CN102089319A - 蛋白质的重折叠方法 - Google Patents

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Abstract

通过本发明，可以提供如下方法：通过在pH6.5～9.0下，将失去了高级结构的蛋白质和月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂的1～3％水溶液相接触，得到该蛋白质的可溶化液，将得到的可溶化液加入含有0.1～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，通过使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂降低至0.02～0.275％，生产恢复了天然状态的高级结构的蛋白质。通过本发明，可以在将表面活性剂平稳地从蛋白质上脱离的同时，能够简便地恢复蛋白质中的天然状态的高级结构。

Description

蛋白质的重折叠方法
技术领域
本发明涉及在因为经不溶化处理的或是失去了高级结构而失去了活性和稳定性的蛋白质中恢复天然状态的高级结构的方法(重折叠方法)。
背景技术
使用大肠菌等作为生产宿主来生产基因重组蛋白质，得到在水中不溶性变性的蛋白质。这样的蛋白质也叫做变性蛋白质。因为变性蛋白质失去了活性和稳定性，故在将此蛋白质作为医药品等使用时，必须进行引导以使其具有天然状态的高级结构。已知蛋白质的重折叠方法可以作为在此种场合下使用的方法。
但是，因为在此重折叠中使用的试剂和操作方法，必须根据蛋白质进行适当地选择，故对没有重折叠经验的操作人员来说并非可以简单地实施的技术。此外，即使是具有充足的经验，在蛋白质具有复杂的高级结构，在重折叠过程中易引起缔合·凝集的情况下，也不能容易地得到天然状态。
为了解决这些问题，提出了一系列新的重折叠方法。例如，到目前为止有报告使用色谱柱来降低缔合凝集风险的柱重折叠法(非专利文献1)；将目的物固定在载体上来抑制缔合凝集的固定化重折叠法(非专利文献2)；使用酸性和碱性缓冲液来代替变性剂，以部分变性状态而可溶化的pH提取法(非专利文献3)；和分子伴侣共存的方法(非专利文献4)；将反胶束以分子伴侣样使用的方法(非专利文献5)；利用表面活性剂的胶束的方法(非专利文献6)；在超过3000个大气压的超高压下不使用变性剂而进行提取的高压重折叠法(非专利文献7)；以及这些方法的并用法或变形法。
这些方法中最令人注目的技术就是，将变性剂提取后的蛋白质用含有表面活性剂的缓冲液稀释而抑制缔合凝集并同时部分地恢复结构，在下一步中使用环糊精等的表面活性剂结合剂强行地使表面活性剂从蛋白质中脱离出来而完成结构形成的多段式重折叠法的“人工分子伴侣系”。此技术的长处是，基本不必进行试错实验，仅需依照已确定的方法探索几种条件，在效果上可以抑制作为最深刻的问题的缔合凝集。有使用此技术而成功重折叠的例子的报告，也对此方法的变法进行了后续的研究(非专利文献8)。
但是，随着人工分子伴侣系的适用例的增加，我们知道，将添加的表面活性剂从蛋白质中脱离并不像报告的那样简单，为了发现适当的操作条件，依然需要繁杂的实验。此外，也有人诟病，多阶段操作引起步骤的繁杂而在工业生产的利用上引起了限制(非专利文献9)。
这样，即使是评价最高的人工分子伴侣系，对于没有经验的工作人员来说，作为容易且有效的对蛋白质进行重折叠的方法来说也不是十分合适的。
另一方面，已知有使用酰化肌氨酸而使蛋白质重折叠的方法，但酰化肌氨酸唯有在稀释后才能从蛋白质上脱离，如果不用特殊的方法除去，就不能恢复蛋白质的天然状态的高级结构(非专利文献10，专利文献1)。已知也有使用强碱调节的含有月桂酰-L-谷氨酸的表面活性剂溶液来使不溶性牛生长激素可溶化，通过超滤法降低表面活性剂浓度而重折叠的方法(专利文献2)，但此种方法难于有效地恢复生长激素以外的蛋白质的天然状态。此外，使蛋白质和高强度的碱性pH相接触会在蛋白质中引起不能修复的脱酰胺反应等化学变化。
[专利文献1]EP 0263902 A
[专利文献2]US专利6410694
[非专利文献1]A.Jungbauer，W.Kaar，R.Schlegl：Current opinion in Biotechnology 15，487-494(2004)
[非专利文献2]M Matsubara，et al.：FEBS LETT.，342，193-196(1994)
[非专利文献3]S.M.Singh and A.K.Panda：Journal of Bioscience and Bioengineering 99，303-310(2005)
[非专利文献4]D.Rozeman and S.H.Gellman：Journal of Biological Chemistry 271，3478-3487(1996)
[非专利文献5]A.J.Hagen，T.A.Hatton，and D.I.C.Wang：Biotechnol Bioeng.35，955-965(1990)
[非专利文献6]G.Zardeneta and P.H.Horowitz：Analytical Biochemistry 223，1-6(1994)
[非专利文献7]M.B.Seefeldt，Y.S.Kim，J.Carpenter，T.W.Randolph：Protein Science 14，2258-2266(2005)
[非专利文献8]S.Machida，S.Ogawa，S.Xiaohua，T.Takaha，K.Fujii，K.Hayashi：FEBS Lett.486，131-135(2000)
[非专利文献9]H.Lanckriet and A.P.J.Middelberg：Biotechnology Progress 20，1861-1867(2004)
[非专利文献10]Richard Burgess：Methods in Enzymology.273，145-149(1996)
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明的目的在于提供在平稳地将表面活性剂从蛋白质上脱离的同时，恢复蛋白质的天然状态的高级结构的简单的重折叠方法。
解决课题的手段
本发明者们通过深入研究，结果发现只要使用特定的表面活性剂水溶液使变性蛋白质可溶化，将此可溶化液稀释于含有精氨酸和精氨酸衍生物的缓冲液中，就可以在将特定的表面活性剂从变性蛋白质上脱离的同时恢复该变性蛋白质的高级结构。
即，本发明提供了由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质生产恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序。
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有C8～C16酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0.02～0.5％的工序，
(3)回收恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的工序。
此外，本发明提供了使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有C8～C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0.02～0.5％的工序。
此外，本发明提供了由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质得到恢复其天然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序：
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.1～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的浓度降低至0.02～0.275％的工序。
此外，本发明提供了使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.1～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的浓度降低至0.02～0.275％的工序。
发明的效果
依照本发明，不需重折叠的经验和特殊的装置，能够简单且有效地重折叠蛋白质。此外，依照本发明，能够在蛋白质恢复天然状态的高级结构的过程中抑制引起的蛋白质的缔合·凝集。
虽然并不拘泥于任一理论，但通常情况下，在表面活性剂从蛋白质上脱离的同时蛋白质会缔合·凝集，不过依照本发明，使用特定的表面活性剂生成变性蛋白质后，稀释，并在此稀释液中加入精氨酸或精氨酸衍生物，从而在将本发明中使用的特定的表面活性剂从蛋白质上脱离的同时，精氨酸或精氨酸衍生物能抑制蛋白质的缔合·凝集性。
发明的最佳实施方式
[蛋白质]
本发明中使用的蛋白质为经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质。不能明确地区分经不溶化处理的蛋白质和失去了高级结构的蛋白质，只要是其高级结构和天然状态的不一样的蛋白质均可用于本发明中。适用于2级结构主要是α-螺旋组成的蛋白质(例如IL-6)、β-片层组成的蛋白质(例如scFv和Fab)、或是两者组成的蛋白质(例如转谷氨酰胺酶)。可以适用于单体蛋白(IL-6等)，也可适用于多聚体蛋白(Fab等)。可以适用于分子内或分子间没有二硫键结合的蛋白质(例如转谷氨酰胺酶)，也可适用于具有该键的蛋白质(例如IL-6、scFv、Fab)。
例如，将大肠杆菌等微生物置于生产宿主中配制的不溶性基因重组蛋白质通常在100g水中的溶解度为0.001g以下(25℃)，可以用于本发明中。可以是受到任何压力而从可溶性状态变为不溶化的蛋白质。对于蛋白质的形态并无特殊限制，例如颗粒状、粉末状、纤维状均可。对于蛋白质的一级结构和二级结构的特征并无特殊限制。和单体或低聚物结构也无关系。即使是蛋白质的片段也可以使用。例如，重均分子量(室温条件下，使用超离心分析法和静态光散射分析法来测定)从5000道尔顿至150000道尔顿均可使用与本发明中。
具体而言，可列举人白细胞介素-6那样的细胞因子；生长因子、各种激素、分化诱导因子等获得特定的高级结构而发挥机能的蛋白质性配体；转谷氨酰胺酶等的酶；蛋白质性酶阻断剂；以及含有免疫球蛋白结构的抗体相关分子。
作为抗体相关分子，可列举抗体可变区(Fv、fragment of variable region)、单链抗体可变区(scFv、single chain Fv)、抗原结合部位(Fab、fragment of antigen binding)、抗原结合部位(Fab′)、2价的抗原结合部位(F(ab’)2)等的抗体片段；显示双特异性的单链抗体可变区(bispecific single chain Fv)或双链抗体(Diabody)、抗体可变区和抗体Fc区的一部分融合而2聚体化的人工小型抗体(Minibody)等的人工抗体；构成抗原结合部位或抗体可变区的区域中的轻链来源或重链来源的单独的区域组成的单域抗体(single-domain antibody)、将蛋白质和肽融合于抗体Fc区的Fc融合蛋白质(Fc Fusion Protein)等。
