TWI779002B - 用於在酵母菌中製造重組介白素-11之系統及方法 - Google Patents
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Abstract
重組介白素-11在酵母菌中被表現,接著藉由沉澱從有氧發酵培養基中所分離,在變性劑的存在下使沉澱物溶解,並將溶解的蛋白進行復性。複性的重組人類介白素-11藉由陽離子交換及疏水性交互作用層析所進一步純化,從而提供具有高生物活性以及低重組介白素-11二聚體及低氧化重組介白素-11含量的高度純化的重組介白素-11。
Description
本申請案主張於西元2017年1月16日申請之62/446762號之美國臨時案之優先權。這些及所有其他參考的外部材料藉由引用而將其整體併為本文揭露之一部。當以引用方式併入本文的參考文獻中的術語的定義或使用與本文的術語的定義不一致或是相牴觸時,以本文所提供的定義為準。
本發明的領域係關於重組介白素-11的製造以及隨後的純化,特別是係在酵母菌中。
背景描述包括可用於理解本發明的資訊,並非承認本文所提供的任何資訊為先前技術或與目前所請求之發明相關,亦非承認被具體或隱含地引用的任何出版物為先前技術。
介白素-11具有相當大的治療潛力,然而要製造足夠規模及純度的IL-11是具有挑戰性的。由於已在細菌中嘗試缺乏糖基化表現的重組介白素-11。然而,所得蛋白傾向表現為不可溶的包涵體(inclusion bodies),而導致產量低下。這可能是由於蛋白質的不當折疊所造成。已有研究嘗試在酵母菌中表現介白素-11,但迄今為止此些方法的產量仍低且需要使用有毒的有機溶劑。
解決這個問題的一種方式是將重組介白素-11表現為具有更期望的表現特徵的融合蛋白。市售的介白素-11通常從大腸桿菌所表現的融合蛋白中分離。不幸的是,使用腸激酶(enterokinase)從融合蛋白產生介白素-11片段會導致產物的異質性(heterogeneity)。相似地,美國專利申請公開號2009/0010872(Mackiewicz)描述了一種重組介白素-11融合 蛋白,其併入介白素-11和可溶性介白素-11受體的序列,並且在培養的昆蟲或哺乳動物細胞中表現此融合蛋白。然而,從這樣的融合蛋白中回收介白素-11需要額外處理步驟來切割融合蛋白,且可能導致介白素-11產物片段長度及/或序列的變異。此外,這些細胞的培養要求複雜,而可能會使期望產物的下游純化複雜化。
舉例而言,美國專利申請公開號2007/0275889描述了一種編碼介白素-11序列及伴隨蛋白(chaperonin)的質體的應用,以及這種質體在培養的昆蟲或哺乳動物細胞中的表現。伴隨蛋白係用於提供適當的折疊並防止表現的介白素-11的聚集(aggregation)。本文的所有出版物藉由引用的方式併入本文,如同每個單獨的出版物或專利申請案被具體地及單獨地指明以引用方式併入本文中。當併入的參考文獻中術語的定義或用法與本文中提供之術語的定義相違背時,以本文所提供之術語定義為準,而不採用該參考文獻中之術語的定義。然而,如上所述,這種細胞的培養條件可能使隨後的純化步驟複雜化。另外,培養的哺乳動物及昆蟲細胞中的表現通常遠低於在細菌或酵母菌中的表現。
因此,仍需要一種簡單,有效且可擴展的方法來提供實質上純淨且有活性的重組介白素-11。
在一些實施例中,用於描述和要求保護本發明的某些實施態樣的表現成分量、性質(如濃度、反應條件等)的數值應被理解為在一些情況下被術語「約」所修飾。因此,在一些實施例中,說明書和所附權利要求中所提及的數值參數是近似值,其可以根據特定實施例試圖獲得的期望特性而發生變化。在一些實施例中,數值參數應該根據所報導的有效數字的數值並採用慣用的四捨五入法來解釋。儘管給出本發明某些實施例寬泛範圍的數值範圍和參數是近似值,但是在具體實例所列數值則被盡可能精確地報導。在本發明的一些實施例中所呈現的數值可能包含由其各自測試測量中的標準偏差所必然導致的某些誤差。
除非上下文另外明確指出,用於本文中以及隨後的權利要求中,的術語「一」(a、an)及「該」(the)的含義包括複數形式。而且,除非上下文另外明確指出,用於本文描述中的術語「在...中」(in),的含義包 括「在...中」(in)和「在...上」(on)。
除非上下文有相反之意,否則本文闡述的所有範圍應被解釋為包括它們的端點,並且開放式範圍應被解釋為僅包括商業上可行的值。同樣地,除非上下文有相反之意,否則所有列出的數值均應視為包含在其其間的數值。
本文對數值範圍的列舉僅是用來作為單獨提及落入該範圍內的每個單獨數值的簡略表達方式。除非本文另有指示,具有範圍的每個單獨值都被結合到說明書中,如同它在本文中單獨列舉一樣。除非在本文另有指示或者與上下文明顯矛盾,本文描述的所有方法可以以任何合適的順序進行。針對本文中的某些實施例提供的任何和所有例子或示例性用語(舉例而言,「例如」)的使用僅意在更好地說明本發明,而不是對本發明所要求保護的範圍構成限制。說明書中的任何用語都不應將任何未載明於權利要求中的條件解釋為表示對實施本發明來說其為不可或缺的元件。
本文公開的本發明的替代元件或實施例的分組不應被解釋為限制要件。每個群組的構件可以單獨地或與群組中的其他構件或本文中發現的其他元件一起被引用和要求保護。出於便利性和/或可專利性的原因,可將一個或多個構件納入群組中或將一個或多個構件從群組中刪除。當發生任何這樣的納入或刪除時,在本文中說明書被視為已包括修改後的群組,從而滿足所有於後附權利要求使用的馬庫西群組的書面陳述要件。
本發明標的所提供的裝置、系統及方法係提供高度純化的重組介白素-11,相較於現有技術方法,其具有較低的二聚體及氧化含量。
本發明構思的一個實施例是一種製造介白素-11的方法,其包括將編碼重組介白素-11的表現載體引入酵母菌中,且編碼的重組介白素-11不為融合蛋白的形式。酵母菌在誘發介白素-11表現的條件下在培養基中培養,隨後從培養基的固體中分離出上清液。然後用足量的聚乙二醇處理該上清液,以形成包括沉澱物的懸浮液。舉例而言,聚乙二醇可以以最終濃度為約4%(w/v)至約12%(w/v)和/或約6%(w/v)至約 9%(w/v)的方式提供。這樣的聚乙二醇的分子量可為約2000道爾頓(D)至約20000道爾頓,和/或約4000道爾頓至約12000道爾頓。
這樣的沉澱物被溶解在包括變性劑的溶液中,生成粗製介白素-11溶液。合適的變性劑包括尿素、胍鹽酸鹽和/或洗滌劑(例如十二烷基硫酸鹽和/或N-十二烷基肌胺酸鈉)。舉例而言,在這樣的溶解步驟中,胍鹽酸鹽的濃度可以為約4M至約10M或約5M至約9M。接著,降低變性劑濃度(例如,胍鹽酸鹽濃度可降至0.7M或更低)以生成再摺疊介白素-11溶液。在一些實施例中,降低變性劑濃度的步驟包括於降低變性劑濃度後在攝氏18至25度下孵育約1小時。變性劑的濃度可以任何合適的手段來降低,包括稀釋和/或交換緩衝液。介白素-11的再摺疊可以在蛋白濃度為約0.1毫克/毫升至約10毫克/毫升,和/或小於約2毫克/毫升的條件下進行,並且可以在不存在共溶質的條件下進行。再摺疊可以在pH值約4至約12,或是pH值約7至約11的條件下進行。再摺疊的介白素-11溶液接著與離子交換介質接觸,隨後從離子交換介質(例如陽離子交換介質)沖提出純化的介白素-11。
在一些實施例中,上述方法包括額外的處理步驟。在一些實施例中,將純化的介白素-11與疏水性交互作用介質接觸。合適的疏水性相互作用介質包括丁基、己基、辛基和/或苯基介質。隨後從疏水性交互作用介質中沖提出精煉介白素-11,且相對於純化的介白素-11,精煉介白素-11中氧化介白素-11的含量較低。所得的純化介白素-11的純度可至少為95%,舉例來說,其包括約5%(或以下)的氧化介白素-11及/或1%(或更少)的介白素-11二聚體。當使用7TD1細胞株進行測試時,精煉介白素-11的生物活性通常為約4 x 106U/毫克至約1.2 x 107U/毫克(例如,約6 x 106U/毫克)。
藉由以下較佳實施例的詳細描述以及附圖將使本發明標的的各種目的、特徵、方面及優點更臻顯著,其中相同的附圖編號表示相同的元件。
圖1A至1C描述了高密度發酵的重組人類介白素-11表現結果。圖1A描繪遍佈不同時間點的生長曲線。培養基係於誘發後的時間點進行收取,並以非還原性十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(non-reducing SDS-PAGE)和免疫墨點法進行分析。圖1B顯示了使用考馬斯藍染色(Coomassie blue staining)的非還原性SDS-PAGE的典型結果。圖1C顯示了西方免疫墨點法的典型結果。M代表蛋白質標準液(protein marker)。
