EA000017B1 - Агент экстракции периплазматического рекомбинантного белка, способ получения периплазматического рекомбинантного белка и способ культивирования прокариотического микроорганизма - Google Patents
Агент экстракции периплазматического рекомбинантного белка, способ получения периплазматического рекомбинантного белка и способ культивирования прокариотического микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- EA000017B1 EA000017B1 EA199600001A EA199600001A EA000017B1 EA 000017 B1 EA000017 B1 EA 000017B1 EA 199600001 A EA199600001 A EA 199600001A EA 199600001 A EA199600001 A EA 199600001A EA 000017 B1 EA000017 B1 EA 000017B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- arginine
- extraction
- protein
- periplasmic
- expression
- Prior art date
Links
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 title claims abstract description 63
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 63
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 title abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 6
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 claims description 6
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 3
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 56
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 56
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 7
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 7
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 7
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 7
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 5
- -1 for example Proteins 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- YEIPDMVCOQKQHV-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-diphenyltetrazol-1-ium-1-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=C(C=2C=CC=CC=2)N=NN1C1=CC=CC=C1 YEIPDMVCOQKQHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 229910005911 NiSO4-6H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5437—IL-13
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Description
Изобретение относится к экстракции рекомбинантных белков, продуцированных прокариотическими микроорганизмами, в частности E.coli.
Все больше разрабатывается технологий с использованием методов генной инженерии для получения ценных белков, таких как, например, инсулин, интерлейкины, гормон роста и т.п.
Обычно микроорганизм трансформируют вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий интересующий белок, и элементы, необходимые для его экспрессии, такие как сигналы регулирования. Затем микроорганизм культивируют в подходящей культуральной среде при подходящих параметрах культивирования, и когда будет получено достаточное количество клеток микроорганизма, добавляют индуктор запуска фазы указанной экспрессии, во время которой продуцируется целевой белок в большом количестве и накапливается. По окончании культивирования суспензию клеток отделяют от культуральной среды, например, центрифугированием или микрофильтрацией, потом проводят процесс экстракции, который часто начинают с операции разрушения стенок микроорганизмов.
Экспрессия гена, кодирующего интересующий белок в прокариотическом микроорганизме, может быть цитоплазматической, периплазматической или секреторной в зависимости от природы использованных элементов экспрессии для указанного гена (промотор, терминатор, сайт связывания рибосом, сигнальный пептид и т.д.).
Цитоплазматическая экспрессия позволяет получить значительные количества белков. Однако до экстракции интересующего белка необходимо провести стадию денатурации/ренатурации для белков, содержащих один или несколько дисульфидных мостиков, что является особенно трудной и деликатной стадией при производстве в промышленных масштабах. Стадию денатурации/ренатурации проводят по классическим методикам, хорошо известным специалистам, используя денатурирующий агент в присутствии восстановителя, потом условия ренатурации включают, например, контроль окисления-восстановления раствора. Среди денатурирующих используемых агентов можно привести хлоргидрат гуанидина, который был предложен для способа получения интерпейкина-2 человека. Для этой цели можно сослаться, например, на европейскую заявку на патент ЕР-А2-0 145 390.
Системы секреторной экспрессии, в которых интересующий белок находится в культуральной среде, активным образом мало или совсем не используются грамотрицательными бактериями из-за их низкой продуктивности. Здесь нужно отметить, что бактериальная культуральная среда с большой плотностью в биореакторе не является идеальной для чувствительных рекомбинантных белков из-за, например, опасностей денатурации на поверхности раздела.
Периплазматическая экспрессия позволяет получить непосредственно рекомбинантные белки, в принципе правильно уложенные в защищенном пространстве от окружающей среды, и это предоставляет разумный выбор для получения белков, а именно негликозилированных белков. В этом случае, следовательно, нет необходимости подвергать белки стадии денатурации/ренатурации.
Способами разрушения клеток, обычно полезными в этой области, являются, например, лизис клеток под действием ультразвука или механического давления (French Pressure Cell, шаровая мельница), химический лизис или ферментный лизис, осмотический шок и обработка хаотропными агентами или детергентами. Эти методы большей частью разрушают клеточные мембраны, при которых плазматические мембраны и мембраны эндоплазматического ретикулюма образуют гомогенную суспензию клеточного дебриса. Осадок клеточного дебриса может быть собран в общем после центрифугирования (ядра, цитоскелет, митохондрии, лизосомы, рибосомы, макромолекулы и т. п.), его природа зависит, в частности, от длительности и скорости центрифугирования (1 0 мин для 1 000 q до 3 ч для 150 000 q).
Трудности, встречающиеся во время операций экстракции, меняются в зависимости от типа экспрессии и использованных методов экстракции и заключаются, например, в
- потере выхода рекомбинантного белка,
- потере биологической активности рекомбинантного белка,
- протеолитическом разложении рекомбинантного белка,
- токсичности экстрагирующих агентов и обязательном контроле их удаления,
- трудностях промышленного осуществления,
- смешивания периплазматических белков с цитоплазматическими белками.
Кроме того, когда продуцированные целевые белки являются гидрофобными или заряженными, они могут ассоциировать с клеточными компонентами, которые сами являются гидрофобными или заряженными, что приводит к особенно трудной экстракции.