更具体而言，可列举像HyHEL-10 scFv那样的单链抗体可变区(scFv)，例如培克珠单抗(Pexelizumab)(scFv)、作为抗原结合部位(Fab)的阿昔单抗(Abciximab)(商品名，ReoPro)、雷珠单抗(ranibizumab)(商品名，LUCENTIS)或培舍珠单抗(Certolizumab)(商品名，Cimzia)、抗荧光素scFv Fc融合体那样的Fc融合蛋白质(Fc Fusion Protein)、例如罗米司亭(romiplostim)(商品名，Nplate)、利洛西普(rilonacept)(商品名，ARCALYST)、阿巴西普(abatacept)(商品名，ORENCIA)或阿来西普(alefacept)(商品名，AMEVIVE)等经不溶化处理的或失去了高级结构的。尤其优选抗体片段。这些抗体相关分子的结构在公知的论文例如Holliger P.and Hudson PJ.Nature Biotechnology 23(9)，1126-1136(2005)中有详细的描述。
免疫球蛋白结构以外的，例如以锚蛋白重复序列和纤连蛋白III型区域和脂笼蛋白等为支架结构制作的人工的亲和性分子也可以使用于本发明中。
前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质，优选在区域中具有免疫球蛋白结构的蛋白质。
前述在区域中具有免疫球蛋白结构的蛋白质，进一步优选具有一部分抗体区域的抗体片段，双链抗体或小型抗体的人工抗体或Fc融合蛋白质。
前述具有一部分抗体区域的抗体片段，优选scFv、Fab、Fab′或(F(ab′)2)。
前述Fc融合蛋白质，优选在抗体Fc区域融合有细胞因子、受体细胞外区域或肽的蛋白质。
[工序(1)用表面活性剂引起的变性蛋白质的可溶化]
■表面活性剂的种类
在本发明中，具有C8～C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸(月桂酰肌氨酸、月桂酰-Sar)、癸酰丙氨酸(月桂酰丙氨酸、月桂酰-Ala)、癸酸或者它们的盐(例如钠盐、钾盐)、氯化月桂基三甲基铵(LTAC)及它们的混合物作为能够使经不溶化处理的或失去了高级结构的成为非天然形状的蛋白质溶解于水中的表面活性剂(可溶化剂)而发挥功能。
前述表面活性剂优选具有C8～C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸或者它们的盐。进一步优选具有C8～C16的酰基的二羧酸或其盐。具有前述C8～C16的酰基的二羧酸更优选月桂酰谷氨酸(月桂酰-Glu)、月桂酰天冬氨酸(月桂酰-Asp)或月桂酰亚氨二醋酸。
本发明中使用的月桂酰-Glu、月桂酰-Asp、月桂酰-Sar、月桂酰-Ala可以为D型、L型、DL型的中任一种。在经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质为IL-6等细胞因子和转谷氨酰胺酶等的酶的情况下，优选月桂酰-Glu、月桂酰-Asp、月桂酰亚氨二醋酸或它们的盐，或它们的混合物。作为表面活性剂，因为月桂酰-L-Glu对所有的不溶性蛋白质的可溶化力均优秀，在稀释时不持续与蛋白质结合而容易除去，因而添加，且高纯度的月桂酰-L-Glu试剂能便宜地购买到，故尤为优选。
■表面活性剂的浓度
月桂酰-Glu、月桂酰-Asp、月桂酰亚氨二醋酸、月桂酰-Sar、月桂酰-Ala、癸酸或LTAC为1～3％，优选1.5～2.8％，更优选1.75～2.5％的水溶液。在这样的浓度范围内，蛋白质的可溶化效率非常高，且在随后操作的稀释倍率上可以维持在适度的水平。
■pH
和变性蛋白质的性质契合，该水溶液的25℃的pH可以选择pH6.5～9.0，优选pH7.0～8.5的温和的条件。需要说明的是，在本发明中，pH可以使用装有pH电极的pH计进行测定。pH的调节可以使用氢氧化钠等碱来进行。作为该水溶液，也可以使用缓冲液。
■接触温度及时间
将这样配制的表面活性剂水溶液和变性蛋白质相接触，得到蛋白质的可溶化液。可以在表面活性剂水溶液中加入变性蛋白质，也可在变性蛋白质中加入表面活性剂水溶液。接触通常可以在5～40℃下，优选在15～40℃下放置而进行。在这样的范围内，化学反应导致的断裂和氧化等的修饰被抑制在最低限度，故而优选。放置时间通常为0.1～3.0小时，优选0.5～1.0小时。在这样的范围内，化学反应导致的断裂和氧化等的修饰被抑制在最低限度，故而优选。接触中可以搅拌。
变性蛋白质或可溶化水溶液的量调节为经可溶化的蛋白质浓度为1～20mg/ml，即使是在后续的稀释过程中出现极端情况蛋白质浓度也不降低，故而优选。
蛋白质是否可溶化了，可以经例如通过目视进行浊度判定，或在280nm下的紫外线吸收光谱法等进行确认。
[工序(2)：使用添加剂溶液进行稀释]
■稀释倍率
随后，将此可溶化液以10～数10倍程度的稀释倍率稀释于含有作为添加剂的精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液中，维持此状态，直至蛋白质恢复天然状态的高级结构。进行稀释，以使稀释后的表面活性剂的浓度为0.02～0.5％，优选0.04～0.35％，更优选0.05～0.30％。表面活性剂通过此稀释而直接从蛋白质上脱离，蛋白质形成高级结构。稀释可以通过适宜选择1阶段、多阶段(步骤梯度)或线性梯度而进行。
在前述蛋白质为IL-6等细胞因子和转谷氨酰胺酶等的酶的情况下，优选进行稀释以使稀释后的表面活性剂的浓度为0.02～0.275％，优选0.04～0.125％，更优选0.05～0.10％。
在前述蛋白质为抗体片段其中的scFv的情况下，和上述细胞因子和酶的情况相比较，稀释倍率可以较小。具体而言，进行稀释，以使稀释后的表面活性剂的浓度为0.02～0.5％，优选0.05～0.4％，更优选0.1～0.3％。即使在稀释浓度比所述浓度低的情况下，只要是在本发明中规定的范围内，也可以恢复蛋白质的天然状态的高级结构。
在前述抗体片段中的Fab、Fab′及F(ab’)2的情况下，可以一阶段稀释，也可以两阶段以上的多阶段稀释，但多阶段稀释的重折叠率更高，故而优选。在一阶段稀释的情况下，优选进行稀释，以使稀释后的表面活性剂的浓度为0.02～0.08％，优选0.03～0.07％、更优选0.04～0.06％。在多阶段稀释的情况下，第一阶段中的稀释可以以和上述scFv的情况下同程度的稀释倍率来进行。最后阶段的稀释优选使稀释后的表面活性剂的浓度为0.02～0.08％、优选0.03～0.07％、更优选0.04～0.06％这样地来稀释。可以逐渐地稀释，在此情况下，优选使稀释后的最终浓度为0.02～0.08％、优选0.03～0.07％、更优选0.04～0.06％这样地来稀释。
只要在这样的范围内，就能促进天然状态的高级结构恢复，也能确保蛋白质的稳定性，故而优选。蛋白质是否恢复天然状态的高级结构，可以通过CD光谱和荧光光谱等的分光测定，或观察HPLC等蛋白质的物理化学的特性的方法，或酶活性等高级结构指标来确认。
■添加剂的种类
作为添加剂使用的精氨酸可以为L型，也可以为D型。可以形成盐酸盐等的与无机酸所成的盐，或者也可以形成醋酸盐等的与有机酸所成的盐。作为精氨酸衍生物，可列举乙酰精氨酸、N-丁酰精氨酸等的具有碳原子数1～6的酰基的精氨酸；除去羧基的胍丁胺；导入羟基来代替α氨基的5-胍基-2羟基-戊酸(アルギニン酸)等。作为精氨酸衍生物，优选酰化精氨酸，更优选N-丁酰精氨酸。作为添加剂，最优选精氨酸盐酸盐。
■pH
作为缓冲液，可以使用磷酸钠、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐等。pH只要是契合恢复天然状态的蛋白质的性质的pH即可，大概为在pH6.5～9.0范围内的中性pH。因此，工序(2)中pH在此范围内即可，也可以和工序(1)中的pH不同。pH的调节可以使用例如盐酸和氢氧化钠等进行。
■添加剂浓度
添加剂浓度应根据恢复天然状态的蛋白质的性质进行单独地选择，但应为0.05～1.2M，优选0.06～1.0M，更优选0.08～0.8M。在这样的范围内，可以促进天然状态的高级结构恢复，并且不阻碍随后的精制工序，故而优选。
在蛋白质为IL-6等的细胞因子和转谷氨酰胺酶等的酶的情况下，添加剂浓度优选0.1～1.2M，进一步优选0.2～1.0M，更优选0.4～0.8M。
在前述蛋白质为抗体片段中的scFv的情况下，添加剂浓度优选0.2～1.0M，更优选0.4～0.8M。
在前述片段中的Fab、Fab′及F(ab’)2的情况下，添加剂浓度优选0.05～0.3M，更优选0.08～0.12M。在分二阶段以上稀释的情况下，第一阶段中的稀释可以以与上述scFv的情况相同程度的稀释倍率来进行。最后阶段中的稀释优选使稀释后的添加剂的浓度为0.05～0.3M、优选0.06～0.2M、更优选0.08～0.12M这样地来稀释。稀释可以通过适宜选择1阶段，多阶段(步骤梯度)或线性梯度而进行。
■稀释温度·保持时间
稀释可以在室温下实施，在目的蛋白质恢复至天然状态时的热稳定性并不是十分高的情况下可以于5～10℃下实施。例如，在人白细胞介素(rhIL-6)的情况下，使用添加剂溶液稀释后，可以在室温下维持1分钟的程度。在转谷氨酰胺酶的情况下，可以在室温下维持2小时以上。在5～10℃下维持的情况下必须维持更长的时间。
一般情况下，在高温度下维持则维持时间变短，但在目的蛋白质为抗体相关分子的情况下，在与IL-6和转谷氨酰胺酶等的细胞因子的情况相比还要低的温度下维持长时间较好。这样可以提高重折叠率。尤其优选在5～48℃下维持1小时～5日。
在抗体相关分子为抗体片段中的scFv的情况下，尤其希望在5℃～15℃下，优选7℃到13℃下，更优选8℃～12℃下，维持10～24小时，优选12～20小时，更优选15～18小时。可以抑制期间的抗体相关分子的缔合凝集。
随后，加热此稀释液，进一步维持数小时至数日。优选希望在15℃～48℃，优选20℃～46℃，更优选23℃～45℃下维持1小时～5日，优选1.5小时～3日，更优选2小时～24小时。
在抗体片段为Fab、Fab′及F(ab’)2的情况下，在一阶段稀释的情况下优选于5～15℃下维持10～72小时。更优选于7～13℃下维持12～20小时。在多阶段稀释的情况下，第一阶段中的稀释希望于5℃～15℃，优选7℃到13℃，更优选8℃～12℃下维持10小时～24小时，优选12小时～20小时，更优选15小时～18小时。可以抑制期间的抗体相关分子的缔合凝集。
而后，加热此稀释液，进一步维持数小时至数日。优选在15℃～48℃，优选20℃～46℃，更优选23℃～45℃下维持1小时～5日，优选1.5小时～3日，更优选2小时～24小时。温度调节可以通过适宜选择1阶段、多阶段(步骤梯度)或线性梯度而进行。
可以逐渐地稀释。在此情况下，优选于5～15℃下稀释10～72小时。
在稀释分数阶段进行的情况下，在最后阶段的稀释后例如通过超滤膜浓缩仅抵消稀释倍率的部分，从而将最终阶段的稀释后的蛋白质浓度保持在0.05～1.0mg/ml，优选0.1～0.5mg/ml，更优选0.15～0.3mg/ml，促进了构成Fab的重链和轻链的二硫键形成。