圖2顯示典型的非還原性16% SDS-PAGE的膠體,其展示在雙水相萃取(aqueous two-phase extraction)後重組人類介白素-11的回收結果。
圖3提供以雙液相萃取(liquid two-phase extraction)方法從表現培養基所分離的粗製重組人類介白素-11的遠紫外光圓二色性光譜(far-UV CD Spectrum)。
圖4顯示從發酵培養基所沉澱的重組人類介白素-11(圖下半部)和重組人類介白素-11參考標準(圖上半部)的尺寸排阻層析法(size-exclusion chromatography)的結果。
圖5顯示使用Capto-S管柱(一種陽離子交換劑)通過液相層析法從含有0.1%的吐溫-80(Tween-80)的發酵培養基中分離重組人類介白素-11的結果。紅色曲線描繪在線電導率(in-line conductivity);藍色曲線描繪在280奈米的UV吸光度。陰影區域表示判斷為適合匯集(pooling)的部分。
圖6A和6B顯示於變性劑存在的環境下進行在再摺疊後,以Capto-S陽離子交換劑分離重組人類介白素-11的結果。圖6A顯示使用濃度為8M的尿素的結果。圖6B顯示使用濃度為6M的胍鹽酸鹽的結果。在這兩圖中, 紅色曲線描繪在線電導率,藍色曲線描繪在280奈米的UV吸光度。箭頭表示復性重組人類介白素-11的沖提位置。
圖7在7M胍鹽酸鹽存在的環境下溶解不同濃度的沉澱蛋白的再摺疊產率。
圖8顯示在存在或不存在共溶質的情況下分離再摺疊的重組人類介白素-11的結果。紅色曲線描繪在線電導率,而藍色曲線描繪在280奈米的UV吸光度。
圖9顯示重組人類介白素-11在不同pH值下的再摺疊產率。
圖10顯示使用Capto-S管柱(一種陽離子交換劑)通過液相層析法分離復性重組人類介白素-11的結果。紅色曲線描繪在線電導率,綠色曲線描繪pH值,而藍色曲線描繪在280奈米處的UV吸光度。陰影區域表示判斷為適合匯集的部分。
圖11A和11B顯示藉由LC/MS測定分子量的結果。圖11A顯示典型的離子層析圖。圖11B顯示反摺積質量(deconvoluted mass)為19046.7Da的主峰,其與預期的分子量19047一致。在19,062.5Da的反摺積質量處觀察到的次要峰推測是氧化的介白素-11,因為額外的16Da可以解釋為單個氧原子。
圖12顯示自Capto-S管柱上離子交換所得的主要峰的沖提部分的尺寸排阻層析法的結果。
圖13顯示了使用丁基HP管柱去除氧化的重組人類介白素-11的藉由疏水性交互作用層析法對重組人類介白素-11進行精煉的典型結果。紅色曲線描繪在線電導率,而藍色曲線描繪在280奈米處的UV吸光度。陰影區域表示判斷為適合匯集的部分。
圖14顯示使用考馬斯藍染色的非還原性16% SDS- PAGE的純化重組人類介白素-11的純度研究的典型結果。加載的蛋白樣品的濃度從0.2至5.0微克。
圖15顯示了藉由RP-UPLC測定的重組人類介白素-11和相關蛋白的純度研究的典型結果。氧化重組人類介白素-11的量約2.5%,而未知雜質的量約1.6%。
圖16顯示了通過SEC-UPLC測定的重組人類介白素-11單體的純度研究的典型結果。重組人類介白素-11單體的純度約為99.0%。
圖17提供了純化的介白素-11產物的質譜m/z。獲得19045.7Da的反摺積質量,與預期的分子量19047Da一致。
圖18顯示了源自水解重組人類介白素-11的胰蛋白酶肽(tryptic peptides)的典型總離子層析圖。每種肽的鑑定係藉由m/z和MS/MS裂解所證實。
圖19顯示了使用純化重組人類介白素-11進行細胞增生實驗的典型結果。
以下的描述包括可用於理解本發明的資訊。其並非承認本文提供的任何資訊為先前技術或與目前所請求之發明相關,亦非承認被具體或隱含地引用的任何出版物是先前技術。
以本發明標的所提供裝置、系統及方法,重組介白素-11可在酵母菌中表現,並從培養基回收到有活性的、實質上純的單體蛋白。重組蛋白係利用溶劑除去劑(例如聚乙二醇)進行沉澱,在離散劑或變性劑(例如胍)存在的情況下進行溶解,並進行復性以提供適當的蛋白折疊。可以將層析步驟,例如離子交換(例如陽離子交換)和/或疏水性交互作用層析法(例如使用丁基取代層析介質)併入本發明構思的方法中。
藉由以下較佳實施例的詳細描述以及附圖將使本發明標的的各種目的、特徵、方面及優點更臻顯著,其中相同的附圖編號表示相同的 元件。
在一些實施例中,用於描述和要求保護本發明的某些實施態樣的表現成分的量、性質(如濃度,反應條件等)的數字,應被理解為在一些情況下以術語「約」所修飾。因此,在一些實施例中,本說明書和所附之權利要求中所記載的數值參數是近似值,其可以根據特定實施例所試圖獲得的期望特性而變化。在一些實施例中,應根據所記載之有效位數的數字及應用一般的數值簡化技術來解釋數值參數。儘管闡述本發明的一些實施例的寬泛範圍的數值範圍和參數是近似值,但是在具體例子中所提出的數值則是盡可能地精確記載。在本發明的一些實施例中呈現的數值可能包含某些誤差,其係由其各自測試測量中所存在的標準偏差而必然導致。
除非上下文另外明確指出,用於本文中以及隨後的權利要求中,的術語「一」(a、an)及「該」(the)的含義包括複數形式。而且,除非上下文另外明確指出,用於本文描述中的術語「在...中」(in),的含義包括「在...中」(in)和「在...上」(on)。
本發明中數值範圍的敘述僅意在作為一一指稱各個落在該範圍內的單獨數值的簡寫方法。除非另有說明,在範圍內的每個單獨數值皆被納為本說明書揭露之一部分,如同其於本文中一一被指稱。除非另有說明或者與上下文明顯矛盾,本發明所述的所有方法可以以任何適合的順序進行。在本發明某些實施例中使用的任何和所有範例或示範性語詞(例如「舉例來說」)僅旨在更清楚的說明本發明,並非限制本發明所要求的保護範圍。說明書中的任何語詞不應解釋為未見於申請專利範圍中但為實施本發明的必要元素。。
本文所揭露之替代元件或實施例之群組不應解釋為本發明之限制。每個群組成員可被單獨地提及和要求保護,或者係以與該群組內其他成員或本文中其他元件任意結合的方式被提及和要求保護。基於便利性及/或專利性的理由,群組中之一個或多個成員可以納入在群組中或自群組中刪除。當發生任何前述之納入或刪除的情況時,說明書應被視為包括修改後之群組,從而滿足所附之申請專利範圍中使用的所有馬庫西式群組之書面說明要件。
在推導本發明構思的方法和組合物時,係利用Invitrogen的PichiaPinkTM表現系統來建立具有穩定高表現量的重組人類介白素-11殖株。此載體表現來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-交配因子的前序列,該序列是將重組蛋白導向細胞外介質的短信號肽。PichiaPinkTM表現系統的一個特點是使用ADE2基因啟動子和基因產物來選擇高拷貝數的殖株。ADE2(負責嘌呤核苷酸從頭合成(de novo biosynthesis)的基因)的突變會導致嘌呤前體的累積,使轉型後的(transformed)菌落呈現紅色/粉紅色。表現菌株是ade2營養缺陷型(auxotrophs),它們無法在缺乏腺嘌呤的培養基上生長。以質體轉型表現宿主會使該菌株能夠在缺乏腺嘌呤的培養基上生長,且短ADE啟動子序列便於篩選納有高拷貝數的殖株。低拷貝數的菌落呈粉紅色;而白色菌落是高拷貝數殖株。
現有在酵母菌中製造重組人類介白素-11的技術方法係使用畢氏酵母菌(Pichia pastoris),其具有低產量的問題,不論是其酵母菌的表現量,或者是產物的純化程度。發明人發現,高細胞密度發酵的結果顯示其表現的重組人類介白素-11並無活性,且經陽離子交換純化後的回收率偏低(1~5%)。當與以已知量的標準品作為定量基準來進行SDS-PAGE分析後的結果相比,發現ELISA定量分析會低估培養基中介白素-11的表現量(減少約90%)。發明人認為,現有技術方法的低產率係導因於錯誤折疊和/或聚集,之前這些問題係使用反相層析和隨後的有機溶劑去除在某種程度上來進行處理。
由於錯誤折疊的蛋白通常被認為是在細胞內聚集或者被回收以進行降解(9),因此文獻中未有提及為分泌型、可溶性但錯誤折疊的重組人類介白素-11。本發明所構思的方法,係使用畢氏酵母菌表現系統來進行重組人類介白素-11的表現和純化,以及在不使用反相層析法的情況下從酵母發酵培養基中進行分離。