Промышленное производство целевых рекомбинантных белков с помощью генетической инженерии представляет значительный интерес, но необходимо использовать такие методы экстракции, которые устраняют или сводят к минимуму указанные выше недостатки.
Наконец, важно не только получить значительные количества целевого белка, но также нужно, чтобы эти белки не были загрязнены экстрагирующими агентами и сохранили всю свою биологическую активность.
Для этой цели уже были предложены различные способы, в частности для экстракциивыделения интерлейкина-2.
В европейской заявке на патент ЕР-А2-0 145 390 описан способ получения негликозилированного человеческого интерлейкина-2 (ИЛ-2), имеющего удельную активность выше 104 Е/кг, в котором для экстракции ИЛ-2 проводят стадию выделения хроматографией на колонке. Этот способ также требует введения стадии денатурации с помощью хлоргидрата гуанидина.
В европейской заявке на патент ЕР-А1-0 337 243 описан способ очистки человеческого интерлейкина-2, в котором использована система двух колонок для жидкостной хроматографии с обратимой фазой. Перед стадией хроматографической очистки нерастворимую фракцию бактериального клеточного лизата экстрагируют раствором, содержащим хлоргидрат гуанидина, чтобы получить бактериальный экстракт, который затем разбавляют буфером, не содержащим хлоргидрат гуанидина, потом хроматографируют, элюирование проводят с градиентом ацетонитрила.
В европейской заявке на патент ЕР-А2-0 147 819 предложен способ получения гомогенного и чистого рекомбинантного интерлейкина2. Этот способ заключается в культивировании микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий интерлейкин-2, проведении лизиса клеток, извлечении клеточного дебриса, экстракции ИЛ-2 путем промывки клеточного дебриса соответствующим промывочным раствором с последующей хроматографической очисткой раствора, полученного при промывке. Используемые промывочные растворы могут содержать соль, такую как хлорид натрия или хлоргидрат гуанидина, или детергент, такой как, например, продукт, известный под торговым названием Тритон XR - 100.
В соответствии с предпочтительным вариантом предусматривается последовательное использование трех промывочных растворов, а именно промывочного раствора, содержащего хлорид натрия, промывочного раствора, содержащего детергент, и промывочного раствора, содержащего хлоргидрат гуанидина.
Теперь неожиданно обнаружено, что экстракция целевого белка, продуцируемого прокариотическим микроорганизмом, трансформированным вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, и элементы для экспрессии, такие как сигналы регулирования, необходимые для его периплазматической экспрессии, может быть осуществлена при суспендировании осадка клеток или клеточного дебриса микроорганизмов, полученных при культивировании указанного микроорганизма, в буферном растворе, указанный раствор целесообразно содержит аргинин, аргинин может быть в L или D форме.
Это упрощение способа экстракции дает преимущество при промышленном получении периплазматических рекомбинантных белков, при просеивании для определения биологической активности лабораторного образца, содержащего, например, зрелые белки.
В отличие от гуанидина.НС1, часто используемого в качестве экстрагирующего агента, аргинин не является агрессивным по отношению к материалам, используемым в промышленности, а именно к стали. С другой стороны, аргинин не является загрязняющим окружающую среду агентом, что также не требует дорогостоящего процесса обработки выходящих потоков.
Преимущество получения периплазматического белка в присутствии аргинина с концентрациями, по крайней мере, равными 2 г/л, в частности при концентрациях между 2 и 1 0 г/л в культуральной среде, доказывается повышением выхода секретируемого рекомбинантного белка, полученного in vivo.
В соответствии с первым аспектом, объектом изобретения является применение аргинина в качестве агента экстракции периплазматических белков.
В соответствии со вторым аспектом, объектом настоящего изобретения является способ экстракции целевого периплазматического рекомбинантного белка, заключающийся в том, что:
) суспендируют клеточный осадок, полученный при культивировании микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий указанный белок, и все сигналы регулирования, необходимые для его периплазматической экспрессии, в буферном растворе, содержащем аргинин, и после определенного времени контакта адекватных условиях рН, температуры, концентрации бактерий и т.п., осаждают полученную суспензию и
2) извлекают целевой белок из супернатанта полученной таким образом бактериальной суспензии.
Вариант указанного способа экстракции целевого периплазматического рекомбинантного белка заключается в суспендировании осадка клеточного дебриса, полученного после лизиса клеток, полученных при культивировании прокариотического микроорганизма, в буферном растворе, содержащем аргинин. Экстракция периплазматических белков является особенно эффективной, когда экстрагирующий буфер состоит из водного раствора, содержащего аргинин в концентрации, по меньшей мере, равной 0,4 М аргинина в пределах растворимости аргинина при комнатной температуре в воде (близкой к 0,8 М в чистой воде и выше в присутствии солей), при рН, предпочтительно, равном 8.
Аргинин является природной αаминокислотой, которая была предложена в качестве вспомогательного агента денатурации (ренатурации) замещения двух цепей Аббокиназык (мочевой активатор плазминогена), в котором нативный пептид частично замещается синтетическим пептидом во время этой операции. (см. G.A. Homandberq et T. Wai Biocimica et Biophysica Acta, 1990, 1038, 209-215).