需要说明的是，目前的抗体相关分子的重折叠中，构成分子的各区域的重折叠速度不规律，故在重折叠中易引起缔合凝集，重折叠率低。为解决此问题，津本等提出了使用阶段透析法的重折叠方法(The Journal of Biological Chemistry 278(11)，8979-8987(2003))。此方法通过对变性蛋白质(单链抗体可变区，scFv)溶液中的高浓度的蛋白质变性剂(盐酸胍)进行6阶段的透析操作，从而慢慢地阶段性地除去，可以防止单纯的稀释法等中频繁地出现的缔合凝集而导致的蛋白质的损失，是一种优秀的方法。但是，因为此方法进行了6阶段的透析故重折叠操作时间长，在期间蛋白质受到化学修饰，形成凝集性高的结构形成中间状态的情况下，也有反而促进缔合凝集的可能。植田等对津本等的方法进行了部分改良，使抗原结合部位(Fab)的重折叠变得可能(The Journal of Biochemistry 141(5)，699-707(2007))，但此场合下因为进行了4阶段的透析，而需要130小时的长时间，而重折叠率最高才为24％，不能说是效率高的重折叠方法。
但是，如上所述，依照本发明，通过凝胶过滤高效液相色谱和电泳或测定抗体相关分子的活性，可以根据各抗体相关分子适当地确定抗体相关分子重折叠必须的时间。多数场合下为40小时的程度，和阶段透析法为代表的以往的抗体相关分子重折叠方法相比也有大幅缩短。
[任意工序(A)：使用添加剂溶液进行稀释前的稀释]
根据蛋白质的不同，在上述范围内稀释之前，可以通过添加磷酸缓冲溶液等来进行预稀释。具体而言，在前述工序(1)和工序(2)之间，希望以表面活性剂的浓度为0.8～1.5％，优选1％的程度进行稀释。稀释后，优选于5～40℃，更优选5～30℃，例如室温下优选放置0.5小时以上，更能提高蛋白质的高级结构的回复率。只要以与可溶化使用的时间同等程度以上的时间进行放置，就是足够的。特别优选以表面活性剂的浓度为0.8～1％进行稀释，将得到的稀释液于5～40℃下维持30分钟以上。
尤其是当目的蛋白质为抗体相关分子，在该抗体相关分子为抗体片段中scFv的情况下，可以在5℃～15℃，优选7℃到13℃，更优选8℃～12℃下维持10小时～24小时，优选12小时～20小时，更优选15小时～18小时。在维持期间，抗体相关分子不缔合凝集，接近天然状态。
在抗体片段为Fab、Fab′及F(ab’)2的情况下，使用含有作为添加剂的精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液来稀释，调节月桂酰-Glu浓度为0.05～0.5％，优选0.08～0.4％，更优选0.1～0.3％，精氨酸浓度为0.6～1.2M，优选0.7～1.1M，更优选0.8～1.0M。
此时得到的稀释液的25℃下的pH在pH6.5～9.0的范围内，即使和工序(1)中的pH不同也可。pH调节可以使用例如盐酸和氢氧化钠等来进行。
通过此稀释高级结构得到恢复的蛋白质的浓度，和稀释使用的蛋白质的量和性质、稀释的倍率有关，可达到0.02～1mg/ml。
[任意工序(B)：二硫键的形成]
根据蛋白质的不同，在单一的分子内，多聚体蛋白质的情况下在分子键具有二硫键。使蛋白质发生氧化还原反应促进这些二硫键结合的形成，可以提高重折叠率故而优选。
氧化还原反应促进硫羟·二硫交换反应，可以使用使分子内和分子间形成二硫键而用的氧化还原物质(例如，氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)的混合物，或胱氨酸和半胱氨酸的混合物，或胱胺和半胱胺的混合物、或是氧化型谷胱甘肽或胱氨酸和巯基乙醇的混合物，等)和，与用于促进空气氧化的铜离子共存而进行，也可通过改变蛋白质的氧化还原电位进行。优选使用氧化还原物质。
氧化还原反应只要在前述工序(1)后任何时间进行均可，例如前述工序(2)中将氧化还原物质作为添加剂加入可溶化液中进行也可，前述工序(2)中得到稀释液后在该稀释液中添加氧化还原物质进行也可。
氧化还原物质和铜离子的浓度应根据恢复天然状态的蛋白质不同来调节适当的浓度。
此处25℃的pH可以在pH6.5～9.0的范围内。pH调节可以使用例如盐酸和氢氧化钠等来进行。
液温可以和工序(1)中得到的可溶化液的温度同等程度，也可以和工序(2)中得到的可溶化液的温度同等程度。为促进氧化还原反应，优选5～48℃的程度。
氧化还原反应后，可以在5～48℃下放置1小时～5日(120小时)的程度。
依照本发明，重折叠率至少为30％，多数情况下可达70％。
[任意工序(C)：精制]
恢复了高级结构的蛋白质，可以使用通常的方法，例如超滤、透析、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、疏水作用色谱法、反相色谱法、亲和色谱法等进行精制。
以下使用实施例对本发明进行具体的说明，但本发明并不仅限于此实施例。
实施例
(参考例1)
作为蛋白质，使用用基因重组蛋白大肠杆菌配制的人白细胞介素-6(rhIL-6；专利第3200850号)。该rhIL-6为水不溶性(25℃下100g水中的溶解度：0.001g以下)，其形态为颗粒状。将该不溶性颗粒分成小份分别注入Eppendorf筒(聚丙烯制；Eppendorf会社)中，每1根注入4mg的rhIL-6。该不溶性颗粒中含有的rhIL-6的量为已报道(专利第3200850号)中记载的用反相色谱法得到的预定量。
在此，使月桂酰-L-Glu、月桂酰-L-Asp、月桂酰亚氨二醋酸、癸酰Sar、癸酰L-Ala、癸酸或氯化月桂基三甲基铵的最终浓度为2％，此外，使rhIL-6提取浓度为4mg/ml，适当添加预先配制为5％的表面活性剂和纯水(MiliQ水)，最终配制成1ml，于室温下放置2小时，从该不溶性颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。
为了比较，以下使用表面活性剂进行同样的操作。在使用阴离子型表面活性剂的情况下，使用NaOH调节水溶液的浓度至pH7.0(25℃)。
较常用的表面活性剂：十一酰L-Glu、十三酰L-Glu、肉豆蔻酰L-Glu、月桂酰DL-Glu、月桂酰γ-Glu-Glu、月桂酰α-Glu-Glu、癸酰-L-Asp、癸酰-DL-Asp、肉豆蔻酰Sar、月桂酰L-Ala、肉豆蔻酰L-Ala、月桂酰DL-Ala、月桂酰Gly、月桂酰L-Val、月桂酰L-Leu、月桂酰L-Ile、月桂酰L-The、月桂酰L-Phe、月桂酰L-Tyr、月桂酰L-Met、月桂酰L-Gln、月桂酰L-PCA、月桂酰L-Pro、月桂酰L-GABA、月桂酰L-Cit、月桂酰琥珀酸(以上均为味之素(株式会社)生产)、月桂酰-Sar(Nacalai Tesque生产)、POE(20)失水山梨醇单油酸酯(Tween-80；Nacalai Tesque生产)、POE(9，10)对-叔辛基苯基醚(Triton X-100；Nacalai Tesque生产)、POE(20)失水山梨醇单棕榈酸酯(Tween-20；Bio-Rad生产)、月桂酰-N-Me-牛磺酸(NikkorLMT；日光化工生产)、月桂酰-N-Me-β-Ala(川研良好化工生产)、月桂酰胺丙基甜菜碱(softazoline LPBソフダゾリンLPB；川研良好化工生产)、氯化癸基三甲基铵、氯化肉豆蔻基三甲基铵、氯化硬脂酰基三甲基铵、月桂酸(以上为东京化成生产、氯化鲸蜡基三甲基铵(和光纯药生产)、SLES(Sodium laurylethersulfate(月桂基醚硫酸钠)，Emal 270D/B；花王生产)、月桂基胺基甜菜碱(Amphitol 20 AB；花王生产)、肉豆蔻基胺基甜菜碱(Amphitol 24 AB；花王生产)、月桂基磺基甜菜碱(SB-12；Sigma·Aldrich生产)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸(CHAPS；同仁化学研究所生产)。
在各提取液中添加还原型谷胱甘肽及氧化性谷胱甘肽，使其最终浓度分别为10μM和2μM，于室温下终夜放置形成分子内二硫键。二硫键的形成使用在反相HPLC法(柱：Vydac 214-TP5410(Separations Group)；洗脱液：A/0.1％TFA B/0.1％TFA+80％乙腈；流速：1ml/min；洗脱条件：从30％B到50％B，1.0％/min的线性梯度)中的峰保留时间的变化为指标来确认。在得到的溶液50μl中加入10mM的磷酸钠水溶液950μl(pH 7.0，25℃)来进行20倍的稀释(最终容量1ml；最终表面活性剂浓度0.1％)。
和离子交换HPLC中的rhIL-6标准品(专利第3200850号)显示出相同保留时间的峰则认为是具有天然状态的高级结构的rhIL-6(Biotechnology and Bioengineering 62，301-310(1999))，故使用离子交换HPLC求得上述稀释后的水溶液中含有的形成了天然状态的高级结构的rhIL-6的量(柱：SP-NPR(Tosoh生产)；洗脱液：A/0.01M 乙酸钠、pH5.0 B/0.5M 乙酸钠、pH5.5；流速：1ml/min；洗脱条件：从20％B到70％B，10％/min的线性梯度)
以使用作为表面活性剂的月桂酰L-Glu进行可溶化的情况下的rhIL-6量为100％，相对表示使用月桂酰-L-Asp及月桂酰亚氨二醋酸进行可溶化的情况下的rhIL-6量(图1)。同样地也相对表示使用比较用表面活性剂进行可溶化的情况下的rhIL-6量(图1)。
由图1可知，在使用月桂酰-Asp或月桂酰亚氨二醋酸使rhIL-6可溶化并恢复了天然状态的高级结构的情况下的rhIL-6量并不比在使用月桂酰-Glu使rhIL-6可溶化并恢复了天然状态的高级结构的情况下的rhIL-6量逊色。使用这3种的表面活性剂的情况下得到的恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6量要高于使用比较用表面活性剂的情况下的rhIL-6量。
在使用蛋白质的重折叠中以往使用较多的月桂酰-Sar和氯化鲸蜡基三甲基铵(CTAC)的情况下得到的恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6的量分别为5％和21％，较低。在使用预想富有从含有rhIL-6的不溶性颗粒中提取rhIL-6能力的月桂醚硫酸钠(SLES)和月桂酸等的阴离子表面活性剂及两性表面活性剂的情况下，得到的恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6量低，均不足20％。因为蛋白质变性效果弱，因此在重折叠中使用较多的Tween20、Tween80、TrixtonX-100的非离子型表面活性剂从不溶性颗粒中提取rhIL-6的能力缺乏，基本不能使不溶性颗粒溶解，故恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6量为3～5％，较低。
(参考例2)
