バンドの変化（実施例１０）を示す。 酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの割合が抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体の Fab バンドに与える影響（実施例１１）を示す。 10℃において17時間維持した後、8.5℃又は23℃で48時間又は120時間維持したときの抗Fluorescein scFv Fc fusion バンド（実施例１２）を示す。 限外ろ過膜により精製した後のHyHEL-10 scFv のゲルろ過ＨＰＬＣのダイアグラムと HyHEL-10 scFv バンド（実施例１３）を示す。 限外ろ過膜により精製した後の抗Fluorescein scFv のゲルろ過ＨＰＬＣのダイアグラムと 抗Fluorescein scFv バンド（実施例１４）を示す。

Claims (17)

  1. 　不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を製造する方法において、
    （1）Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤の1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
    （2）得られた可溶化液を、0.05～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02～0.5％に低下させる工程、
    （3）その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を回収する工程、
    を含む、前記製造方法。
  2. 　前記界面活性剤が、Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン又はこれらの塩である請求項１記載の製造方法。
  3. 　前記界面活性剤が、Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸又はその塩である請求項１又は２記載の製造方法。
  4. 　前記Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸が、ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアルパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸である請求項１～３のいずれか１項記載の製造方法。
  5. 　前記工程（1）と前記工程（2）との間に、前記工程（1）において得られた可溶化液を希釈して、前記界面活性剤の濃度を0.8～1.5％、pH 6.5～9.0の希釈液を得、
    　得られた希釈液を５℃～40℃において0.5時間以上維持する工程（A）を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の製造方法。
  6. 　前記工程(2)において、前記界面活性剤の濃度及びアルギニン又はアルギニン誘導体の濃度を段階的に又は漸次的に低下させ、５～４８℃で１時間～５日間維持する、請求項１～５のいずれか１項記載の製造方法。
  7.   前記アルギニン誘導体が、炭素数１～６のアシル基を有するアルギニン、アルギニンブチルエステル、アグマチン及びアルギニン酸からなる群から選ばれる請求項１～６のいずれか1項記載の方法。
  8.   前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質が、遺伝子組み換えタンパク質である請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9.   前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質が、イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質である請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  10.   前記イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質が、抗体ドメインの一部を有する抗体断片、ダイアボディまたは小型抗体の人工抗体又はFc融合タンパク質である請求項９記載の方法。
  11.   前記抗体断片が、scFv、Fab、Fab'又は（F(ab')2）である請求項１０記載の方法。
  12.   前記Fc融合タンパク質が、サイトカイン、受容体細胞外ドメイン又はペプチドを、抗体Fcドメインに融合させたものである請求項１０記載の方法。
  13. 　天然状態の高次構造を回復させたタンパク質がジスルフィド結合を有するタンパク質の場合、前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質を酸化還元反応させることにより分子内又は分子間ジスルフィド結合を形成させる工程（B）を更に含む、請求項１～１１のいずれか１項記載の製造方法。
  14. 　前記工程（B）における前記酸化還元反応を、前記工程（1）で得られた可溶化液又は前記工程（2）で得られた緩衝液中に、酸化還元物質又は銅イオンを添加することにより行う、請求項１３記載の製造方法。
  15.   不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
    （1）Ｃ8～Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
    （2）得られた可溶化液を、0.05～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02～0.5％に低下させる工程、
    を含む前記方法。
  16. 　不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を得る方法において、
    （1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
    （2）得られた可溶化液を0.1～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02～0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法。
  17. 　不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
    （1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1～3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5～9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
    （2）得られた可溶化液を0.1～1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5～9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02～0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法。
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