В способе по изобретению или в его варианте не происходит денатурации (ренатурации) белка и аргинин участвует только на уровне экстракции белка из осадка клеток или клеточного дебриса микроорганизмов.
Аргинин обеспечивает повышение выхода и биологической активности белка. Действительно было обнаружено, что, например, извлекают зрелую форму ИЛ-13 с выходом более 95% при полном сохранении его биологической активности. Следует отметить, что опыты по экстракции с помощью осмотического шока на той же самой системе экспрессии не приводят к сравнимым выходам.
Сравнительные опыты показали, что гуанидин НО, используемый в тех же самых условиях, также позволяет извлекать белок ИЛ-13 с выходом более 95%, тогда как биологическая активность извлеченного таким образом белка, ухудшается больше, чем в способе с аргинином.
Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что аргинин действует как мягкий биологический хаотропный агент в противоположность мощным хаотропным агентам, денатурирующим при высоких концентрациях, равных или превышающих 5М, необходимым, чтобы обеспечить экстракцию, таким как хлоргидрат аргинина.
Способ по изобретению или его вариант могут быть осуществлены после любого процесса культивирования микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, и элементы для периплазматической экспрессии указанного белка, таких как любые необходимые сигналы регуляции.
Для специалиста в этой области очевидно, что способ применим к бактериям, близким к E.coli, т. е. к бактериям, называемым грамотрицательными, анаэробным, необязательно составляющим группу энтеробактерий. В это семейство энтеробактерий входят, в частности, виды: Escherichia, Salmonella, Erwinia mais, а также Shiqella, Klebsiella, Serratia, Froteus и Enterobacter.
Учитывая хаотропный характер аргинина, аргинин можно успешно применять вместо других хаотропных агентов. Невозможно подтвердить примерами все семейства бактерий из-за разнообразия рассматриваемых живых систем, но очевидно, что специалист может применить и приспособить способ экстракции с аргинином к своему конкретному случаю.
Такие способы культивирования хорошо известны специалистам. Способы, описывающие культивирование грамотрицательных бактерий в ферментере, описаны, например, в европейских патентах ЕР-360641 и ЕР-356335, относящихся к получению и использованию штаммов E.coli, называемых SEBR 1250 и ТР 2339.
Когда при культивировании получают достаточное количество клеток, культуральную среду подвергают центрифугированию (обычно) или микрофильтрации и полученный осадок биомассы контактируют с буферным раствором, содержащим аргинин, согласно способу изобретения.
Как правило работают при температуре, лежащей между комнатной температурой примерно 25 и 2°С, предпочтительно 4°С.
Время контакта клеточного осадка с буферным раствором, содержащим аргинин, должно быть достаточным, чтобы обеспечить переход целевого белка в буферный раствор.
Обычно при работе при 4°С время контакта преимущественно составляет примерно 1 ч.
Экстракция, т.е. переход периплазматического белка в среду, происходит при контактировании биомассы и экстрагирующего буфера с аргинином. Время контакта, обеспечивающее полную экстракцию или не увеличивающуюся, лежит между 30 мин и 16 ч. Опыты показали, что могут быть получены удовлетворительные выходы экстракции в течение нескольких часов при 4°С. Также было отмечено, что слабое перемешивание биомассы в экстрагирующем буфере для предотвращения седиментации осадка микроорганизмов дает лучшие результаты, т.е. более высокую степень экстракции в зависимости от времени.
Способ экстракции согласно изобретению удобен для экстракции таким образом как гидрофобных белков, таких как, например, интерлейкины, в частности ИЛ-13, описанный в европейской заявке на патент ЕР-А1-0 506 574, так и гидрофильных белков, таких как, например, гормон роста (hGH). Способ изобретения упрощает получение hGH, который обычно требует для своей экстракции применения осмотического шока.
Для осуществления экстракции целевого белка непосредственно из суспензии клеточного осадка предпочтительным будет буферный раствор, содержащий аргинин в концентрации между 0,4 и 0,8 М.
Когда хотят осуществить экстракцию целевого периплазматического белка из осадка клеточного дебриса согласно варианту способа изобретения, работают таким же образом, как в способе согласно изобретению до стадии получения осадка клеток, полученного после центрифугирования или микрофильтрации, потом проводят разрушение клеток по хорошо известным специалистам методикам. Методы разру7 шения клеток описаны, например, в С. T. Choma and H. Yamazaki, Can. J. Microbiol, 1981, 27, 547550; L.O. Inqram, Journal of Bacteriology, 1981, 146, 1, 331-336 ;N.G. Mossal and L.A. Heppel, Journal of Biological Chemistry, 1966, 241, 13., 3065-3072, K. Bennett, D.K. Taylor and A. Hurst, Biochem. Biophys. Acta 18 (3), 512-521, (1966) и коллективном труде Ферментация и ферментная технология. Глава 12, 239-309, J. Willey and Sons Editeurs. (1979).