研究了即使是在从提高不溶性颗粒中提取、可溶化时的rhIL-6浓度得到了提高的情况下，月桂酰-L-Glu、月桂酰-L-Asp及月桂酰亚氨二醋酸对不溶化rhIL-6的天然状态的高级结构的恢复是否有效。为了比较，使用了参考例1中对月桂酰-L-Glu显示出了80％以上的rhIL-6量的氯化月桂基三甲基铵、同样地具有月桂酰基的月桂酰-Sar、为了确认月桂酰-L-Glu中酰基链长的效果使用的十一酰-Glu、十三酰-Glu及肉豆蔻酰-Glu、为了确认酰链的影响使用癸酸。
使用和参考例1中使用的一样的rhIL-6的不溶性颗粒，将其分为13mg的小份于Eppendorf筒中。在Eppendorf筒中加入各表面活性剂，使得最终浓度为2％，得到10mM磷酸钠的pH7.0(25℃)的溶液1ml，调节该溶液pH为7.0，于室温下放置2小时，从而从该不溶性颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。提取浓度调节为13mg/ml。和参考例1一样地添加还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽使其最终分别为10μM和2μM，在室温下终夜放置形成分子间二硫键。
在此25μl中加入10mM磷酸钠水溶液(pH 7.0(25℃))975μl进行40倍稀释(最终容量1ml；最终表面活性剂浓度0.05％)，和参考例1中记载的一样地，使用离子交换HPLC来求得形成高级结构的rhIL-6量。结果如图2所示。
从图2可知，在使用月桂酰-L-Glu的情况下，恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6的浓度最高，在使用月桂酰L-Asp、月桂酰亚氨二醋酸这些分子内具有酰胺键的单链二亲水型表面活性剂的情况下也显示了高rhIL-6浓度。与使用月桂酰-L-Glu的情况相比较，若月桂酰-L-Glu的酰基链长缩短为C11(十一酰)、增长为C13(十三酰)或C14(肉豆蔻酰)，rhIL-6浓度降低，故酰基链长为C12(月桂酰)是最合适的。在使用仅有酰基链的癸酸的情况下只能收集到很少量的rhIL-6。对G-CSF(粒细胞集落刺激因子；US专利5849883)和生长激素(EP 0263902 A)的重折叠有效的月桂酰-Sar与月桂酰-L-Glu相比明显较差。
(参考例3)
研究了用于从不溶性颗粒中将rhIL-6提取并可溶化的表面活性剂的浓度。
使用和参考例1中所使用的一样的rhIL-6不溶性颗粒，将其分为12.6mg的小份置于Eppendorf筒中。在Eppendorf筒中加入月桂酰-L-Glu使得最终浓度为1.5％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％、3.00％，得到10mM磷酸钠的pH7.0(25℃)的溶液3ml。将该溶液于室温下放置2小时，从该不溶性颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。在rhIL-6完全提取后，调节rhIL-6的提取浓度为4.3mg/ml。
提取后，在上清中加入二硫苏糖醇(DTT)10mM，调节pH为8后，于37℃下加热30分钟使二硫键还原。将此上清提供给反相HPLC(柱：Vydac 214-TP5410(Separations Group)；洗脱液：A/0.1％TFA B/0.1％TFA+80％乙腈；流速：1ml/min；洗脱条件：从30％B到50％B，1.0％/min的线性梯度)，测定从不溶性颗粒中得到的可溶化的rhIL-6量(Biotechnology and Bioengineering 62，301-3 10(1999))。以月桂酰L-Glu的最终浓度为3.00％时的rhIL-6量为100％，在各浓度中rhIL-6相对量如图3所示。
从图3可明确，在月桂酰-L-Glu浓度为1.50％的情况下，虽然得不到在用3％提取及可溶化处理情况下的rhIL-6量，但得到其80％弱的提取量。在月桂酰-L-Glu浓度为1.75％以上的情况下，得到了和在用3％提取及可溶化处理情况下基本相同的提取量。由此结果可知，若为具有和rhIL-6同程度的疏水性的蛋白质，则可以使用1.50％的月桂酰-L-Glu浓度进行提取，在3.00％的月桂酰-L-Glu浓度中可同样地提取。
(参考例4)
在工序(2)中，研究了稀释使用表面活性剂提取的蛋白质以进行重折叠时的表面活性剂的最适浓度。因为能够给予很好地反映rhIL-6高级结构的荧光波谱，故通过追踪各浓度的月桂酰-L-Glu中的rhIL-6的最大荧光强度及其波长，而决定适于重折叠的月桂酰-L-Glu的浓度。
将rhIL-6标准品(专利第3200850号)用10mM的磷酸钠、在pH7.0中配制为0.075mg/ml，于室温下测定激发波长295nm，荧光波长315～420nm的荧光光谱(FP-6500分光荧光光度计、JASCO生产)。结果如图4所示。
月桂酰-L-Glu浓度在0％～0.1％之间，rhIL-6的最大荧光波长和荧光强度均基本不变化。由此可知，在此浓度范围内，月桂酰-L-Glu的结合基本没有，即使有少量结合，也不存在rhIL-6结构从天然状态向别的状态的变化。
月桂酰-L-Glu浓度在0.125％～0.275之间，最大荧光波长渐渐地且连续地移向紫外一侧。由此可知，在此范围内，月桂酰-L-Glu与rhIL-6结合，向具有一定的最大荧光强度和此波长的结构状态变化。
若月桂酰-L-Glu浓度超过0.967％，则最大荧光波长移向红外一侧。由此可知，在此浓度范围内，rhIL-6的高级结构进一步打开，即开始失去rhIL-6高级结构。
由以上结果可知，若进行稀释而使月桂酰-L-Glu浓度低于0.1％，蛋白质的高级结构完全地向天然状态转变，若稀释为0.125％～0.275％，则向和天然状态相近的状态转变。
(参考例5)
在参考例4中判明的月桂酰-L-Glu浓度和rhIL-6高级结构的关系，在以表面活性剂中溶解的rhIL-6状态为开始点，由此开始阶段性地稀释的过程(重折叠过程)中，同样地确认了观察结果。
将rhIL-6标准品(专利第3200850号)溶解于含有2％的月桂酰-L-Glu的10mM磷酸钠(pH7.0(25℃))1ml中，配制为3mg/ml。将此溶液使用10mM磷酸钠(pH7.0(25℃))进行阶段性稀释，制备出月桂酰-L-Glu浓度为1.0％、0.3％、0.1％、0.05％的稀释序列。将各稀释溶液的rhIL-6浓度调节为0.075mg/ml后，测定各稀释溶液的荧光光谱，追踪伴随月桂酰-L-Glu浓度的变化的最大荧光波长的变化。
为了比较，使用月桂酰-Sar来代替月桂酰-L-Glu来进行同样的操作。结果如图5所示。
月桂酰-L-Glu浓度为2～0.3％之间，则最大荧光波长在340nm附近，rhIL-6高级结构依然是和天然状态不同的状态，但当在0.1％、0.05％时到达350nm处，使用此浓度的月桂酰-L-Glu，则rhIL-6实际上可以恢复天然状态的高级结构，即重折叠。使用为了比较而进行的月桂酰-Sar，rhIL-6的最大荧光波长在研究的范围内完全没有变化，不能认为发生了重折叠。
(实施例1)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质的可溶化]
将和参考例1中使用的相同的rhIL-6水不溶性颗粒加入5ml的2.5％月桂酰-L-Glu水溶液(含有10mM磷酸钠，pH7(25℃))中，于37℃下放置1小时而从该不溶性颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。得到的可溶化液的rhIL-6浓度为6.5mg/ml。
[工序(B)：二硫键的形成]
在得到的可溶化液中加入10μM还原型谷胱甘肽和2μM氧化型谷胱甘肽后，于室温下放置18小时，形成分子内二硫键。
[工序(2)：使用添加剂溶液进行稀释]
另一方面，在10mM磷酸钠水溶液中加入作为添加剂的精氨酸盐酸盐，配制成精氨酸盐酸盐浓度为0.4M、0.8M及1.2M的稀释液(pH7.0(25℃))。作为阴性对照，准备除了不加入添加剂以外，一样地进行配制的稀释液。
将放置18小时后的可溶化液0.1ml用这些稀释液进行50倍的稀释，将月桂酰-L-Glu的浓度调节为0.05％。
和参考例1一样地，使用离子交换HPLC评价添加剂浓度和rhIL-6的重折叠率之间的关系。结果如表1所示。
(比较例1～2)
除了使用蔗糖及甘油来代替精氨酸盐酸盐作为添加剂以外，和实施例一样地使用离子交换HPLC评价添加剂浓度和rhIL-6的重折叠率之间的关系。结果如表1所示。
(比较例3)
使用和专利3200850号实施例1中记载的方法相同的方法，进行rhIL-6的重折叠。具体而言，将和实施例1中使用的相同的rhIL-6的水不溶性颗粒加入5ml的6M盐酸胍(pH7(25℃))中，于37℃下放置1小时，从该不溶性颗粒中提取rhIL-6并使rhIL-6可溶化。得到的可溶化液的rhIL-6浓度为0.88mg/ml。
随后，对于得到的可溶化液，使用葡聚糖凝胶G-25柱进行缓冲液置换为10mM乙酸钠、pH5.0。和实施例1一样地，使用离子交换HPLC评价rhIL-6的重折叠率。结果如表1所示。
[表1]
Figure BPA00001294463400231
表1的值为以比较例3所示的以往技术得到的rhIL-6的重折叠率为基准的相对值。
在阴性对照的情况(使用不添加添加剂的稀释液的情况)下，重折叠率为以往技术的125％，故明确了优越性。
若在稀释液中加入0.4M的精氨酸盐酸盐，则重折叠率达到166％，如精氨酸盐酸盐浓度高至0.8M、1.2M，则重折叠率飞跃地高至174％、176％。
另一方面，即使添加据称可以促进蛋白质的重折叠的蔗糖或甘油，其改善效果和精氨酸盐酸盐相比较也较轻微(比较例1～2)。
如上可知，使用月桂酰-L-Glu使蛋白质可溶化，将此可溶化液稀释而进行重折叠时，在稀释液中加入精氨酸盐酸盐则可以提高蛋白质的重折叠率。
(实施例2)
[工序(1)：使用表面活性剂使蛋白质可溶化]
除将月桂酰-L-Glu水溶液的月桂酰-L-Glu浓度变更为2.5％，pH变更为8.5以外，和实施例1一样地使rhIL-6可溶化。得到的可溶化液的rhIL-6浓度为6.5mg/ml。
[工序(B)：二硫键的形成]
随后，和实施例1一样地，在10μM还原型谷胱甘肽及2μM氧化型谷胱甘肽存在下于室温下放置18小时。
[工序(2)：使用添加剂溶液进行稀释]
另一方面，在10mM磷酸钠水溶液中加入作为添加剂的精氨酸盐酸盐或N-α-丁酰精氨酸(N-α-Butyroyl-L-Arginine)，配制成精氨酸盐酸盐浓度为0.4M或0.8M的稀释液(pH7.0(25℃))。需要说明的是，N-丁酰精氨酸使用以下方法制备：将精氨酸用水/2-丙醇溶解后，调节反应系于pH11、10～15℃以下。使用氢氧化钠水溶液保持pH，保持温度，滴入丁酰氯使其反应。反应结束后，使用阳离子交换树脂精制，得到白色固体。使用反相HPLC、1H-NMR确认结构、纯度。作为阴性对照，准备除了不加入添加剂以外，一样地进行配制的稀释液。
将在室温下放置18小时后的可溶化液0.1ml用这些稀释液稀释40倍，调节月桂酰-L-Glu浓度为0.05％。
和实施例1一样地，用离子交换HPLC评价添加剂浓度和rhIL-6的重折叠率之间的关系。
[表2]
Figure BPA00001294463400241
表2的值为以比较例3所示的以往技术得到的rhIL-6的重折叠率为基准的相对的值。