本文嘗試了使重組人類介白素-11復性的替代方法,包括使用離散劑/變性劑(如尿素、SDS、硫酸銨和胍鹽酸鹽)。發明人認為高濃度的胍鹽酸鹽能夠破壞會讓重組人類介白素-11自聚集的交互作用,且當變性劑濃度降低時會使重組人類介白素-11單體適當地再折疊。
從培養基製造重組人類介白素-11的方法,係由雙液相萃取開始,以自培養基中沉澱出重組人類介白素-11。沉澱可通過任何合適的手段來進行,前述合適的手段係從發酵培養基中對重組人類介白素-11進行選擇性或部分選擇性的沉澱,其包括加入鹽類(例如硫酸銨、硫酸鈉)、有機溶劑(例如甲醇、乙醇、丙酮等)、和/或親水性聚合物(例如葡聚醣、糊精、環糊精、聚乙二醇/PEG等)。舉例而言,可以使用分子量為8000Da且最終濃度為8%(w/v)的PEG(例如PEG-8000)。自發酵培養基中沉澱出的蛋白係自發酵培養基中分離出來,以進一步處理。前述的分離可以通過任何合適的手段完成,包括沉降、傾析、過濾和/或離心分離。在一些實施方式中,在進一步處理之前,沉澱出的蛋白可以洗滌一或多次(例如,使用含有沉澱劑的洗滌緩衝液)。
沉澱出的粗製蛋白隨後溶解在含有變性劑的緩衝液中,其可以幫助破壞蛋白聚集體。合適的變性劑包括離散劑(例如,尿素、胍鹽、異硫氰酸鹽等)以及洗滌劑(例如,離子洗滌劑(如十二烷基硫酸鹽)、非離子洗滌劑(如吐溫-20和/或吐溫-80)以及兩性離子洗滌劑)。舉例而言,最終濃度為7M的胍鹽酸鹽可用於破壞蛋白聚集體並重新溶解沉澱出的蛋白。
然而,使用這些變性劑必然會造成所欲得的重組人類介白素-11產物發生變性。通過去除變性劑或降低變性劑的濃度,可以逆轉這種變性過程,以提供復性/再折疊的重組人類介白素-11。這種去除可以是快速或漸進式的。變性劑的去除可以通過任何合適的方法進行,包括稀釋(例如,用含有減少量的變性劑或不含變性劑的緩衝液、及交換緩衝液),緩衝液的交換可以是以漸進式的(例如,通過透析)或是以相對快速的(例如藉由滲濾、尺寸排阻層析法等)方式來完成。應該理解的是,諸如透析和滲濾方法,在去除低CMC洗滌劑方面可能是相對無效的。在一些實施方式中,使用不包括表面活性劑的緩衝液進行直接稀釋,可以充分降低變性劑的濃度,使重組人類介白素-11得以進行再折疊和復性。
令人驚訝的是,發明人發現胍鹽酸鹽比其他離散劑能更有效地溶解沉澱出的重組人類介白素-11,並且接著在去除或減少離散劑後,能 更有效地使重組人類介白素-11復性成活性/天然的構型。雖然胍鹽酸鹽被發現對此目的非常地有效,但申請人認為其他離散劑(如尿素,異硫氰酸鹽等)和/或洗滌劑在對其使用進行優化的條件下,也能有類似的效果。
應理解的是,除了變性劑濃度以外,仍有其他因素會影響變性重組人類介白素-11的正確再折疊或復性。例如,復性過程中的蛋白濃度會影響復性的程度和形成不需要的副產物(如二聚體和更高級的聚集體)。儘管從處理效率的觀點來看,在復性過程中蛋白的濃度以高為佳,但這種考量必須與最終產品的產率和純度取得平衡。在本發明的處理方法中,重組人類介白素-11在進行復性或生成再折疊的過程中,蛋白濃度範圍可以為約0.1毫克/毫升至約10毫克/毫升。令人驚訝的是,發明人發現重組人類介白素-11在蛋白濃度低於2毫克/毫升時,進行復性或生成再折疊的結果最佳。透過使用不含變性劑的緩衝液來進行稀釋可以輕易的達成前述條件,並同時降低變性劑的濃度。
同樣地,復性過程中的pH值會影響變性重組人類介白素-11的再折疊或復性結果。發明人發現可以在約4至約12的pH值下進行復性。在較佳的實施例中,可以在約7至約11的pH值下進行復性。如果需要,可以在復性前或復性過程中通過適當地添加酸(如HCl)或鹼(如NaOH)來調節pH值。或者,可以通過在復性溶液中加入緩衝化合物(例如磷酸鹽、碳酸氫鹽、Tris、HEPES等)或通過將復性溶液與適當的pH值的緩衝溶液進行緩衝液交換來調節pH。
在復性/再折疊後,可對重組人類介白素-11進行兩個層析步驟。其中第一個是使用陽離子交換劑的離子交換。合適的陽離子交換劑包括弱陽離子交換劑(例如,帶有羧基的離子交換劑)和強陽離子交換劑(例如,含有磺酸基團的離子交換劑)。這種陽離子交換可以使用離子交換膜、離子交換樹脂和/或相轉移溶劑來進行。在較佳的實施例中,離子交換係使用填充在層析管柱中的陽離子交換樹脂來進行,這有助於特定級分(fraction(s))的收集。重組人類介白素-11的製備可以在低離子強度下實施,使重組人類介白素-11與陽離子交換劑締合(associate)或結合。在允許未結合的污染物通過後,藉由增加所施加的緩衝液的離子強度(例如,通 過增加NaCl或其它鹽的濃度)或改變所施加的緩衝液的pH值,可以從陽離子交換劑中沖提或釋放出重組人類介白素-11。沖提可以以逐步或梯度的方式進行。應該理解的是,高負載量的樣品(超過5毫克/毫升)可以用某些陽離子交換管柱來處理,這可以減少由於非特異性結合所導致的損失並提高處理效率。舉例來說,Capto-S強陽離子交換管柱所容許的樣本負載量為13毫克/毫升,且其活性重組人類介白素-11的步驟回收率(step recovery)可為40%至60%。
在一些實施例中,對陽離子交換所得的產物會以疏水性交互作用層析法來進行一第二層析步驟,以去除其他污染物並提供更高純度的重組人類介白素-11。疏水性交互作用層析法可以使用含有合適的疏水基團的樹脂或膜來進行。合適的疏水基團包括丙基、丁基、己基、辛基和苯基。在一些實施例中,可以在疏水性交互作用層析之前,將鹽(例如,硫酸鹽或磷酸鹽)添加至到重組人類介白素-11溶液中。這些鹽也可用於在之前的離子交換步驟中從陽離子交換劑中沖提出重組人類介白素-11。在較佳的實施例中,使用填充在層析管柱中的疏水性相互作用樹脂進行疏水性相互作用層析法有助於在沖提過程中收集特定級分。通過降低所施加的緩衝液的離子強度和/或增加所施加的緩衝液的有機溶劑和/或表面活性劑濃度,可以從前述的疏水性相互作用管柱中沖提出重組人類介白素-11。前述改變緩衝液的組成可以是逐步的改變或是以梯度方式來實現。應該理解的是,重組人類介白素-11可以在高蛋白負載量下施加於前述的疏水性相互作用管柱,以提高處理的效率。舉例而言,疏水性相互作用層析管柱允許的樣品負載量為6-8毫克/毫升,同時其95%純度重組人類介白素-11產物(通過去除氧化的重組人類介白素-11和其它雜質)的步驟產量(step yield)約為50%。然後,將得到的純化的重組人類介白素-11濃縮至至少6毫克/毫升,並用10mM磷酸鈉(pH為7)緩衝液進行緩衝液交換以用於冷藏。典型的總產率(overall yield)可以是約20~25%。由前述方法所得的最終純化批量(bulk)由特性、純度和效力方面進行測定;前述測定結果顯示該方法能夠產出高純度且有效力的重組人類介白素-11。
發明人注意到重組人類介白素-11的氧化是產物污染的重 要來源,採取降低氧化重組人類介白素-11的層析步驟會影響產率。重組蛋白的氧化主要發生在加工和儲存過程中,其係由過程中的活性氧物質(包括超氧化物(O2-)及其質子化形式(HOO‧)、過氧化氫(H2O2)和其他羥基(OH‧)(17))所導致。對於蛋白質的穩定來說,含硫取代基的氧化尤其扮演至關重要的角色。蛋白療法的氧化壓力(oxidative stress)可能導致各種醫療後果,包括效能下降或免疫原性升高(18)。氧化損傷通常與發酵過程中的溶氧有關,這對於好氧性發酵是不可避免的。發明人認為對發酵過程進行修改可以盡量降低在培養過程中所產生的氧化蛋白,同時優化下游精煉過程,以選擇性的去除氧化蛋白。
應該理解的是,相對於現有的製造方法,由這些方法所製得的重組人類介白素-11製劑,具有高生物活性和高純度。當使用7TD1細胞株來測試生物活性時,如上所述從疏水性相互作用管柱所沖提出的精煉重組人類介白素-11其生物活性可約為4 x 106U/毫克蛋白至約1.2 x 107U/毫克蛋白,且通常約為6 x 106U/毫克蛋白。這種重組人類介白素-11製劑的純度可以大於85%、大於90%、大於95%、大於98%或大於99%。一般而言,如上所述製造的重組人類介白素-11的純度大於95%。如上所述,氧化重組人類介白素-11常見於好氧性發酵的產物中。在如上所述所製得的重組人類介白素-11的製劑中,氧化重組人類介白素-11的含量通常為5%或更少。同樣地,在如上所述所製備的重組人類介白素-11製劑中,二聚重組人類介白素-11(即,重組人類介白素-11二聚體)的含量,可小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%,或小於0.5%。通常在前述製劑中,重組人類介白素-11二聚體的含量少於1%的。