Осадок клеточного дебриса, собранный обычно после центрифугирования, суспендируют, потом контактируют с буферным раствором, содержащим аргинин. Время контакта клеточного дебриса с буферным раствором, содержащим аргинин, должно быть достаточным, чтобы обеспечить переход целевого белка в буферный раствор. Обычно при температуре 4°С время контакта, обеспечивающее практически полную экстракцию, составляет 48 ч. Также было отмечено, что слабое перемешивание биомассы в экстрагирующем буферном растворе, устраняющее таким образом седиментацию клеточного дебриса, приводит к более высокой степени экстракции в зависимости от времени.
Этот вариант способа экстракции согласно изобретению удобен для экстракции, в частности, целевых периплазматических белков, которые сильно ассоциированы с клеточными мембранами, таких как, например, интерлейкины.
Специалистам в данной области хорошо известно, что экстрагирующий буфер, содержащий аргинин, согласно изобретению, также может содержать дополнительный детергент, который будет улучшать выход и/или скорость экстракции целевого белка. Среди дополнительных детергентов, которые могут быть использованы, специалист будет выбирать те, которые позволят сохранить преимущества использования аргинина как экстрагирующего агента, в частности сохранение биологической активности целевого белка. Среди этих мягких дополнительных детергентов можно привести, например, алкилгликозиды, например, алкилмальтозиды, α- или β-нонил-Дглюкопиранозиды, α- или β-октил-Дглюкопиранозиды или α- или βалкилкарбамоилметил-Д-глюкопиранозиды, например HecameqR, очень низкая токсичность которых позволяет считать возможным нахождение его в следовых количествах как составного агента в конечном продукте.
Для осуществления экстракции целевого белка из суспензии осадка клеточного дебриса предпочтительно использовать буферный раствор, содержащий аргинин в концентрации между 0,4 и 2,5 М, концентрация 2,5 М аргинина может быть получена, в частности, в присутствии солей.
Кроме того обнаружено, что аргинин оказывает значительное благоприятное действие на выходы рекомбинантного периплазматического секретированного белка, если его добавляют не в обычных и очень высоких концентрациях к белкам, которые встречаются в культуральных средах, полученных из гидролизатов коммерческих белков, и которые позволяют удовлетворить потребность в аргинине применяемого штамма.
С другой стороны, было обнаружено, что аргинин оказывает особенно благоприятное действие, если концентрации аргинина, добавленного в культуральную среду, лежат между 2 и 10 г/л.
Итак, согласно другому аспекту изобретения его объектом является способ культивирования прокариотических микроорганизмов, трансформированных с помощью вектора экспрессии, содержащего ген, кодирующий целевой белок, который заключается в культивировании указанного микроорганизма в присутствии аргинина в концентрации, по меньшей мере, равной 2 г/л и, в частности, при концентрации между 2 и 1 0 г/л.
Специалист в этой области может оптимизировать эту концентрацию аргинина в зависимости от конкретного случая.
Этот способ особенно пригоден для получения белков с активностью типа цитокина, в частности ИЛ-13, такой как описана в европейской заявке на патент ЕР-А1-0 506 574.
Далее изобретение будет описано более детально с помощью примеров, которые приведены только для иллюстрации.
Пример 1. Экстракция периплазматического ИЛ-1 3 из E.coli в присутствии аргинина из осадка клеток.
) Культивирование в колбе.
В этом примере используют штамм E.coli RB 791 (Roger Brent, P1AS 78 (1981), стр.42044208), трансформированный плазмидой р922, полученной по способам, аналогичным способам, описанным в патентах ЕР 360 641 и 356 335, последовательность ДНК которой представляет собой последовательность SEQ ID № 1.
Различные последовательности, которые составляют эту плазмиду р922, указаны ниже (см. конец описания )
Последовательность промотора.
Характеристические гексануклеотиды TTGCTT и ТАТААТ промоторов у E.coli, обозначены жирным шрифтом (см.конец описания).
Последовательность 5'-нетранслируемой области и РНК.
Сайт связывания на рибосоме указан жирным шрифтом. Последовательность CAT, расположенная на 3'-конце этой последовательности, является частью гексануклеотида, распознаваемого ферментом рестрикции Ndel.
Последовательность, кодирующая предшественник ИЛ-13.
Последовательность, обозначенная курсивом, соответствует последовательности зрелого
ИЛ-13. Последовательность, которая не обозначена жирным шрифтом, является связующей последовательностью, связывающей конец последовательности, кодирующей ИЛ-13, с гексануклеотидом, распознаваемым ферментом рестрикции BamH1 (плазмида р BR 327 описана в документе Gene, 9, 287-305,1980).
Этот штамм E.coli RB 791/p922 предварительно культивируют в течение ночи при 30°С при перемешивании 200 об/мин в среде L(Luria Broth, описанный в Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sambook, Fritsch, Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-е издание, 1989) со 100 мг/л ампициллина. Исходя из этой пре-культуры инокулируют новую колбу со средой L таким образом, чтобы исходная Д. O. (Д. О. = оптическая плотность при 600 нм, Д.О.= 1 соответствует 400-450 мг биомассы/л) была равна 0,6. После часа выстаивания культур индуцируется с помощью 1 мМ 1PTG (βизопропил-Д-1 -тиогалактопиранозида) и продолжают его 3 ч. Образцы бактериальной суспензии центрифугируют и собранные таким образом бактериальные осадки суспендируют в экстрагирующих буферах, приведенных ниже, таким образом, чтобы конечная Д. О. была равна 10, что эквивалентно 4,5 г биомассы/л в момент экстракции.