在稀释液中无任何添加剂的情况下，重折叠率为115％，如加入作为添加剂的精氨酸盐酸盐0.4M或0.8M，则重折叠率飞跃地高至157％和188％。
另一方面，添加作为添加剂的N-丁酰精氨酸0.4M，则重折叠率达到179％，与在稀释液中无任何添加剂的情况下的115％的情况及加入精氨酸盐酸盐同浓度(0.4M)的情况相比较，重折叠率有了很大改善。
因为N-丁酰精氨酸在中性pH下显示出了两性离子性，失去了总电荷，故即使添加0.4M以上，也能够不稀释含有它的稀释液，而直接加载于离子交换色谱，从而精制回收经重折叠的蛋白质，因此认为其能够比精氨酸盐酸盐更有效地使用。
(实施例3)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
将使用基因重组大肠杆菌制备的转谷氨酰胺酶(protein-glutamine、γ-glutamyltransferase，EC 2.3.2.13；US专利  No.6833258)的水不溶性颗粒加入5ml的2.0％的月桂酰-L-Glu水溶液(10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20mM DTT，pH8.5(25℃))中，于37℃下放置1小时，从而提取并使转谷氨酰胺酶可溶化。得到的可溶化液的转谷氨酰胺酶浓度为6.98mg/ml。
[工序(A)：使用添加剂溶液进行稀释前的稀释]
将得到的可溶化液0.1ml用10mM的磷酸钠(pH 7.0(25℃))稀释40倍，调节月桂酰-L-Glu浓度为0.05％，在室温下放置2小时。
[工序(2)使用添加剂溶液进行稀释]
在稀释液中加入作为添加剂的精氨酸盐酸盐(表3中“不稀释至1％”)。作为阴性对照，准备不加入添加剂的稀释液。在可溶化液0.1ml中加入10mM磷酸钠(pH7.0(25℃))进行稀释，调节月桂酰-L-Glu浓度为0.05％。
另一方面，使用0.6M磷酸钠(pH7.0(25℃))2倍稀释得到的可溶化液0.1ml，调节月桂酰-L-Glu浓度为1.0％，于室温下维持30分钟。随后，用10mM磷酸钠(pH7.0(25℃))稀释，调节月桂酰-L-Glu浓度为0.05％，于室温下放置2小时。在稀释液中加上作为添加剂的精氨酸盐酸盐(表3中“稀释至1％”)。作为阴性对照，准备不添加添加剂的稀释液。将可溶化液0.1ml用0.6M磷酸钠(pH7.0(25℃))2倍稀释后，调节月桂酰-L-Glu浓度为1.0％，于室温下维持30分钟。而后，用10mM磷酸钠(pH7.0(25℃))稀释，调节月桂酰-L-Glu浓度为0.05％，于室温下放置2小时(在稀释液中不添加添加剂)。
通过凝胶过滤HPLC来确认精氨酸盐酸盐和转谷氨酰胺酶的重折叠率之间的关系(柱：Superdex 75HR 10/30、GE Healthcare Bioscience生产；展开液：0.2M磷酸钠，pH7.0；流速：1ml/min)。结果如表3所示。
[表3]
Figure BPA00001294463400261
在稀释液中不加入精氨酸盐酸盐的情况下，在从稀释至1％稀释到0.05％的情况下，在不稀释至1％而稀释到0.05％的情况下，使用凝胶过滤HPLC确认的转谷氨酰胺酶的浓度未达到50μg/ml。但是，如将此稀释液于室温下继续保持，转谷氨酰胺酶会渐渐消失，故不能恢复转谷氨酰胺酶的天然状态的高级结构。
另一方面，如在稀释时加入精氨酸盐酸盐0.4、0.8、1.2M，则转谷氨酰胺酶的浓度随着精氨酸盐酸盐添加浓度的升高而上升，即使继续这样在室温下保持也不会消失。
此外，即使在添加同样的精氨酸盐酸盐浓度的情况下，将2.0％月桂酰-L-Glu提取液2倍稀释至1％后再稀释至0.05％的情况，和不稀释至1％而直接稀释至0.05％的情况相比，显示出转谷氨酰胺酶有升高的倾向，特别地，若与添加1.2M精氨酸盐酸盐情况下的转谷氨酰胺酶浓度相比较，则从127μg/ml明显地升至151μg/ml。
如上可知，如在稀释时加入精氨酸盐酸盐，可溶化后暂时稀释月桂酰-L-Glu浓度至1％，随后进一步稀释，则可以有效地进行转谷氨酰胺酶的重折叠。
(实施例4)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化、工序(A)：使用添加剂溶液进行稀释前的稀释]
和实施例3一样地将得到的转谷氨酰胺酶的可溶化液(转谷氨酰胺酶浓度6.67mg/ml)用0.6M磷酸钠(pH7.0(25℃))2倍稀释，于室温下保持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂溶液进行稀释]
随后，使用10mM磷酸钠(pH7.0(25℃))20倍稀释，调节月桂酰-L-Glu浓度至0.05％。调节到了0.05％时，为使精氨酸盐酸盐为0.8M，在第2次稀释(20倍稀释)用的磷酸钠中预先加入精氨酸盐酸盐。
将得到的稀释液于室温下放置2小时。放置后，使用反相HPLC法(柱：Vydac 214-TP5410(Separations Group)；洗脱液：A/0.1％ TFAB/0.1％ TFA+80％乙腈；流速：1ml/min；洗脱条件：从30％B到50％B，以1.0％/分的直线浓度比例法)来定量稀释液中的转谷氨酰胺酶浓度。如以可溶化液中的转谷氨酰胺酶浓度为基准，精氨酸盐酸盐添加后的重折叠率为77％。
(比较例4)
使用和US.专利No.6833258的实施例9中记载的方法相当的方法，进行转谷氨酰胺酶的重折叠。具体而言，将和实施例3中使用的相同的转谷氨酰胺酶的水不溶性颗粒溶解于8M的尿素中，于5℃下将pH调节为pH4.0后，50倍稀释调节尿素浓度为0.16M，2小时后通过调节pH为6.0而形成结构。和实施例4一样地使用反相HPLC定量转谷氨酰胺酶浓度。若以使用尿素溶解后的溶液中的转谷氨酰胺酶浓度为基准，则调节pH为6.0后的重折叠率为29％。
实施例4的重折叠率为77％，和使用以往的重折叠技术的比较例4的29％相比有了飞跃性地提升。
使用显色底物法(合成基質法)确认了通过各种重折叠法而制备的转谷氨酰胺酶的酶活性，实施例4中配制的转谷氨酰胺酶的酶活性为37.5U/mg，比较例4中配制的转谷氨酰胺酶的酶活性为36.8U/mg，判断双方均和天然的转谷氨酰胺酶具有相同的比活性，显示具有超过30U/mg的酶活性。
(实施例5)
[蛋白质的制备]
构建以大肠杆菌BL21株(DE3)为生产宿主(生産宿主)的单链抗体可变区(HyHEL-10 scFv)的生产系(生産系)(Gene 129(1)，129-134(1993))。使用坂口烧瓶将此生产菌(生産菌)在LB培养基中于28℃下震荡培养12小时，使HyHEL-10 scFv在菌体内以不溶性颗粒的状态蓄积。将菌体收集并超声破碎后，将混悬液在5000g、20分钟的条件下进行离心分离操作，回收HEL-10 scFv颗粒。将回收后的HyHEL-10 scFv颗粒用1％Triton X-100水溶液2次洗净后，用精制水(MiliQ水)洗净，除去Triton X-100。将得到的颗粒约30mg混悬于丙酮1.5ml中，溶解除去脂质成分。在5000g、20分钟的条件下进行离心分离操作，回收颗粒后，使用真空泵减压干燥一晚，得到不溶性颗粒粒料。
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
称量上述粒料15mg，添加0.5ml的5％月桂酰-L-Glu(含有20mM磷酸钠，pH 8.5)。搅拌均匀后，立即适当地添加pH8.5的20mM磷酸钠，使用Eppendorf管的刻度调节为1.0ml。在37℃下进行30分钟的可溶化。
为确定得到的可溶化液中的HyHEL-10 scFv的浓度，于22℃、11000g、10分钟的条件下进行离心分离操作，在0.2ml得到的上清(月桂酰-L-Glu2.5％，pH8.5)中添加10mM的DTT溶液(pH7)2.4μl而调节为1.2mM DTT后，于37℃下加热60分钟。将此溶液提供给还原型的SDS-PAGE(Biorad生产预制胶J、10～20％T、及CBB染色)，与测定了蛋白质浓度的抗血管性血友病因子单克隆抗体(WO96/17078)比较对照而定量，确定经可溶化的HyHEL-10 scFv的浓度为6mg/ml。
[工序(A)：使用添加剂溶液进行稀释前的稀释]
由工序(1)得到的可溶化液0.2ml中加入0.3ml的pH8.0的20mM磷酸钠使总液量为0.5ml(月桂酰-L-Glu浓度1.0％)。搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂溶液进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
除了工序(A)得到的月桂酰-L-Glu浓度1.0％溶液之外，准备含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的各种浓度的月桂酰-L-Glu溶液0.38mL。
之后，分别添加工序(A)中得到的月桂酰-L-Glu浓度为1.0％的溶液0.02mL，最终达到0.4mL(20倍稀释)。20倍稀释时的月桂酰-L-Glu浓度为0.05％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％，精氨酸盐酸盐浓度为0.8M，氧化型和还原型谷胱甘肽的浓度均为1mM，scFv浓度为0.12mg/ml。而后在5℃下维持17小时。接着在23℃下维持43小时。
[重折叠率的测定]
之后，使用凝胶过滤HPLC(柱：Superdex 75GL，10×300mm，GE Healthcare Bioscience生产；展开液：0.1M磷酸钠，0.2M精氨酸盐酸盐，pH6.8；流速：0.8ml/分；scFv在280nm的吸光系数，2.02cm2/mg))求出HyHEL-10 scFv的重折叠率。在图6中，显示了20倍稀释时的月桂酰-L-Glu浓度和重折叠率之间的关系。结果显示，重折叠率显著地依赖于月桂酰-L-Glu浓度，在0.2～0.5％内为基本固定的值。
用工序(3)中得到的月桂酰-L-Glu的20倍稀释溶液(月桂酰-L-Glu浓度：0.125％，精氨酸盐酸盐浓度：0.8M，scFv浓度：0.12mg/ml)，研究氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的比例对重折叠率的影响。将20倍稀释溶液于5℃下维持17小时后，再于23℃下维持43小时，并提供给非还原型的SDS-PAGE(Biorad生产预制胶J、10～20％T、及CBB染色)，以氧化型scFv条带强度为指标研究HyHEL-10的重折叠进行程度。结果如图7所示。
在还原型谷胱甘肽添加量对氧化型谷胱甘肽占优的情况下(5mM/1mM～2mM/1mM，泳道编号4～6)，在SDS-PAGE上表现为迁移率大的氧化性scFv(经重折叠的scFv，在图中的泳道8上用箭头表示)并不十分浓。另一方面，若提高氧化型谷胱甘肽的添加量(还原型、氧化型分别为1mM/1mM～1mM/3mM，泳道编号8～11)，则迁移率大的scFv条带不浓，但若氧化型谷胱甘肽添加量过高，则scFv条带的聚焦模糊(1mM/2mM(泳道编号10)、1mM/3mM(泳道编号11))，故scFv的二硫键发生了某种变化。