以下是本文的說明性示例,且不應該被認為是限制性的。
材料
PichiaPinkTM表現系統(# A11152,A11154)係購自Invitrogen Life Technologies。用於構建殖株的限制酶和聚合酶係購自Thermo Fisher Scientific的FastDigest酶。消泡劑204(Anti-foam 204,# A6426)、不含胺基酸的酵母氮基(# Y0626)係購自Sigma-Aldrich。源自酵母菌的重組人類 介白素-11的參考標準品係購自杭州九源基因工程公司(批號20121005/1006/1007/1008&20150402)。用於免疫墨點法的試劑和材料,包括8-16%梯度的SDS-PAGE(# 25268)、StartingBlock固定緩衝液(# 37579)、BlockerTM酪蛋白(# 37583)、不含甲醇的轉移緩衝液(# 35045)、TBS吐溫-20緩衝液(# 28360)和1-step ultra TMB(# 37574)、Gibco® 2-巰基乙醇(# 21985-023)和Novex Tris-甘胺酸16%聚丙烯酰胺凝膠(XP00162BOX)係購自Thermo scientific。人類介白素-11親和性純化山羊IgG(# AF-218-NA)多株抗體和驢抗山羊IgG HRP親和性純化多株抗體(# HAF109)係購自R & D系統。與C57B1/6脾細胞融合的7TD1小鼠骨髓瘤細胞係來自DSMZ(編號ACC 23)。由牛胰臟改造的測序級胰蛋白酶(目錄號11148025001)係購自Roche diagnostics。小鼠介白素-11受體α係從MyBioSource,Inc(Cat.No.MBS553276)獲得。CellTiter 96®水性非放射性細胞增殖測定組(MTS)(目錄號G5430)係購自Promega。RPMI 1640(# SH30255.01)、HIFBS(H# SH30071.03HI)、Strep/Pen(HYCLONE,USA,SV30010)係購自美國HYCLONE。純化樹脂-Capto S(產品編號17-5316-10)、Capto Q(產品編號17-5441-01)和丁基HP(產品編號17-5432-01)係購自GE Healthcare Life Sciences。用於HPLC操作的三氟乙酸(目錄號302031)和乙腈(目錄號34967)係購自Sigma-Aldrich。聚乙二醇8000(# 408050010)、DL-甲硫胺酸(# 125652500)和胍鹽酸鹽(# 364790025)係購自Acros Organics。硫酸銨(# 11566)係來自Alfa Aesar。非動物來源的植物蛋白腖(# 210931)係購自Becton Dickinson。
表現重組人類介白素-11的酵母菌殖株的選殖及細胞庫重組人類介白素-11基因係經合成並選殖到含有編碼有α-因子信號肽基因的pPINKα-HC酵母菌表現載體中,其Glu-Ala重複序列被刪除。藉由電穿孔方法,將所得的重組載體轉形至蛋白酶缺陷型菌株中,以產生穩定殖株。每次轉化後挑選大約40個殖株,並用考馬斯藍染色(數據未顯示)後以目測檢查SDS-PAGE上的表現強度,來篩選出有介白素-11高量表現的殖株。使用重組人類介白素-11特異性抗體的西方免疫墨點法來確認蛋白的特性。研究用的總細胞庫(cell master bank)和工作細胞庫(working cell bank)已 經做好相應準備並儲存在深度凍結環境(deep freeze)中。
為確保表現量與質的一致性,將所選擇到的pPINKS2-IL11-24殖株繼代培養4代,以純化殖株,而擴增工作細胞庫後的總細胞庫。總細胞庫和工作細胞庫在攝氏-80℃下長期儲存。
高密度發酵
在使用補料批式發酵法(fed-batch fermentation)的高密度細胞培養中,以1升發酵系統(BIOSTAT®B生物反應器,Sartorius)來評估所選定殖株的重組人類介白素-11表現量。首先,自工作細胞庫取出一小瓶(vial),於解凍後接種於缺少腺嘌呤的15毫升MGM培養基(最小甘油培養基(minimal glycerol medium);經0.2μm過濾)以進行發酵。MGM的組成如下:
‧1.34%不含胺基酸的酵母菌氮鹼(Yeast nitrogen base)
‧1%甘油
‧4ppm生物素
在30℃下以250rpm振盪培養20小時後,將所得的培養基接種在具有0.5%植物蛋白腖(phytone peptone,pH為5)的100-毫升BSM(發酵基礎鹽培養基,fermentation basal salts medium)額外48小時。BSM的組成及製備係如下所示:
BSM的組成-
‧甘油(50%)80毫升
‧磷酸(28%)26.7毫升
‧硫酸鈣0.9克
‧硫酸鎂14.9克
‧氫氧化鉀4.1克
‧硫酸鉀18.2克
‧Phyton蛋白腖5.0克
‧PTM1微量鹽4.4毫升
加水至最終體積為1公升。
將培養液的pH值調節至5.0,且緩慢加入經過濾的PTM1微量鹽以避免沉澱。PTM1微量鹽的製備係如下所示:
PTM1微量鹽的組成-
‧硫酸銅-5H2O 6.0g
‧碘化鈉0.08克
‧硫酸錳-H2O 3.0克
‧鉬酸鈉-2 H2O 0.2克
‧硼酸0.02克
‧氯化鈷0.5克
‧氯化鋅20.0克
‧硫酸亞鐵-7H2O 65.0克
‧生物素0.2克
‧硫酸5.0毫升
加水至最終體積為1公升。
接著,將含有0.5%(w/v)大豆植物蛋白腖的600毫升發酵基礎鹽培養基(BSM)與500μL的消泡劑在1公升容器中混合,隨後以相同的培養條件,在甘油批式階段(glycerol batch phase)下接種新培養的種子細胞。通過調節攪拌速度,將溶氧水平-pO2值保持在80%,並將進氣流量設定為0.3公升/分鐘。在甘油-補料批式階段中,將50%甘油以6毫升/小時/公升的限制速率供給至容器以促進生長。通過在不同時間點測量OD 600奈米來監測細胞密度,直到OD值達到約180-200。在此階段,通過增加攪拌速度和進氣流量,將pO2值保持在不低於30%。藉由在最初的4-5小時以5.5毫升/小時/公升的速率加入30%(v/v)甲醇,然後以5.5-9毫升/小時/升的速率加入50%(v/v)甲醇,以在甲醇補料批式中誘發人類重組介白素-11。藉由增加攪拌速率和進氣流量,將pO2值保持在不低於20%。在誘發48-72小時後收穫培養基。
酵母菌殖株的重組人類介白素-11表現量
由於介白素-11的錯誤折疊會使ELISA持續低估(有很大一部分被發現未能被抗體偵測出)培養基中介白素-11的蛋白含量,因此係以肉眼方式比對其與參考標準品在同一片SDS-PAGE凝膠上的染色強度,來確定培養基中表現的蛋白含量是否達到期望值。或者,可以使用密度測定軟體(例如, 由BiochemLab Solutions提供的GelQuant.NET(版本1.8.2))來計算蛋白質含量。使用RP-HPLC也可以精確定量表現水平。培養基中的分泌型重組人類介白素-11係藉由加入8%(w/v)PEG-8000所沉澱,並在離心後所收集。將沉澱物再懸浮於含有7M胍鹽酸鹽的pH 8的磷酸鈉緩衝液中。藉由離心除去不溶顆粒後,以下列層析程序以進行RP-HPLC,與已知濃度的參考標準品相較,以兩者的積分面積來計算表現量:
‧管柱:PLRP-S管柱(Agilent),8微米,2.1 x 150毫米,孔徑300Å,配備保護柱
‧流動相A:0.1%(v/v)TFA水溶液;流動相B:於90%(v/v)乙腈中的0.1%(v/v)TFA
‧流速:0.2毫升/分鐘
‧檢測:215奈米。
‧注射液量:5-10微升。
純化的重組人類介白素-11的蛋白濃度
經層析程序分析後,以UV/Vis微孔板和比色管分光光度計(例如,來自Thermo Scientific的Multiskan GO),測量在280奈米下其UV吸光度來測定重組人類介白素-11的濃度。以下列公式計算出,重組人類介白素-11在280奈米下且於水中所進行測量的消光係數(Ec,單位為M-1 cm-1)為17,990: Ec=酪氨酸(Tyr)殘基數量 x 1490+色氨酸(Trp)殘基數量 x 5500+半胱胺酸(Cys)殘基數量 x 125蛋白質濃度(單位為莫爾濃度)計算方式如下:濃度=(於280奈米的吸光度)/Ec