Экстрагирующие буферы, использованные в этом примере, являются следующими:
А: Аргинин 0,8 м рН 8,0, скорректированный НО, в воде Милли-Q' (Миллипор).
В: Гуанидин.НС1 5 М в воде Милли-Q' без коррекции рН.
Экстракцию проводят в течение 1 ч при 4°С при легком перемешивании магнитной мешалкой.
Для измерения эффективности экстракции отбирают образцы, эквивалентные 1 мл суспензии культуры с Д.О. 0,2, и соответствующие бактериальные осадки, полученные центрифугированием при 5000xq в течение 10 мин, наносят на гель полиакриламида 16,5% после денатурации SDS. Бактериальные суспензии также центрифугируют и их супернатанты обессоливают ультрафильтрацией (прибор для фильтрации Ультрафри-МС с порогом разрыва 5000 Да Миллипор) перед нанесением на гель. Сам гель проявляют Вестерн-блот-анализом, используя антитело анти-ИЛ-1 3 СНО, и количественно оценивают с PhosphorimaqerR (Molecular Dynamics). Антитела анти-ИЛ-13 СНО (яичники китайского хомячка), использованные в этом примере, были получены иммунизацией кроликов.
В этом примере было установлено, что экстракция в присутствии гуанидина.НС1 или же в присутствии аргинина является почти количественной для зрелой формы с выходами экстракции в обоих случаях выше 99%.
Также было отмечено, что в супернатанте, экстрагированном в присутствии аргинина, форма предшественника ИЛ-1 3 не показывает различий с экстрактом, полученным в присутствии гуанидина.НО.
2) Культивирование в ферментере. Штамм E.coli RB 791/р922 наносят на среду L со 100 мг/л ампициллина и инкубируют при 30°С при перемешивании, чтобы создать прекультуру. Объем 100 мл этой прекультуры служит инокулятом для ферментера общим объемом 2,5 л марки MBR. Культивирование проводят в объеме 1,2 л в среде, состав которой приведен ниже, и в условиях, определенных ниже. Среда для ферментера - штамм E.coli RB 791/р922. Состав приведен для 1 л готовой среды, объем инокулята отброшен.
1. Растворите в 700 мл воды Милли-Q':
| Компонент | Масса/л |
| EDTA | 1 г |
| FeSO4-7H2O | 45 мг |
| MgSO4-7H2O | 1,5 г |
| K2SO4 | 0,75 г |
| CaCl2-H2O | 32 мг |
| NaCl | 1,45 г |
| KCl | 5 г |
| HY-SOY' | 75 г |
| L-метионин | 1,4 г |
| Триптофан | 1 г |
| Опигоэлементы* | 2 мл |
| Дрожжевой экстракт | 10 г |
Дополнить до 800 мл водой Милли-Q', автоклавировать 30 мин при 120°С.
2. Фильтровать на 0,2 мкм в воде МиллиQ'
Глицерин 1 5 г
К2НРО4 7,1 г
Концентрацию глицерина поддерживают между 1 0 и 1 5 г/л во время культивирования.
| 3. В момент индукции добавить: | |
| IPTG | 1 г |
| 6-Аминокапроновая кислота | 0,65 г |
| HY-SOY' | 40 г |
| L-цистеин | 0,3 г |
| Объем этой добавки не включен в другие |
расчеты.
*Растворы олигоэлементов
Его используют в количестве 1 мл/л.
Для 1 л готового раствора в воде Милли-Q растворяют в 800 мл:
| Компонент | Масса/л |
| Н3ВО3 | 3 мг |
| NaMoO4-2H2O | 4,8 мг |
| MnSO4-H2O | 59 мг |
| CoCl2-6H2O | 23,8 мг |
| CuSO4-5H2O | 8,7 мг |
| ZnSO4-7H2O | 1 3 мг |
| F А1С13-6Н2О | 60 мг |
| KCr/SO4/2-12H2O | 6 мг |
| К1 (приготовлен перед | |
| введением) | 60 мг |
| NiSO4-6H2O | 2,6 мг |
| Прибавить 1 00 мл | концентрированной |
НО. Дополнить до 1000 мл водой Милли-Q'.
Д.О. 58 достигнута, экспрессию ИЛ-13 индуцируют добавлением IPTG в количестве 1 г/л и продолжают в течение 5 ч.
Параметры культивирования в ферментере были следующие: рН 7,4; Т=30°С; рО2=40 мм рт.ст., регулируемое перемешиванием; расход воздуха находится между 1 и 3 л/мин.
Способы экстракции и использованные для измерения биологической активности являются такими же, как те, что описаны в параграфе 1 выше.
Установлено, что экстракция бактериального осадка, полученного в ферментере, а не в колбе в присутствии гуанидина.НС1 или же в присутствии аргинина, является практически полной для зрелой формы ИЛ-13 при выходах экстракции в обоих случаях выше 97%.
Пример 2. Биологическая активность экстрагированного таким образом ИЛ-13.