因此可以知道，在HyHEL-10 scFv的情况下，分别加入1mM还原型和氧化型谷胱甘肽(泳道编号8)是合适的。
(实施例6)
[蛋白质的制备]
构建以大肠杆菌BL21株(DE3)为生产宿主的单链抗体可变区(抗荧光素scFv)的生产系(Journal of Molecular Biology 343，685-701(2004))。使用坂口烧瓶将此生产菌在LB培养基中于28℃下震荡培养12小时，使抗荧光素scFv在菌体内以不溶性颗粒状蓄积。将菌体收集并超声破碎后，将混悬液在5000g、20分钟的条件下进行离心分离操作，回收抗荧光素scFv颗粒。将回收后的抗荧光素scFv颗粒用1％ Triton X-100水溶液2次洗净后，用精制水(MiliQ水)洗净，除去Triton X-100。将得到的颗粒约30mg混悬于丙酮1.5ml中，溶解除去脂质成分。在5000g、20分钟的条件下进行离心分离操作，回收颗粒后，使用真空泵减压干燥一晚，得到不溶性颗粒粒料。
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
称量上述粒料15mg，添加0.5ml的5％月桂酰-L-Glu(含有20mM磷酸钠，pH 8.5)。搅拌均匀后，立即适当地添加pH8.5的20mM磷酸钠，使用Eppendorf管的刻度调节为1.0ml。在37℃下进行30分钟的可溶化。
为确定可溶化处理的抗荧光素scFv的浓度，将得到的可溶化液于22℃、11000g、10分钟的条件下进行离心分离操作。在得到的上清的0.2ml中添加100mM的DTT溶液(pH7)1.6μl而调节为0.8mMDTT后，于37℃下加热60分钟。将此溶液提供给还原型的SDS-PAGE(Biorad生产预制胶J、10～20％T、及CBB染色)，和实施例5一样地定量，确定经可溶化的抗荧光素scFv的浓度为8mg/ml。
[工序(A)：使用添加剂溶液进行稀释前的稀释]
在此可溶化液0.2ml中加入0.3ml的pH8.0的20mM的磷酸钠而调节为0.5ml(月桂酰-L-Glu浓度1.0％)，搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂溶液进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
除了工序(A)得到的月桂酰-L-Glu浓度1.0％溶液之外，准备含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的月桂酰-L-Glu溶液0.38mL。
之后，向其中分别添加工序(A)中得到的月桂酰-L-Glu浓度为1.0％的溶液0.02mL，最终达到0.4mL(20倍稀释)。20倍稀释时，形成相对于精氨酸盐酸盐浓度为0.4M或0.8M，月桂酰-L-Glu浓度为0.05％、0.2％或0.4％的共9种溶液，氧化型和还原型谷胱甘肽的浓度均为1mM，scFv浓度为0.16mg/ml。而后在10℃下维持17小时。接着在23℃下维持12小时。
[重折叠率的测定]
之后，和实施例5一样地使用凝胶过滤HPLC(但scFv在280nm的吸光系数使用的是1.30cm2/mg))求出抗荧光素scFv的重折叠率。在图8中，显示了20倍稀释时的月桂酰-L-Glu浓度、精氨酸盐酸盐浓度和重折叠率之间的关系。从图8可知，抗荧光素scFv重折叠率显著依赖精氨酸盐酸及月桂酰-L-Glu的两者。尤其是在设定精氨酸盐酸盐为0.8M，月桂酰-L-Glu为0.2％或0.4％时得到了最高的重折叠率。
(实施例7)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
和实施例6一样地得到抗荧光素scFv不溶性颗粒的可溶化液8mg/ml(月桂酰-L-Glu浓度2.5％)。在该可溶化液0.08ml中加入100mM的DTT溶液(pH 7)0.64μl而调节为0.8mM的DTT后，于37℃下加热60分钟。
[工序(A)：使用添加剂进行稀释前的稀释]
在此可溶化液0.08ml中加入0.12ml的pH8.0的20mM的磷酸钠而调节为0.2ml(月桂酰-L-Glu浓度1.0％)，搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
除了工序(A)得到的月桂酰-L-Glu浓度1.0％溶液之外，准备含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的各种浓度的月桂酰-L-Glu溶液0.18mL。该月桂酰-L-Glu溶液的月桂酰-L-Glu浓度为0.150％、0.225％、0.300％或0.375％。
之后，向其中分别加入工序(A)中得到的月桂酰-L-Glu浓度为1.0％的溶液0.02mL，最终达到0.4mL(10倍稀释)。10倍稀释时的精氨酸盐酸盐浓度为0.8M，氧化型和还原型谷胱甘肽的浓度分别为1mM、3mM，scFv浓度为0.32mg/ml。而后在10℃下维持17小时。
[重折叠率的测定]
17小时过后，和实施例6一样地使用凝胶过滤HPLC求出抗荧光素scFv的重折叠率。在图9中，显示了10倍稀释时的月桂酰-L-Glu浓度和重折叠率之间的关系。
和月桂酰-L-Glu浓度为0.15％时相比，在0.225～0.375％下，重折叠率的升高取决于月桂酰-L-Glu浓度，但在0.225～0.375％之间的变化并不显著。考虑到重折叠结束后，除去月桂酰-L-Glu的操作，优选0.3％程度的添加量。
(实施例8)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
和实施例6一样地得到抗荧光素scFv不溶性颗粒的可溶化液6mg/ml(月桂酰-L-Glu浓度2.5％)。在该可溶化液0.2ml中加入100mM的DTT溶液(pH 7)1.6μl而调节为0.8mM的DTT后，于37℃下加热60分钟。
[工序(A)：使用添加剂进行稀释前的稀释]
在此可溶化液0.2ml中加入0.3ml的pH8.0的20mM的磷酸钠而调节为0.5ml(月桂酰-L-Glu浓度1.0％)，搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
在工序(A)得到的月桂酰-L-Glu浓度1.0％溶液0.5mL中加入含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的月桂酰-L-Glu溶液4.5mL(10倍稀释)。10倍稀释时的月桂酰-L-Glu浓度为0.1％，精氨酸盐酸盐浓度为0.8M，氧化型和还原型谷胱甘肽的浓度均为1mM，scFv浓度为0.24mg/ml。而后在8.5℃下维持17小时。随后在45℃下加热4小时。
[重折叠率的测定]
而后，和实施例6一样地使用凝胶过滤HPLC求出经时的抗荧光素scFv的重折叠率。结果如图10所示。通过在45℃下加热，则重折叠率至少为10％，通过加热4小时则超过20％。
(实施例9)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
和实施例6一样地得到抗荧光素scFv不溶性颗粒的可溶化液6mg/ml(月桂酰-L-Glu浓度2.5％)。在该可溶化液0.05ml中加入100mM的DTT溶液(pH 7)0.4μl而调节为0.8mM的DTT后，于37℃下加热60分钟。
[工序(A)：使用添加剂进行稀释前的稀释]
在此可溶化液0.05ml中加入0.075ml的pH8.0的20mM的磷酸钠而调节为0.125ml(月桂酰-L-Glu浓度1.0％)，搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
在工序(A)得到的月桂酰-L-Glu浓度1.0％溶液0.12mL中加入含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的月桂酰-L-Glu溶液1.08mL(10倍稀释)，使其总量为1.2mL。10倍稀释时的月桂酰-L-Glu浓度为0.1％，精氨酸盐酸盐浓度为0.8M，氧化型和还原型谷胱甘肽的浓度均为1mM，scFv浓度为0.24mg/ml。将其分为各0.4mL的3份，分别于5℃、10℃、15℃下维持18.5小时。其各自的重折叠率如图11所示。
进一步分别将上述各份分为各0.2mL的2份，一份于45℃下加热4小时，剩下的一份于23℃下维持24小时后于45℃下加热4小时。其各自的重折叠率如图12所示。
在5℃、10℃或5℃下维持18.5小时的阶段中，随着温度升高重折叠率也升高，但均为稍稍超出10％的程度。若将它们于45℃下加热4小时，重折叠率的升高取决于加热前的维持温度。在15℃下维持的样品在45℃加热后显示出了最高的重折叠率，但和在10℃下维持的样品之间无大的差别(图11)。
另一方面，在5℃、10℃或15℃下维持18.5小时后，进一步于23℃下维持24小时，随后于45℃下加热4小时，则重折叠率比在5℃、10℃或15℃下维持18.5小时后直接于45℃下加热时显著升高。此时，若最初的维持于10℃下进行，则与于15℃下维持的情况相比重折叠率升高，最终显示出45％的重折叠率(图12)。
由以上可知，通过于10℃下维持18.5小时、于23℃下维持24小时后于45℃下加热4小时，scFv的重折叠率最高。
(实施例10)
[蛋白质的制备]
将消化酶(番木瓜蛋白酶)反应用缓冲液(20mM磷酸钠，10mMEDTA)中溶解的抗血管性血友病因子单克隆抗体(WO96/17078)约55mg(18.2mg/ml，3ml)用添加了20mM Cys的相同缓冲液2倍稀释而调节Cys浓度为10mM。并在其中加入实施了预活性化处理的固定化番木瓜蛋白酶凝胶(Pierce生产)的混悬液2ml。于37℃下震荡14小时，离心分离(2000g，5分钟)而除去固定化番木瓜蛋白酶。将此加载于用PBS平衡化处理过的HiTrap rProtein A FF(GE Healthcare Bioscience生产)而回收通过流分，用超滤膜(Amicon Ultra-15，截留分子量30kDa，Millipore生产)浓缩，得到约30mg(11.5mg/ml)的Fab(抗原结合部位)。
[工序(1)：使用表面活性剂使蛋白质可溶化]
在得到的Fab 0.5ml中加入等量的5％月桂酰-L-Glu(含有20mM磷酸钠，pH8.5)使总量为1ml(2.5％月桂酰-L-Glu溶液)。将其于37℃下加热30分钟，成为可溶化液。在此可溶化液0.12ml中加入100mM的DTT溶液(pH 7)1.46μl而调节DTT为1.2mM后，于37℃下加热60分钟(还原变性Fab，5.75mg/ml)。
[工序(A)：使用添加剂进行稀释前的稀释]
在得到的还原变性Fab 0.12ml中加入0.18ml的pH8.0的20mM的磷酸钠而调节为0.3ml(月桂酰-L-Glu浓度1.0％)，搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
除了工序(A)得到的月桂酰-L-Glu浓度1.0％溶液之外，准备含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的月桂酰-L-Glu溶液0.18mL。