或者,利用0.1%(即,1毫克/毫升)蛋白溶液的吸光度為0.944這個關係,可以直接藉由待測蛋白在280奈米下的紫外光譜直接計算其蛋白濃度,。利用280奈米下的吸光度來進行蛋白質定量,係測量芳族胺基酸(如色胺酸和酪胺酸)的吸光度,並且PEG基團的存在不會影響檢測結果。因此,本文所述的蛋白重量濃度排除了PEG分子的存在。這兩個值都可以通過ProtParam(一種計算給定蛋白的物理和化學參數的工具(10))所計算。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)、染色及免疫墨點法
以Biorad's Mini-PROTEAN系統合併使用預製凝膠,以進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE),藉此評估蛋白的近似分子量。所得聚丙烯醯胺膠體,用考馬斯藍染色或銀染,以進行觀察。
用購自Bio-Rad的Mini Trans-Blot Cell進行蛋白免疫墨點法。在蛋白質電泳之後,將SDS-PAGE上解析的蛋白於300mA電流、1小時的條件下轉移至硝酸纖維素膜上。隨後,以阻斷緩衝液(blocking buffer)來阻斷硝酸纖維素膜30分鐘至過夜,然後用TBS-吐溫-20緩衝液洗滌6次,每次5分鐘。將膜與用酪蛋白阻斷的且經稀釋的(1:2,000)抗人類介白素-11一級抗體(山羊IgG)在室溫下一起孵育1小時,以在膜上檢測出待測蛋白。在用TBS-吐溫-20緩衝液洗滌6次,每次4分鐘後,將膜與酪蛋白阻斷且經稀釋的(1:3,000)抗山羊IgG二級抗體,在室溫下一起孵育1小時。根據製造商的程序將膜轉移至淺盤並與1-step ultra TMB一起孵育。仔細監測顏色發展的過程,並在待測蛋白顯色帶(bands)的強度達到預設值時,在水中進行短暫清洗。
重組人類介白素-11的純化
雙水相萃取:以雙水相萃取,從發酵培養基中沉澱出可溶但 錯誤折疊的重組人類介白素-11。將固體的PEG8000直接加入到發酵培養基的濾液中,其最終濃度為6%至8%(w/v)。藉由溫和攪拌使固體聚合物完全溶解,隨後以4,000rpm離心10分鐘以回收沉澱出的蛋白質。
重組人類介白素-11的再折疊:將沉澱出的蛋白溶解於含有7M胍鹽酸鹽(GdHCl,pH值為8至9)的20mM磷酸鈉緩衝溶液中,最終濃度為2毫克/毫升,並在室溫下孵育1小時。加入11倍體積的4mM(pH值為8)磷酸鈉緩衝溶液以稀釋GdHCl,在室溫下孵育溶液2小時,使變性蛋白進行適當的再折疊。在進行離子交換層析之前,將前述所得步驟所得之溶液係使用4mM磷酸鹽緩衝液以超濾或透析的方式來進行簡單稀釋或緩衝液交換,以使其電導率低於6.5mS/公分。
陽離子交換層析:使用市售的層析儀器(例如來自GE Healthcare Life Sciences的ÄKTAprime plus)進行離子交換層析。在加載到層析管柱之前,將所得的稀釋溶液進行離心或通過0.45或0.2微米膜過濾以去除顆粒。將混合物裝載到經緩衝液A(含有20mM的磷酸鈉,pH為8)所平衡的Capto S管柱上。以緩衝液B(含有20mM的磷酸鈉及1M NaCl,pH為8)進行梯度(gradient-)或階梯式沖提(step-elution)來沖提蛋白。
疏水性相互作用層析:使用市售色譜設備(例如GE Healthcare Life Sciences的ÄKTAprime plus)來進行疏水性相互作用層析。匯集經過陽離子交換管柱(Capto S)層析而含有重組人類介白素-11的級分,並加至含有5mM DL-甲硫胺酸的0.5M硫酸銨中。在加載樣品之前,將得到的稀釋溶液進行離心或用0.45或0.2微米膜進行過濾以除去顆粒。將混合物加載至先經緩衝液A(在10mM,pH為7的磷酸鈉緩衝溶液中含有0.5M硫酸銨和5mM DL-甲硫胺酸)平衡過的丁基HP管柱。用含有10mM,pH為7磷酸鈉緩衝液的緩衝液B進行階梯式沖提或梯度沖提來沖提蛋白。使用額外的0.2M乙酸來沖提緊密結合的重組人類介白素-11。
以尺寸排阻層析法測定純度:共價和非共價聚集的重組人類介白素-11的含量(及其他高分子量物質),係藉由尺寸排阻層析法(SEC)進行分析。所述尺寸排阻層析法(SEC)係使用配有二極管陣列檢測器的市售UPLC系統(例如來自Thermo Scientific的UltiMate 3000快速分離LC 系統)。層析操作係使用以下方法進行:
‧管柱:Waters Acquity BEH200 SEC 1.7微米、4.6 x 150毫米、孔徑300Å(部件號186005225),配有防護柱套(部件號186005793)。
‧流動相:含有0.5M NaCl的25mM的pH7.0磷酸鈉
‧流速:0.3毫升/分鐘
‧檢測:280奈米
‧停止時間:10分鐘
‧注射5微克蛋白質
以LC/MS測定純度和分子量:通過反相(RP)層析分析重組人類介白素-11的純度,且分析係採用(a)提供配有二極管陣列檢測器的UPLC(例如來自Thermo Scientific的UltiMate 3000快速分離LC系統或Agilent的1290 Infinity UPLC系統)併用Agilent的Accurate Mass Q-TOF LC/MS系統。層析程序係使用如下程序進行:
‧管柱:ACQUITY UPLC PST C18管柱、300Å孔徑、1.7微米、2.1毫米 x 150毫米(部件號186003687),配有Acquity BEH C18 VanGuard預管柱(Pre-column),孔徑為300微米、1.7微米、2.1 x5毫米。(零件號186004629)。
‧流動相和梯度:流動相A:在水中的0.1%(v/v)三氟乙酸(TFA);流動相B:在95%(v/v)乙腈中的0.1%(v/v)TFA
流速:0.4毫升/分鐘。
‧管柱溫度:環境溫度。
‧檢測:214奈米。
‧注射:5微克。
梯度-典型的溶劑梯度如表2所示。
質譜分析法的操作參數如下
‧m/z範圍和極性:150-3000正極
‧源參數(Source parameters):氣體溫度300℃;氣體流量8公升/分鐘
‧霧化器35psig
‧護套氣體溫度380℃;護套氣流量11公升/分鐘
‧掃描源參數:
○VCap=3500
○噴嘴電壓1,000V
○碎裂器(Fragmentor)175
○削減器(Skimmer)1 65
○OctopoleRFPeak 750
細胞基底的生物學測量
重組人類介白素-11的生物活性係以使用7TD1細胞株所進行的細胞增殖測定法來計算。將介白素-11參考標準品和未知樣品於無菌環境下進行序列稀釋,最終濃度範圍為20,000納克/毫升至0.2皮克/毫升的(稀釋倍率為10,稀釋後總共9個濃度點)。各孔(含有4,000個7TD1細胞)(例如96孔板的孔)中加入50微升的重組人類介白素-11標準品或樣品,實驗為二重複。將細胞在含有5%CO 2的潮濕空氣中於37℃下孵育三天,以檢測它們在2微克/毫升介白素-11受體存在的情況下對不同濃度介白素-11的反應(12)。細胞增殖測定法,係使用多通道移液管將MTS溶液(20μl/孔)分配到各孔中,並在37℃培養箱中孵育2.5至3小時,孵育時間則取決於信號的發展。孵育後,使用UV/Vis微量培養板和比色管分光光度計(例如Thermo Scientific的Multiskan GO)讀取培養盤在490奈米下的吸光度。
藉由以y軸為490奈米的吸光度對x軸為濃度進行作圖,來測定劑量響應曲線的EC 50(半最大有效濃度)值。前述作圖係藉由GraphPad軟體Prism 6來擬合S形劑量-反應曲線,並以四參數非線性邏輯方程式進行:y=((a-d)/(1+(x/c)b))+d
其中
‧a為濃度趨近於零時最小漸近線的y軸;b是指曲線陡度的斜率
‧c為EC50
‧d為濃度接近無窮大時最大漸近線的y軸
‧x為濃度
‧y為490奈米處的吸光度。
專一生物活性由以下方程式而得出:專一活性(U/毫克)=參考標準品的專一活性 x (參考標準品的EC50/待測樣品的EC50)
以圓二色性測定二級結構
在室溫下,使用Jasco J-815分光偏振計及路徑長度為1.0cm的石英管記錄遠紫外圓二色性(CD)光譜。使用去離子水或5mM、pH為7的磷酸鈉將蛋白樣品稀釋至約0.02毫克/毫升。在遠紫外區域(190奈米至250奈米)監測二級結構,使用的操作參數包括掃描速率、帶寬和響應時間,分別設定在100納米/分鐘、1納米、及2秒。從3次掃描的平均來獲得光譜。
胜肽圖譜