Экстракты, полученные в присутствии гуанидина.НС1 или аргинина в примере 1 , обессоливают ультрафильтрацией, как описано выше. Они были взяты после серийного разбавления в присутствии субклона ИЛ-13, зависимого от клеточной линии В9. Активность разбавленных образцов ИЛ-13 вызывает рост клеток В 9 и определяют концентрацию полупролиферации. Рост клеток был прекращен после 3 дней контакта добавлением МТТ: [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолий) бромида] и измерен спектрофотометрически по поглощению голубой окраски при 565 нм. Биологическая активность ИЛ-1 3 выражена в нг/мл по отношению к стандарту ИЛ-13, который сам был откалиброван по стандартному международному кандидату, полученному из культуры ИЛ-1 3 СНО, полученной при иммунизации кроликов по N.Vita, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983, 225, 2, 436-445. Полученные результаты приведены в табл. 1.
Приведенные результаты показывают, что удельная биологическая активность экстракта с аргинином является, перед любой другой операцией последующей очистки, более высокой, чем у экстракта с хлоргидратом гуанидина.
Пример 3. Экстракция периплазматического чГР из E.coli в присутствии аргинина из осадка клеток.
Штамм SEBR 1250 (ЕР-360641 и ЕР356335) вводят в прекультивирование в течение ночи при 37°С и перемешивании со скоростью 200 об/мин в среде L/Luria broth/co 1 00 мг/л ампициллина. Из этой прекультуры новая колба со средой L была инокулирована таким образом, что начальная Д.О. равна 0,2. После 1 ч выдержки культуру индуцируют 1 мМ IPTG и продолжают его в течение 3 ч. Центрифугируют образцы бактериальной суспензии и суспендируют полученные при этом бактериальные осадки в экстрагирующих буферах таким образом, чтобы конечная Д. О. была равна 1 0, что эквивалентно 4,5 г биомассы/л в момент экстракции.
Условия экстракции представлены в табл.2.
Для измерения эффективности экстракции отбирают образцы, эквивалентные 1 мл суспензии культуры с Д.О. 0,2, и соответствующие бактериальные осадки, полученные центрифугированием при 5000 q в течение 10 мин, наносят на гель полиакриламида 16,5% после денатурации SDS. Бактериальные суспензии также центрифугируют и их супернатанты наносят на гель. Сам гель проявляют Вестерн-блотанализом, используя антитела анти-чГР и количественно оценивают с Phosphorimaqer (Molecular Dynamics). Использованные антитела к чГР были получены иммунизацией кроликов.
Анализ полос, полученных с PhosphorimaqerR, позволяет сделать вывод, что экстракция человеческого периплазматического чГР, продуцированного в E.coli, в присутствии аргинина является эффективной. В этом примере выход экстракции, по крайней мере 60%, может быть достигнут в присутствии 0,8 М аргинина, рН 8,0, Т 22°С и 20 ч выдержки, а выход более 80% может быть достигнут при экстракции в присутствии аргинина 0,8 М рН 8,0, Т 4°С и 20 ч выдержки.
чГР является гидрофильным белком, можно сделать вывод, что рекомбинантные белки очень различной природы, аккумулированные в периплазме E.coli, могут быть просто экстрагированы в присутствии аргинина.
Пример 4. Экстракция периплазматического ИЛ-13 E.coli из клеточного дебриса в присутствии аргинина.
1) Культивирование в ферментере.
В этом примере используют штамм E.coli ТР2339 (ЕР 360641 и ЕР 356335), трансформированный плазмидой р922, полученной по способам, аналогичным описанным в примере 1 .
Штамм E.coli TP2339/p922 наносят на среду L со 1 00 мг/л ампициллина и инкубируют при 30°С и при перемешивании, чтобы создать прекультуру. Объем 100 мл этой прекультуры служит инокулюмумом для ферментера общим объемом 2,5 л марки MBR. Культивирование проводят в объеме 1,2 л в указанной ниже среде и в приведенных ниже условиях.
Среда для ферментера - штамм E.coli TP2339/p922.
Считая на конечный объем 1,2 л, культуральная среда составлена при добавлении 1 л автоклавированной фазы и 0,1 л фильтрованной фазы, составы которых приведены ниже, и 0,1 л прекультуры, определенной выше.
1) Автоклавированная фаза (1000 мл):
Растворить в 900 мл воды Милли-Q1''
Компонент Масса/л
Трицин 360мг
FeSO47H2O 280 мг
CaCl/2H2O 6,7 мг
| MoCl2-6HO2 | 1,27 г |
| K2SO4 | 8,72 г |
| NaCl | 500 мг |
| KCl | 5 г |
| Hy-Case (SF)R | 25 г |
| Дрожжевой экстракт | 18 г |
| Олигоэлементы* | 1 мл |
| L-аргинин | 1,5 мг |
| Установить рН 7,4 раствором КОН, потом |
довести до 1000 мл водой Милли-Q1''. Автоклавировать 30 мин при 120°С.
2) Фильтрованная фаза (100 мл).
Провести стерильно фильтрацию на мем-
| бране 0,2 мкм: Глюкоза | 20 г |
| Глицерин | 50 г |
| КИРСР | 5 г |
| Концентрацию глюкозы поддерживают |
время культивирования на уровне между 5 и 15 г/л.