之后，向其中分别加入工序(A)中得到的月桂酰-L-Glu浓度为1.0％的溶液0.02mL，最终达到0.2mL(10倍稀释)。10倍稀释时，形成相对于精氨酸盐酸盐浓度为0、0.2M、0.4M或0.8M，月桂酰-L-Glu浓度为0.1％、0.2％或0.3％的共12种，氧化型和还原型谷胱甘肽的浓度分别为1mM及5mM，Fab浓度为0.23mg/ml。而后在10℃下维持17小时。随后在23℃下维持24小时。
而后，和实施例5一样地观察非还原SDS-PAGE中Fab条带。结果如图13所示。在完全不添加精氨酸盐酸盐的情况(泳道编号2)下，形成了高分子量的缔合凝集体。另一方面，添加精氨酸盐酸盐为0.4M以上，或月桂酰-L-Glu为0.2％以上时，能显著地抑制缔合凝集体的形成(泳道编号8～13)，故可知通过使两成分适度共存能够抑制Fab的缔合凝集。但是，作为目的的Fab条带在任何条件下均未明显观察到。
再次10倍稀释这些共12种的样品。调节稀释后的溶液中的月桂酰-L-Glu浓度为0.05％，精氨酸盐酸盐浓度为0.08M，氧化型及还原型谷胱甘肽浓度分别为1mM和5mM。而后，于5℃下维持3小时。随后，使用超滤膜(Amicon Ultra-15，截留分子量10kDa，Millipore生产)10倍浓缩，于8.5℃下维持72小时。即，10倍稀释和10倍浓缩相抵消，这之间的Fab浓度和最初稀释时一样，均维持在0.23mg/ml。使用非还原型SDS-PAGE观察重折叠的Fab条带。
如图14所示，与全部的样品中的最终组成相同无关，Fab条带对应于最初稀释时的组成而出现非常明显的变化。若最初稀释时不添加精氨酸盐酸盐，则第2次稀释后Fab基本不被重折叠(泳道编号2～4)。另一方面，在第1次稀释时加入精氨酸盐酸盐0.4M(泳道编号8～10)或0.8M(泳道编号11～13)的情况下，第2次稀释后观察到了最强的Fab条带，但第1次稀释时的月桂酰-L-Glu浓度为0.1％时Fab条带良好(泳道编号8、11)，若升高至0.2％(泳道编号9、12)、0.3％(泳道编号10、13)则Fab条带变淡。
由如上可知，通过最初稀释调节并维持精氨酸盐酸盐为0.8M、月桂酰-L-Glu浓度为0.1％，通过随后的稀释调节并维持精氨酸盐酸盐为0.08M、月桂酰-L-Glu浓度为0.05％，Fab的重折叠能更有效地进行。
(实施例11)
[工序(1)：使用表面活性剂使蛋白质可溶化]
和实施例10一样地得到Fab的可溶化液(2.5％月桂酰-L-Glu溶液)0.4ml。在此可溶化液中加入100mM的DTT溶液(pH 7)4.85μl而调节DTT为1.2mM后，于37℃下加热60分钟(还原变性Fab，5.75mg/ml)。
[工序(A)：使用添加剂进行稀释前的稀释]
在得到的还原变性Fab 0.4ml中加入0.6ml的pH8.0的20mM磷酸钠而调节为1.0ml(月桂酰-L-Glu，浓度1.0％)，搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
除了工序(A)得到的月桂酰-L-Glu浓度1.0％溶液之外，准备含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的月桂酰-L-Glu溶液0.135mL。该月桂酰-L-Glu溶液的月桂酰-L-glu浓度为0.1％，精氨酸盐酸盐浓度为0.8M，Fab浓度为0.23mg/ml，相对于氧化型谷胱甘肽浓度分别为1mM、2mM或5mM，还原型谷胱甘肽的浓度分别为0.5mM、1mM、2mM或5mM，制备共6种。
之后，向其中分别加入工序(A)中得到的月桂酰-L-Glu浓度为1.0％的溶液0.15mL，最终达到1.5mL。
而后，于10℃下维持17小时，之后于23℃下维持6小时。而后，使用含有浓度和各稀释液的氧化型及还原型谷胱甘肽相同浓度的谷胱甘肽且适当添加了月桂酰-L-Glu的缓冲液进行10倍稀释，制备月桂酰-L-Glu为0.05％，精氨酸盐酸盐浓度为0.8M，相对于氧化型谷胱甘肽浓度为1mM、2mM或5mM，还原型谷胱甘肽浓度为0.5mM、1mM、2mM、或5mM，共6种。
而后在8.5℃下维持15小时。使用超滤膜(Amicon Ultra-15，截留分子量10kDa，Millipore生产)10倍浓缩并在8.5℃下维持3小时，和实施例5一样地观察非还原SDS-PAGE中重折叠的Fab条带。
如图15所示，在还原条件下不能形成Fab条带，提高氧化型谷胱甘肽的浓度可使Fab重折叠。和scFv不同的是，Fab重折叠中需要氧化条件。如上可知，调节氧化还原条件，可以从最初的稀释开始在41小时左右重折叠Fab。
(实施例12)
[蛋白质的制备]
构建以大肠杆菌BL21株(DE3)为生产宿主的单链抗体可变区(抗荧光素scFv；Journal of Molecular Biology 343，685-701(2004))的FC融合蛋白质(抗荧光素scFv Fc融合体)的生产系。使用坂口烧瓶将此生产菌在LB培养基中于28℃下震荡培养12小时，使抗荧光素scFvFc融合体在菌体内以不溶性颗粒状蓄积。将菌体收集并超声破碎后，将混悬液在5000g、20分钟的条件下进行离心分离操作，回收抗荧光素scFv Fc融合体颗粒。将回收后的不溶性颗粒用1％ TritonX-100水溶液2次洗净后，用MiliQ水洗净，除去Triton X-100。将得到的颗粒约30mg混悬于丙酮1.5ml中，溶解除去脂质成分。在5000g、20分钟的条件下进行离心分离而回收颗粒后，使用真空泵减压干燥一晚，得到不溶性颗粒粒料。
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
称量上面得到的粒料15mg，添加0.5ml的5％月桂酰-L-Glu(含有20mM磷酸钠，pH 8.5)。搅拌均匀后，立即适当地添加pH8.5的20mM磷酸钠，使用Eppendorf管的刻度调节为1.0ml。在37℃下进行30分钟的可溶化，得到可溶化液
将此可溶化液于22℃下进行11000g、10分钟的离心分离操作。在得到的上清的0.27ml中添加100mM的DTT溶液(pH7)2.7μl而调节为1.0mM DTT后，于37℃下加热60分钟。将此溶液提供给还原型的SDS-PAGE(Biorad生产预制胶J、10～20％T、及CBB染色)，和实施例5一样地定量，确定经可溶化的抗荧光素scFv Fc融合体的浓度为3mg/ml。但是，在此生产系中在培养时抗荧光素scFv Fc融合体发生分解，故不溶性颗粒中的抗荧光素scFv Fc融合体含量在30％以下。[工序(A)：使用添加剂溶液进行稀释前的稀释]
在得到的还原变性Fab 0.27ml中加入0.405ml的pH8.0的20mM的磷酸钠而调节为0.675ml(月桂酰-L-Glu浓度1.0％)，搅拌后，在5℃下维持30分钟。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
在将工序(A)得到的液体0.6ml中加入含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的缓冲液5.4ml使总量为6.0mL(10倍稀释)。分别调节此溶液的月桂酰-L-Glu浓度为0.1％，精氨酸盐酸盐浓度为0.8M，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的浓度分别为1mM和5mM，抗荧光素scFv Fc融合体浓度为0.12mg/ml。
而后，在10℃下维持17小时，将其分为各0.3ml的2份，一份于8.5℃下维持120小时，另一份于23℃下维持120小时。
在各温度下维持为从开始至第48小时及第120小时，和实施例5一样地，在非还原型SDS-PAGE中观察到了重折叠的抗荧光素scFv Fc融合体条带。
如图16所示，在第48小时观察到了抗荧光素scFv Fc融合体条带(箭头所示位置)，在第120小时此条带强度更强。于10℃下维持17小时后，与于8.5℃下维持相比于23℃下维持的情况和在48小时维持的情况及在120小时维持的情况同样地条带强度变强。可知稀释后于10℃下维持17小时后，若升高至23℃则可促进重折叠的进行。
(实施例13)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
和实施例5一样地得到HyHEL-10 scFv的可溶化液0.3ml(月桂酰-L-Glu溶液2.5％，scFv浓度3.0mg/ml)。
[工序(A)：使用添加剂进行稀释前的稀释]
在得到的可溶化液中加入0.45ml的pH8.0的20mM磷酸钠，搅拌后，在5℃下维持30分钟(月桂酰-L-Glu，1％)。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
在此0.65ml中加入5.85ml的添加了各添加剂的缓冲液进行10倍稀释，分别调节月桂酰-L-Glu浓度为0.3％，精氨酸盐酸盐浓度0.8M，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的浓度均为1mM，HyHEL-10 scFv浓度为0.12mg/ml。于10℃下维持17小时后于35℃下加热2小时。
而后，加载于经50mM磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐在pH9 8.0下平衡的PD-10柱(GE Healthcare Bioscience生产)而置换缓冲液，将得到的7.5ml于8.5℃下维持12小时。
[工序(C)：精制]
使用超滤膜(Amicon Ultra-15，截留分子量10kDa，Millipore生产)15倍浓缩上面得到的溶液，加载于用0.1M磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐在pH 6.8下平衡的Superdex 75 GL(10mm×30mm)，分离精制scFv。
将得到的流分提供给实施例5中使用的凝胶过滤HPLC及非还原SDS-PAGE，确认超滤膜精制的scFv为高纯度。在SDS-PAGE中，除了用实线的箭头表示的位置的scFv以外，还发现用虚线的箭头显示低分子量的成分，但这是由于作为生产宿主使用的大肠杆菌来源的残留蛋白酶分解而产生的scFv片段，和本次的重折叠没有关系。将上面的到的流分进一步提供给装有多角度光散射装置的场流分离仪，得到分子量33334的观测值。这样，确认了精制scFvz在水溶液中形成单体。分析结果如图17所示。
(实施例14)
[工序(1)：使用表面活性剂使变性蛋白质可溶化]
和实施例6一样地得到抗荧光素scFv的可溶化液1.4ml(月桂酰-L-Glu浓度2.5％，scFv浓度5.0mg/ml)。
[工序(A)：使用添加剂进行稀释前的稀释]
在得到的可溶化液中加入2.1ml的pH8.0的20mM的磷酸钠，搅拌后，在5℃下维持30分钟(月桂酰-L-Glu，1％)。
[工序(2)：使用添加剂进行稀释，工序(B)：二硫键的形成]
在得到的稀释液3.45ml中加入含有作为添加剂的精氨酸盐酸盐、作为氧化还原物质的氧化型及还原型谷胱甘肽的缓冲液31.05ml使总量为34.50mL(10倍稀释)。分别调节此溶液的月桂酰-L-Glu浓度为0.3％，精氨酸盐酸盐浓度0.8M，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的浓度均为1mM，抗荧光素scFv浓度为0.2mg/ml。