蛋白水解溶液的製備,係將測序級胰蛋白酶以1/100(w/w)的量加至50mM、pH為8的磷酸鈉緩衝液(每毫升含有2毫克的蛋白)中。在室溫下孵育6小時後,加入最終濃度為0.1%的TFA(或甲酸),以終止反應。在注射之前,以離心方式或經0.2或0.4微米膜過濾,來除去沉澱物。使用LC/MS系統-Agilent 1290 Infinity UPLC系統合併Agilent 6540 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS系統進行胜肽鑑定。層析過程如下所述:
‧管柱:Zorbax 300 SB-C8,2.1x150毫米、5微米、300Å孔徑(Agilent Part No.883750-906)。
‧流動相和梯度:流動相A:0.1%(v/v)TFA的水溶液;流動相B:在95%(v/v)乙腈中的0.1%(v/v)TFA
‧流速:0.2毫升/分鐘。
‧檢測:214奈米。
‧注射:10微克。
質譜操作參數如下
‧m/z範圍和極性:400-1700正極
○氣體溫度300℃
○氣體流量8公升/分鐘
○霧化器35psig
○護套氣溫度350℃
○護套氣流量111/分鐘
‧掃描源參數:
○VCap=3500
○噴嘴電壓1,000V
○碎裂器175
○削減器165
‧碰撞能量
由胰蛋白酶切割的水解胜肽,其預估分子量列於表1中。每種蛋白水解肽的鑑定係使用MS產品工具手動進行,其生成在m/z光譜中,由胜肽裂解所產生,各種可能的碎片離子。表4中顯示了由重組介白素-11所得到的胰蛋白酶胜肽。
胺基酸組成
使用Hitachi高速胺基酸分析儀L-8900測定胺基酸的組成,其係通過離子交換機制提供水解胺基酸的分離,隨後以茚三酮進行衍化(derivatization)。在 水解之前,以製備1毫克/毫升(三重覆)的蛋白樣品,並在氮氣中,在6N HCl、110℃的條件下水解22小時。在80℃水浴中蒸發後,將水解的樣品再懸浮於0.02N HCl中。在這種酸性水解條件下,天冬醯胺酸和麩醯胺酸被脫醯胺基以形成它們各自的酸。色胺酸被完全降解。半胱胺酸和甲硫胺酸被氧化,且不易從酸性水解產物中所檢測。酪胺酸、絲胺酸和蘇胺酸被部分水解(13)。
高細胞密度發酵
甘油-補料批式發酵係在接種有蛋白酶缺陷菌株(pPINKS1-IL11-24)的1公升發酵罐中進行,該菌株從研究工作細胞庫的小瓶解凍,用於建立後續純化程序。在圖1A中繪出典型的細胞生長曲線,其顯示在外加甘油後,細胞培養液達到200OD。在甲醇誘發後,細胞密度持續增加至250OD,但在誘發後22小時後逐漸下降,這可能是由於營養不足造成的。在誘發後的22小時、46小時和70小時,取出發酵培養液的樣品,並藉由非還原性SDS-PAGE進行分析。圖1B和圖1C分別顯示了SDS-PAGE和免疫墨點法的典型結果。表現量並不是藉由ELISA所確定,因為該方法被發現總是低估產率。相對地,重組人類介白素-11的產率係通過目視檢查或密度測定法,以考馬斯藍所染出的樣品色帶強度對比於參考標準品的色帶強度來進行估算,且發現產率約為0.4-0.6g/L。在由考馬斯藍染色法所顯色的SDS-PAGE中,在約15KD處(圖1B),低於重組人類介白素-11的位置(約20KD),存在一些明顯的條帶,經以抗重組人類介白素-11的抗體所進行的免疫墨點法,證實其為降解的重組人類介白素-11(圖1C)。以RP-HPLC測定發酵培養基,表現量為約0.4毫克/毫升。
使用陽離子交換層析捕獲介白素-11
考慮到介白素-11的高等電點(pI=11),因此以陽離子交換層析法嘗試在pH為8的發酵培養基中捕獲重組人類介白素-11。藉由離心除去細胞糊狀物(cell paste)後,將數百毫升的培養液以超濾進行緩衝液的交換,或用至少10倍體積的水進行直接稀釋,使其電導率小於3mS/公分。為了回收重組人類介白素-11,將相當於約2毫克重組人類介白素-11的少量溶液裝載到1毫升Capto-S(陽離子交換劑)管柱(先經20mM、pH為8的Tris緩衝液所 平衡)上。結合至管柱的蛋白以NaCl進行梯度沖提(NaCl的梯度濃度最高至1M)。SDS-PAGE和免疫墨點法的結果顯示,在流通級分(flow-through fractions)中發現有重組人類介白素-11,並且不與管柱結合(數據未顯示)。為確保使用陽離子交換劑純化系統的適用性,將0.5毫克參考標準品的重組人類介白素-11加入(spiked in)1毫升發酵培養液中作為陽性對照,接著進行上述純化程序。回收率為約30%,意指陽離子交換劑適用於分離重組人類介白素-11,因其可用相同的方式成功地以NaCl梯度進行沖提。由流通級分中回收重組人類介白素-11,係嘗試以陰離子交換劑(Capto-Q)進行分離。將相當於約2毫克重組人類介白素-11的少量溶液裝載到1毫升Capto-Q管柱(陰離子交換劑)上,以回收流通液(flow-through)中的重組人類介白素-11。該管柱預先用20mM、pH為8的Tris緩衝液進行平衡,然後用NaCl進行梯度沖提(NaCl的梯度濃度最高至1M)。令人驚訝的是,SDS-PAGE結果顯示,在含有NaCl的組分中成功地回收重組人類介白素-11,且在流出液中並沒有重組人類介白素-11(數據未顯示)。重複此純化過程以形成一致且可重複的結果,其證實了本文方法所表現的重組人類介白素-11的意想不到的離子特性。
本發明人注意到在使用發酵培養基樣品時,在以細胞為基礎的增殖測定法中,重組人類介白素-11的生物活性偏弱,以及使用ELISA定量時會低估重組人類介白素-11含量。有趣的是,當發酵培養液加入重組人類介白素-11的參考標準品時,生物活性得以恢復(數據未顯示)。發明人得出結論,離子交換劑的意外結合(或缺乏結合)和生物活性的喪失,表示本文方法所表現的蛋白,其物理性質已不同。
雙液相萃取
在進一步研究之前,表現的蛋白藉由簡單的雙水相萃取從發酵培養基中所回收。通過加入聚乙二醇8000,萃取物被沖洗(develop)以從液相沉澱非天然的重組人類介白素-11。將固體PEG-8000加至1毫升經過濾後的發酵培養液中,最終濃度為2.9、3.8、5.0、6.2、7.3和8.2%(w/v)。在4℃下孵育1小時後,僅在含有6.2、7.3和8.2%PEG 8000的樣品中可見到渾濁情況。以台式離心機(desktop centrifuge)於最高速度下離心5分鐘,來收集沉澱物; 且沉澱出的蛋白用1毫升、pH值為8的磷酸鈉緩衝液所重構。如圖2所示,通過加入低至6%(w/v)的PEG8000,幾乎所有的重組人類介白素-11都可以從沉澱中回收。在隨後的研究中,除非另有說明,重組人類介白素-11係以PEG沉澱方式自培養基中回收。
發酵培養基中的分泌的重組人類介白素-11的結構特徵結構特徵係使用圓二色性(CD)和尺寸排阻層析法來進行研究。藉由於發酵培養基中加入PEG8000(最終濃度為8%)沉澱出的重組人類介白素-11係經液體兩相萃取法進行回收,之後其再懸浮於去離子水中(濃度約0.02毫克/毫升)。圖3顯示典型的CD光譜,其展示出顯著的螺旋結構(如在約222奈米和210奈米處的負條帶和在約195奈米處的正條帶所示)。此一結果顯示,粗製重組人類介白素-11維持著螺旋骨架。
至於尺寸排阻研究,由PEG所沉澱出的蛋白質被再懸浮於20mM、pH為7的磷酸鈉緩衝液中,最終濃度約1毫克/毫升。使用Acquity BEH200 SEC管柱(能夠分離10K至450K Da範圍內的球狀蛋白質)比較待測樣品與重組人類介白素-11的參考標準品兩者的分子大小。結果如圖4所示,來自發酵培養基的粗製重組人類介白素-11具有意想不到的高分子量。這顯示分泌的重組人類介白素-11於培養培養液中以可溶性聚集物存在。與CD數據綜合判斷,分泌的重組人類介白素-11維持著螺旋結構,但單體分子彼此間傾向以非共價結合而形成分子間螺旋束(intermolecular helical bundles)。發明人相信,不受理論束縛,這是原始過程中產量低的原因,進而導致生化特性的改變和生物活性損失。
在發酵培養基中使用非離子表面活性劑防止自聚集