Когда Д.О. будет достигнуто (примерно 16 г сухого материала/л) экспрессию ИЛ-13 запускают добавлением IPTG 1 г/л и продолжают в течение 5 ч. Параметры культивирования являются следующими: рН=7,4, регулируется КОН и 3Н НС1 Т=37°С, рО2=50 мбар, регулируется перемешиванием при расходе воздуха между 1 и 3 л/мин.
3) Извлечение и измельчение бактериальных клеток.
Центрифугируют 1 л культуральной суспензии в течение 20 мин при ~6400g. Осадок обрабатывают таким же объемом буфера Трис 10 мМ, ЕДТА 1 мМ, пепстатин 1 мг/л, рН 8 при механическом перемешивании винтовой мешалкой.
Измельчение осуществляют в прессе Мантон-Голэн при давлении 700 бар во время двух проходов. Гомогенат такой, что может быть сохранен при -80°С в этом примере.
4) Экстракция.
После размораживания отбирают 5 мл гомогената с Д.О.,равной 75 (30 г сухого материала/л), потом центрифугируют 50 мин, при 23300
q.
Полученный таким образом осадок обрабатывают одной третью первоначального объема буфера Трис 0,1 мМ рН 7,0 потом доводят до первоначального объема раствором, содержащим аргинин, таким образом, что конечная концентрация аргинина равна 2,5 М и рН 8,0.
Для этого примера вспомогательный детергент (HecameqR с конечной концентрацией 20 г/л) ассоциирован с аргинином.
Приготовленную таким образом суспензию клеточного дебриса помещают при 4°С в роторную мешалку при 300 об/мин на 2 дня.
Затем суспензию центрифугируют последний раз 50 мин при 23300 q, супернатант представляет собой целевой экстракт.
5) Биохимический анализ и биологическая активность.
а) определение суммарных белков проводят по методике Анализ белка Биорад.
б) Способ определения рекомбинантного ИЛ-1 3 является таким же, что использован в примере 1 .
Также рассчитывают выход ИЛ-13.
Полученные результаты приведены в табл.3.
В этом примере установлено, что экстракция, проведенная с клеточным дебрисом в присутствии 2,5 М аргинина и вспомогательного детергента позволяет получить выход экстракции около 70%.
Пример 5. Экспрессия ИЛ-13 в присутствии аргинина в культуральной среде.
Штамм E.coli RB 791/р922 культивируют в среде L со 1 00 мг/л ампициллина в присутствии различных концентраций аргинина. Индукция была вызвана через 1 ч после инокуляции добавлением IPTG в количестве 1 мМ и после этого проводят культивирование в течение 3 ч.
Образцы бактериальных осадков эквиваленты 1 мл культуральной суспензии с Д.О. 0,2, и соответствующие образцы супернатанта наносят на гель, проявляют и количественно оценивают, как описано выше.
Результаты приведены в табл.4.
Оказалось, что в условиях эксперимента и рассматриваемой системы экспрессии:
- аргинин повышает экспрессию периплазматического ИЛ-1 3 от 2 г/л и значительно с 4 г/л,
- рост бактерий замедляется при концентрации 8 г/л,
- при этих концентрациях аргинин не вызывает переход ИЛ-1 3 в супернатант.
Интерес к способу экстракции с аргинином согласно изобретению обусловлен возможностью использовать такие экстракты белков, как таковые или при минимальной обработке в тестах на биологическую активность.
Перечень последовательностей (1) Общая информация (1) Заявитель (A) Название: САНОФИ (B) Улица: 32-34 рю Марбеф (C) Город: Париж (E) Страна: Франция (F) Почтовый код: 75008 (G) Телефон: 53.77.41.31 (H) Факс: 53.77.42.16 (h) Название изобретения: Способ экстракции периплазматических белков из прокариотических микроорганизмов в присутствии аргинина (iii) Количество последовательностей: 1 (2) Информация о последовательности SEQ N 1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 441 0 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) Количество разветвлений: простая (D) Конфигурация: линейная (ii) Тип молекулы: ДНК (геномная)) (xi) Описание последовательности: 5EQ ID
N 1:
Claims (5)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Применение аргинина в качестве агента экстракции периплазматического рекомбинантного белка.
- 2. Способ получения периплазматического рекомбинантного белка путем суспендирования осадка клеток, полученных при культивировании прокариотического микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий указанный белок, и элементы для его экспрессии в периплазме микроорганизма, в буферном растворе, содержащем агент экстракции белка, с последующим осаждением полученной бактериальной суспензии и извлечением белка из надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в качестве агента экстракции используют аргинин.
- 3. Способ получения периплазматического рекомбинантного белка путем суспендирования осадка дебриса клеток, полученных при культивировании прокариотического микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий указанный белок, и элементы для его экспрессии в периплазме микроорганизма, в буферном растворе, содержащем агент экстракции белка, с последующим осаждением полученной бактериальной суспензии и извлечением белка из надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в качестве агента экстракции белка используют аргинин.
- 4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют водно-щелочной раствор, при этом концентрация аргинина составляет по меньшей мере 0,4 М.