于8.5℃下维持17小时后，于23℃下维持24小时，进一步在45℃下加热4小时。而后，加载于经含有0.2M精氨酸盐酸盐的PBS平衡的Sephadex G25柱(5cm×10cm；GE Healthcare Bioscience生产)而置换缓冲液，将得到的42ml于8.5℃下维持12小时。
[工序(C)：精制]
将其中的35ml使用超滤膜(Amicon Ultra-15，截留分子量10kDa，Millipore生产)进行3.7倍浓缩，加载于经0.1M磷酸钠、0.2M精氨酸盐酸盐在pH 6.8下平衡的Superdex 75pg(2.6cm×60cm)，分离抗荧光素scFv。
将得到的流分提供给实施例5中使用的凝胶过滤HPLC及非还原SDS-PAGE，确认超滤膜精制的抗荧光素scFv为高纯度。将得到的流分进一步提供给装有多角度光散射装置的场流分离仪，得到分子量35200的观测值。这样，确认了抗荧光素scFv在水溶液中形成单体。进一步将此精制抗荧光素scFv(7.9μM)滴加于溶解于100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中的0.6μM荧光素(和光纯药生产)溶液中，于23℃下维持1小时后，测定荧光素荧光(激发波长480nm；荧光波长515nm)。结果是，随着抗荧光素scFv的滴加量的增加，荧光素荧光减弱。由此可知，抗荧光素scFv能再构成作为目的的天然状态的结构。分析结果如图18所示。
(比较例5)
作为以往技术的重折叠的粒子，使用津本等的阶段透析法(The Journal of Biological Chemistry 278(11)，8979-8987(2003))，进行HyHEL-10及抗荧光素scFv的重折叠。
将实施例5及实施例9中使用的HyHEL-10及抗荧光素scFv的不溶性颗粒(分别含有8.8mg、1.83mg的scFv)分别混悬于含有6M盐酸胍的pH8.5的20mM的磷酸钠43.75ml、9.13ml中，于37℃下进行30分钟的可溶化。
在此，加入DTT使其最终浓度为13mM，于37℃下加热1小时，还原SS键。将其中的0.5ml于8.5℃下由100ml的透析外液1向透析外液6依次透析，在第65小时回收透析内液。
透析外液的各组成如下所示：
1.10mM磷酸钠、6M盐酸胍、pH 8
2.10mM磷酸钠、3M盐酸胍、pH 8
3.10mM磷酸钠、2M盐酸胍、pH 8
4.20mM磷酸钠、1M盐酸胍、0.4M精氨酸盐酸盐、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM还原型谷胱甘肽、pH 8
5.20mM磷酸钠、0.5M盐酸胍、0.4M精氨酸盐酸盐、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM还原型谷胱甘肽、pH 8
6.20mM磷酸钠、pH 8.0
离心分离透析内液(12000g，10分钟)，将得到的上清加载于和实施例5一样的凝胶过滤HPLC(柱：Superdex 75GL，10×300mm，GE Healthcare Bioscience生产；展开液：0.1M磷酸钠，0.2M精氨酸盐酸盐，pH6.8；流速：0.8ml/分；HyHEL-10以2.02cm2/mg，抗荧光素scFv以1.3cm2/mg为定量的吸光系数)而求出重折叠率。结果，HyHEL-10为9.9％，抗荧光素scFv为5.5％，分别大幅低于实施例5(定量的scFv回收率，图6)、实施例9(45％，图12)的重折叠率。
附图简述
[图1]显示使用各种表面活性剂的可溶化的rhIL-6的量(参考例1)。
[图2]显示使用各种表面活性剂的可溶化的rhIL-6的量(参考例2)。
[图3]显示月桂酰-L-Glu浓度对rhIL-6可溶化量的影响(参考例3)。
[图4]显示月桂酰-L-Glu浓度和最大荧光波长及最大荧光强度之间的关系(参考例4)。
[图5]显示伴随月桂酰-L-Glu浓度的变化最大荧光波长的变化(参考例5)。
[图6]显示月桂酰-L-Glu浓度对HyHEL-10 scFv的重折叠率的影响(实施例5)。
[图7]显示氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的比例对HyHEL-10scFv的重折叠率的影响(实施例5)。
[图8]显示月桂酰-L-Glu浓度及精氨酸盐酸盐浓度对抗荧光素scFv的重折叠率的影响(实施例6)。
[图9]显示月桂酰-L-Glu浓度对抗荧光素scFv的重折叠率的影响(实施例7)。
[图10]显示加热时间对抗荧光素scFv的重折叠率的影响(实施例8)。
[图11]显示于5℃、10℃或15℃下维持18.5小时，并进一步于45℃下维持4小时时的抗荧光素scFv的重折叠率(实施例9)。
[图12]显示于5℃、10℃或15℃下维持18.5小时，进一步于23℃下维持24小时，并进一步于45℃下维持4小时时的抗荧光素scFv的重折叠率(实施例9)。
[图13]显示伴随月桂酰-L-Glu浓度及精氨酸盐酸盐浓度的变化抗血管性血友病因子单克隆抗体的Fab条带的变化(实施例10)。
[图14]显示在将图13的泳道编号2～13进行10倍稀释，10倍浓缩的情况下的Fab条带的变化(实施例10)。
[图15]显示氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的比例对抗血管性血友病因子单克隆抗体的Fab条带的影响(实施例11)。
[图16]显示了在10℃下维持17小时后，又于8.5℃或23℃下维持48小时或120小时时的抗荧光素scFv Fc融合体条带(实施例12)。
[图17]显示了使用超滤膜精制后的HyHEL-10scFv的凝胶过滤HPLC的谱图和HyHEL-10scFv条带(实施例13)。
[图18]显示了使用超滤膜精制后的抗荧光素scFv的凝胶过滤HPLC的谱图和抗荧光素scFv条带(实施例14)。

Claims (17)

1.由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质制造恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序：
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有C8～C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0.02～0.5％的工序，
(3)回收恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的工序。
2.权利要求1的制造方法，其中，前述表面活性剂为含有C8～C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸或者它们的盐。
3.权利要求1或2的制造方法，其中，前述表面活性剂为具有C8～C16的酰基的二羧酸或其的盐。
4.权利要求1～3中任一项的制造方法，其中，前述具有C8～C16的酰基的二羧酸为月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸。
5.权利要求1～4中任一项的制造方法，其中，在前述工序(1)和前述工序(2)之间，含有将由前述工序(1)得到的可溶化液稀释，得到前述表面活性剂的浓度为0.8～1.5％、pH为6.5～9.0的稀释液，将得到的稀释液于5℃～40℃保持0.5小时以上的工序(A)。
6.权利要求1～5中任一项的制造方法，其中，在前述工序(2)中，使前述表面活性剂的浓度及精氨酸或精氨酸衍生物的浓度阶段性地或逐渐地降低，于5～48℃维持1小时～5日。
7.权利要求1～6中任一项的制造方法，其中，前述精氨酸衍生物选自含有碳原子数1～6的酰基的精氨酸、精氨酸丁酯、胍丁胺及5-胍基-2羟基-戊酸。
8.权利要求1～7中任一项的制造方法，其中，前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质为基因重组蛋白质。
9.权利要求1～7中任一项的制造方法，其中，前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质为在结构域上具有免疫球蛋白结构的蛋白质。
10.权利要求9的方法，其中，前述在结构域上具有免疫球蛋白结构的蛋白质为具有一部分抗体结构域的抗体片段、双抗体或小型抗体的人工抗体、或者Fc融合蛋白质。
11.权利要求10的方法，其中，前述抗体片段为scFv、Fab、Fab’或(F(ab’)2)。
12.权利要求10的方法，其中，前述Fc融合蛋白质为将细胞因子、受体细胞外域或肽融合于抗体Fc结构域而成的蛋白质。
13.权利要求1～11中任一项的制造方法，其中，在恢复了天然状态的高级结构的蛋白质为具有二硫键的蛋白质的情况下，进一步含有通过使前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质发生氧化还原反应而形成分子内或分子间二硫键的工序(B)。
14.权利要求13的制造方法，其中，前述工序(B)中的前述氧化还原反应通过在由前述工序(1)得到的可溶化液或由前述工序(2)得到的缓冲液中加入氧化还原物质或铜离子来进行。
15.使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有C8～C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0.02～0.5％的工序。
16.由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质得到恢复其天然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序：
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.1～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的浓度降低至0.02～0.275％的工序。
17.使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序：
(1)通过在pH6.5～9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1～3％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，
(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.1～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的浓度降低至0.02～0.275％的工序。
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