儘管畢氏酵母菌通過真核折疊途徑表現蛋白,但尚未有文獻指出高密度酵母菌培養中的分泌型重組人類介白素-11有自聚集和錯誤折疊的情況。這種聚合形式造成如隨後純化步驟中的生物活性損失和低產率等重大問題。防止聚集其中一個方法是在發酵培養基中引入添加劑或表面活性劑(14)。為了研究這個問題,0.1%的吐溫-80被引入到1公升的高密度補料批式發酵培養液中。在收集後,在130毫升發酵培養基中加入10倍的水以降低電導率。在以0.45或0.2微米膜進行簡單過濾而除去顆粒物後,將所得溶液加載至陽離子交換 劑(Capto-S)上以回收有生物活性的重組人類介白素-11。圖5顯示典型的純化曲線。在加載到管柱上後,用50mM NaCl緩衝液洗滌該管柱,然後用10倍管柱體積的NaCl液進行梯度洗滌(NaCl液的梯度濃度為50至300mM)。以SDS-PAGE分析所選級分,將測定含有重組人類介白素-11的級分合併,得出步驟回收率為13.6%。這項發現顯示0.1%吐溫-80可以在一定程度上降低發酵過程中自聚集的情況,但具生物活性的重組人類介白素-11的回收率可能未如人意。
重組人類介白素-11的再折疊優化
溶液中蛋白的再折疊是許多生化因素作用的結果,包括離子強度、pH值、溫度、蛋白濃度等。尿素、硫酸銨、SDS和胍鹽酸鹽(GdHCl)已被實驗證實可作為用於重組人類介白素-11再折疊過程中的變性劑。在以PEG進行沉澱後,從2毫升發酵培養基沉澱出的蛋白,於5毫克/毫升的濃度下,於含有變性劑的下列緩衝溶液中進行重構:8M尿素、1M硫酸銨、0.5%SDS或6M GdHCl。以水稀釋而使電導率小於5mS/cm後,只有天然的且具生物活性的重組人類介白素-11會吸附到陽離子交換劑上,且才能被NaCl鹽溶液以梯度沖提出來。如圖6A和6B的結果顯示,除了6M GdHCl之外,變性劑無法使重組人類介白素-11復性(圖中顯示,來自含有6M GdHCl的再折疊溶液的重組人類介白素-11成功地利用NaCl溶液以梯度沖提而出)。在其他研究中,在以PEG進行沉澱後,從2毫升發酵液中沉澱出的蛋白,溶解於2毫升鹼性溶液中,前述鹼性溶液由0.1N NaOH、含70%乙醇的0.1N NaOH、或含1%吐溫-20的0.1N NaOH所構成。以水稀釋並調節pH值至8後,以陽離子交換劑從前述溶液中回收到的天然重組人類介白素-11量很少。結果顯示,在本文的較佳實施例中,使用胍鹽酸鹽可以成功地以高產率來復性重組人類介白素-11。
將PEG蛋白沉澱物,以7M GdHCl溶液溶解成不同濃度的樣品,藉此對在再折疊過程中所使用的蛋白濃度進行最佳化。以PEG進行沉澱後,收集來自2毫升發酵培養基的蛋白,並在7M GdHCl緩衝溶液中重構成不同的蛋白濃度。藉由簡單稀釋以進行再折疊後,以前述的陽離子交換劑自各樣品中分離出重折疊重組人類介白素-11。如圖7所示,比較所觀察到各 樣品的峰面積與重組人類介白素-11參考標準品的峰面積,以估算再折疊的產率。結果顯示,所有測試濃度下均發生再折疊的情況,而在約2毫克/毫升的蛋白濃度下具有最佳的廣泛產量。
許多共溶質可以作為折疊增強劑或聚集抑制劑而加入溶液中以幫助蛋白的再折疊。典型的共溶質包括PEG、環糊精、精胺酸,脯胺酸和蔗糖。這些共溶質的作用機制尚不清楚。發明人研究了兩種共溶質(0.5M精胺酸和0.4M蔗糖)添加到再折疊溶液中的效果。在藉由稀釋以進行再折疊後,如上所述,以陽離子交換劑分離出各樣品中的再折疊重組人類介白素-11。再折疊的產率係藉由評估峰高來進行估算(典型結果顯示在圖8中),並且結果顯示具有相近的再折疊重組人類介白素-11產量。發明人已經發現,精胺酸和蔗糖都不能促進重組人類介白素-11的再折疊,並且在重組人類介白素-11純化過程中可以不使用共溶質。如此一來,其有利地簡化了隨後的純化過程。
將PEG蛋白沉澱物在不同pH值下進行溶解,藉此對於再折疊過程中所使用的pH值進行最佳化。由2毫升發酵培養基中收集以PEG進行沉澱的蛋白,以7M GdHCl緩衝液於不同pH值下將PEG沉澱物進行重構,最終蛋白濃度為2毫克/毫升。藉由使用相應的pH值溶液以簡單稀釋來進行再折疊後,以如上述,以陽離子交換劑自各樣本中分離出再折疊重組人類介白素-11。如圖9所示,比較各樣品所觀察到的峰面積與由重組人類介白素-11參考標準品所產生的峰面積,藉此評估再折疊的產率。所有測試過的pH值都發生再折疊的現象,並且在約pH值為8.5下顯示出寬泛的最佳值。
利用陽離子交換層析分離再折疊的重組人類介白素-11以陽離子交換介質來分離蛋白的實驗,係以含有約94.2毫克分泌型重組人類介白素-11的236毫升發酵培養基來進行。以8%的PEG8000(w/v)來沉澱出蛋白,並以4,000rpm離心15分鐘來回收。捨棄上清液後,以含有7M GdHCl的20mM、pH為8的磷酸鈉緩衝液對固相進行重構,最終蛋白濃度為2毫克/毫升。溫和攪拌蛋白溶液,並在室溫下孵育1小時,以使蛋白完全溶解。藉由將蛋白溶液倒入10倍體積不含胍的4mM、pH為8的磷酸鈉緩衝液來啟動復性/再折疊的過程。將所得溶液在室溫下進一步孵育額外一小時, 接著以超濾進行緩衝液交換,或用另外的緩衝溶液直接稀釋,使電導率小於6mS/公分。使用Capto-S管柱(1公分×10公分)進行陽離子交換層析,圖10中顯示典型結果。將樣品以12毫克/毫升樹脂的量加載到管柱上後,以50mM的NaCl緩衝液洗滌管柱,隨後將10倍管柱體積的NaCl液(濃度梯度為50至300mM)以梯度濃度方式施加至管柱。合併收集含有重組人類介白素-11的級分(如非還原性SDS-PAGE所示),步驟產率為約40%至約60%。另藉由質譜與RP-UPLC來分析產物,以得知純化蛋白的分子量(參見圖11A和11B)。在UPLC上觀察到的主要峰的反摺積質量為19046.7Da,其與重組人類介白素-11在19,047Da處的理論平均質量一致。液相層析圖中的重組人類介白素-11之前的小峰(佔8.6%)為其氧化類型,因為其反摺積質量比重組人類介白素-11大15.8Da,對應於大約單個氧的質量(16Da)。之後,將經過再折疊過程後的純化重組人類介白素-11進行以細胞為基礎的檢測,結果顯示在經過復性過程後,其活性完全恢復(數據未顯示)。
對自Capto-S管柱的主要峰後所沖提出的小肩峰(small shoulder)進行進一步測試。MS結合RP-UPLC的分析結果顯示一單一峰值,其保留時間(retention time)與重組人類介白素-11參考標準品相同,且其分子量與理論質量一致(數據未顯示)。SDS-PAGE的分析結果也揭示,其遷移位置(migration position)與重組人類介白素-11參考標準品相同(數據未顯示)。在使用含有0.5M NaCl的25mM、pH 7.0的磷酸鈉作為沖提液以進行尺寸排阻層析後,前述沖提所得的小肩峰為雙峰而不是單峰。雙峰中其中一個峰,於沖提過程中,其保留時間與天然重組人類介白素-11的保留時間相同,另一峰則較早被沖提出,且應為二聚體形式(參見圖12)。由於隨後用0.5M硫酸銨進行疏水性相互作用層析進行純化可能會破壞前述聚集體,所以這些部分與主池(main pool)合併。
藉由將非動物來源的蛋白腖添加至發酵培養基來降低氧化重組人類介白素-11
蛋白的氧化是製造過程中與產品相關雜質的一個非常普遍的來源,這是由於在好氧發酵過程中(其使用基礎培養基加上0.9%硫酸銨作為氮源)不斷暴露於各種形式的活性氧物質(ROS,如氧自由基)。在從Capto-S管柱純化後, 藉由RP-UPLC定量,在所得出的純化重組人類介白素-11中,氧化重組人類介白素-11約占12.6%。為了降低氧化產物的含量,用0.5%植物蛋白腖代替硫酸銨。植物蛋白腖源自於大豆蛋白腖,其中包含含硫胺基酸,其不僅可以提供氮源,還可以消除或減少發酵過程中活性氧物質的形成。發明人相信將其他含硫肽、含硫胺基酸(例如半胱胺酸,甲硫胺酸)和/或含硫有機化合物添加至發酵培養基中可以提供類似的效果。在以前述方式改造後的發酵培養基中,經Capto-S管柱純化後,所得到的氧化重組人類介白素-11其含量減少至約6.6%,接近5.0%的預計驗收標準。產物以一第二層析步驟以進一步精煉,其係以疏水性相互作用層析來去除氧化重組人類介白素-11。
以疏水性相互作用層析去除氧化的重組人類介白素-11
將DL-甲硫胺酸固體加入自Capto-S管柱所沖提出的級分合併池中,其最終濃度約為5mM,並加入硫酸銨固體,其最終濃度約為0.5M。以0.2微米或0.45微米的膜進行過濾,之後將所得的蛋白溶液裝載到的丁基HP管柱(1公分×10公分)上(樣品負載量為8毫克/毫升床體積(bed volume)),然後用含有0.5M硫酸銨的緩衝溶液進行洗滌。隨後用含有0.475M硫酸銨的緩衝溶液以超過15倍管柱體積的量洗滌管柱。使用10mM、pH7的磷酸鈉緩衝液沖提出精煉的重組人類介白素-11產物(參見圖13)。通過RP-UPLC定量每個級分中氧化重組人類介白素-11的含量,結果顯示氧化重組人類介白素-11的含量有所降低。匯集其中氧化物質少於5%的級分,得出其步驟回收率約為49%。
緩衝液變化和濃度
從丁基HIC管柱沖提出的產物含有大量的硫酸銨,隨後以10mM、pH7的磷酸鈉緩衝液進行大量透析和/或超濾來去除這些硫酸銨。在冷藏時將濃度調整到高於6毫克/毫升。
重組人類介白素-11的特性分析
對最終純化的批量重組人類介白素-11進行各種分析,包括特性、純度和效力。以16%凝膠(如圖14所示)進行非還原性SDS-PAGE,來分析其純度和相對分子量,結果顯示高純度的單一條帶。
純度(和相關雜質)係以RP-UPLC進行測定。如圖15所 示,重組人類介白素-11的純度高於95%。重組人類介白素-11的製備物含有約2.5%的氧化重組人類介白素-11,其與市售產品(Nemega)的相當(其含量為2.4%)。如圖16所示,藉由SEC-UPLC對重組人類介白素-11單體含量進行定量,結果顯示其純度為99%。
以LC-MS來測定純化出的重組人類介白素-11的分子量,結果顯示19,045.7Da的反摺積質量(參見圖17)。這與19,047Da的理論平均分子量(偏差-68.2ppm)非常吻合。另外,以胜肽圖譜分析合併使用LC-MS來鑑定所純化出的重組人類介白素-11其胺基酸序列。蛋白被胰蛋白酶所消化,且胰蛋白酶選擇性地水解離胺酸和精胺酸胺基酸殘基的C端側的肽鍵。每個峰的特性以m/z比率和MS/MS裂解加以認定。除了T11、T16和T19外,所有的蛋白水解肽均被成功地指定(如圖18所示),其序列覆蓋率為88.7%。
以Applied Biosystems LC 494 Procise®蛋白測序系統來測定N端胺基酸序列,確認出起始的15個胺基酸為:Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala。樣品以6N的HCl在氮氣環境、110℃下水解22小時進行預處理,之後測定水解產物的胺基酸組成。在這種酸性水解條件下,天冬醯胺酸和麩醯胺酸脫醯胺形成相應的酸。色胺酸被完全降解。半胱胺酸和甲硫胺酸被氧化,且不易從酸水解產物中所檢測。酪胺酸、絲胺酸和蘇胺酸被部分水解。表5中顯示了胺基酸組成的實驗結果。大多數胺基酸的摩爾比(mole ratio)與預期值一致。發明人認為,異亮胺酸、酪胺酸和苯丙胺酸的觀察結果係受其含量相對較低所影響。
以7TD1細胞增殖測定法來測定純化出的重組人類介白素-11其生物活性。圖19顯示典型的結果。以本文所述方法所產生的人類介白素-11以及人類介白素-11參考標準品,兩者的EC50觀測值分別為1.1和2.2ng/毫升,此一結果顯示以本文所述方法所產生的人類介白素-11具有相當的效力。
如上所述,本文提供了一種以酵母菌來生產和分離出高度純化的重組人類介白素-11的新方法。畢氏酵母菌成功表現出分泌型的重組人白細胞介素-11,但由於重組人類介白素-11的自我聚集,導致表現產物無生物活性。在高密度補料批式培養中添加非離子表面活性劑(如吐溫-80)僅使有生物活性的重組人類介白素-11僅約占總產量的10%。然而,添加吐溫-80可能會因發酵過程中的攪動而導致泡沫的產生。
對於本領域技術人員應當明瞭,在不脫離本發明概念的情況下,除了前述已記載的實施例之外,可能存在其他更多的修改形式。因此,任何未脫離本發明之精神與範疇,而對其進行之等效修改或變更,均應包含於後附之申請專利範圍中。此外,在解釋說明書及請求項時,所有技術用語應以與上下文一致之最廣的可能方式進行解釋。。特別是用語「包含」及「包括」,應解釋為其係以非排他性的形式指稱元件、成分或步驟,其係表示所 指稱之元件、成分或步驟可與其他未被明確提及的元件、成分或步驟一起存在、使用或結合。。凡是說明書或申請專利範圍中提及某物係選自由A、B、C...及N所組成的群組中的至少一者時,該敘述應被解釋為僅需要群組中一個元件存在即可,而非必須要有A加N、或B加N等等。
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Claims (20)
- 一種用於製造介白素-11的方法,包括:將編碼一重組介白素-11的一表現載體引入至一酵母菌中,其中該重組介白素-11不為一融合蛋白的形式;在誘發介白素-11表現的條件下在一培養基中培養該酵母菌;從該培養基的固體中分離一上清液;使該上清液與濃度為4%(w/v)至12%(w/v)的具有2000D至20000D之平均分子量的聚乙二醇接觸,以形成包括一沉澱物的一懸浮液;將該沉澱物溶解在濃度為4M至10M之含胍鹽酸鹽的一溶液中,以生成一粗製介白素-11溶液;降低該胍鹽酸鹽的濃度至0.7M或更低,以生成一再摺疊介白素-11溶液;使該再摺疊介白素-11溶液與一離子交換介質接觸;以及從該離子交換介質中沖提出一純化介白素-11。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該聚乙二醇的最終濃度係6%(w/v)及9%(w/v)之間。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該聚乙二醇的平均分子量為4000D至12000D。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中在該溶解步驟中該胍鹽酸鹽濃度為5M至9M。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該降低胍鹽酸鹽濃度的步驟包括在降低該變性劑的濃度後在攝氏18至25度下孵育(incubating)約1小時。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該離子交換介質包括陽離子交換介質。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該降低胍鹽酸鹽濃度的步驟係藉由稀釋該粗製介白素-11溶液所完成。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該降低胍鹽酸鹽濃度的步驟係藉由交換該粗製介白素-11溶液的緩衝液所完成。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該製造該再摺疊介白素-11溶液的步驟係在約0.1毫克/毫升至約10毫克/毫升的蛋白濃度下進行。
- 如申請專利範圍第9項所述的方法,其中該製造該再摺疊介白素-11溶液的步驟係在低於約2毫克/毫升至的蛋白濃度下進行。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,更包括以下步驟:使該純化介白素-11與一疏水性交互作用介質(hydrophobic interaction media)接觸;以及從該疏水性交互作用介質沖提出一精煉介白素-11,其中,相對於該純化介白素-11,該精煉介白素-11具有降低的氧化介白素-11含量。
- 如申請專利範圍第11項所述的方法,其中該疏水性交互作用介質係選自於由丁基、己基、辛基及苯基所組成之群組。
- 如申請專利範圍第11項所述的方法,其中該經精煉的介白素-11的純度至少約95%。
- 如申請專利範圍第11項所述的方法,其中該經精煉的介白素-11包括約5%或更少的氧化介白素-11。
- 如申請專利範圍第11項所述的方法,其中該經精煉的介白素-11包括約1%或更少的介白素-11二聚體。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該製造該復性介白素-11溶液的步驟係在不存在共溶質(co-solutes)的條件下進行。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該製造該再摺疊介白素-11溶液的步驟係在pH值約4至約12的條件下進行。
- 如申請專利範圍第17項所述的方法,其中該製造該再摺疊介白素-11溶液的步驟係在pH值約7至約11的條件下進行。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中該精煉介白素-11在使用7TD1細胞株進行測試時具有約4 x 106U/毫克至約1.2 x 107U/毫克的生物活性。
- 如申請專利範圍第19項所述的方法,其中該精煉介白素-11在使用7TD1細胞株進行測試時具有約6 x 106U/毫克的生物活性。
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