- 5. Способ культивирования прокариотического микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, отличающийся тем, что культивирование проводят в присутствии аргинина при концентрации его, равной, по меньшей мере, 2 г/л.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501083A FR2729972B1 (fr) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA199600001A2 EA199600001A2 (ru) | 1996-07-01 |
| EA199600001A3 EA199600001A3 (ru) | 1996-10-01 |
| EA000017B1 true EA000017B1 (ru) | 1997-12-30 |
Family
ID=9475667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA199600001A EA000017B1 (ru) | 1995-01-31 | 1996-01-26 | Агент экстракции периплазматического рекомбинантного белка, способ получения периплазматического рекомбинантного белка и способ культивирования прокариотического микроорганизма |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5700665A (ru) |
| EP (1) | EP0725140B1 (ru) |
| JP (1) | JP3005464B2 (ru) |
| KR (1) | KR100401028B1 (ru) |
| CN (1) | CN1132842C (ru) |
| AR (1) | AR000831A1 (ru) |
| AT (1) | ATE250132T1 (ru) |
| AU (1) | AU700509B2 (ru) |
| BR (1) | BR9600270A (ru) |
| CA (1) | CA2168382C (ru) |
| CZ (1) | CZ286509B6 (ru) |
| DE (1) | DE69629965D1 (ru) |
| EA (1) | EA000017B1 (ru) |
| FI (1) | FI960427A (ru) |
| FR (1) | FR2729972B1 (ru) |
| HU (1) | HU222598B1 (ru) |
| IL (1) | IL116973A0 (ru) |
| MX (1) | MX9600380A (ru) |
| NO (1) | NO316519B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ280919A (ru) |
| PL (1) | PL183598B1 (ru) |
| SK (1) | SK281946B6 (ru) |
| TW (1) | TW403760B (ru) |
| UA (1) | UA27997C2 (ru) |
| ZA (1) | ZA96734B (ru) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1048732A1 (de) * | 1999-04-26 | 2000-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen |
| KR20010056451A (ko) * | 1999-12-15 | 2001-07-04 | 윤재승 | 아르기닌이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물 |
| US20040215139A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-10-28 | Todd Cohen | Apparatus and method for implanting left ventricular pacing leads within the coronary sinus |
| CA2633554C (en) * | 2005-12-22 | 2012-11-13 | Genetech, Inc. | Recombinant production of heparin binding proteins |
| CN101506222B (zh) | 2006-07-14 | 2013-10-02 | 健泰科生物技术公司 | 重组蛋白的重折叠 |
| GB201107737D0 (en) | 2011-05-09 | 2011-06-22 | Univ Birmingham | Extraction from cells |
| WO2022191223A1 (ja) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 | 株式会社カネカ | 原核生物細胞から標的タンパク質を抽出する方法 |
| EP4317169A1 (en) | 2021-03-22 | 2024-02-07 | Kaneka Corporation | Production method for foreign protein using escherichia coli |
| CN113249391A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-13 | 江苏坤力生物制药有限责任公司 | 一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6244198A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-02-26 | Toray Ind Inc | 有用タンパク質の生産方法 |
| JPS6251983A (ja) * | 1985-09-02 | 1987-03-06 | Hagiwara Yoshihide | ヒト／ヒト・ハイブリド−マ培養用無血清培地 |
| JPH0672105B2 (ja) * | 1985-10-02 | 1994-09-14 | 持田製薬株式会社 | 血栓溶解剤及びその製法 |
| DE3537708A1 (de) * | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
| WO1988010307A1 (en) * | 1987-06-24 | 1988-12-29 | Genentech, Inc. | Balanced constitutive inducible transcription system |
| FR2636644B1 (fr) * | 1988-08-24 | 1990-12-28 | Sanofi Sa | Sequence d'adn participant a la regulation de l'expression d'une sequence d'adn codant pour un precurseur d'un polypeptide, vecteurs d'expression et procede de production periplasmique du polypeptide |
| NZ243084A (en) * | 1991-06-12 | 1995-08-28 | Regeneron Pharma | Production and recovery of recombinant neurotrophins, genes for a modified lamb signal sequence, fusion genes and plasmids |
-
1995
- 1995-01-31 FR FR9501083A patent/FR2729972B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-01-25 SK SK106-96A patent/SK281946B6/sk unknown
- 1996-01-26 MX MX9600380A patent/MX9600380A/es unknown
- 1996-01-26 EA EA199600001A patent/EA000017B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-01-29 DE DE69629965T patent/DE69629965D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-29 AT AT96400201T patent/ATE250132T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-29 UA UA96010341A patent/UA27997C2/uk unknown
- 1996-01-29 EP EP96400201A patent/EP0725140B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 AR ARP960101196A patent/AR000831A1/es unknown
- 1996-01-30 HU HU9600209A patent/HU222598B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 BR BR9600270A patent/BR9600270A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-30 KR KR1019960002120A patent/KR100401028B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 PL PL96312543A patent/PL183598B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 CA CA002168382A patent/CA2168382C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-30 FI FI960427A patent/FI960427A/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 NO NO960396A patent/NO316519B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 IL IL11697396A patent/IL116973A0/xx unknown
- 1996-01-31 US US08/594,469 patent/US5700665A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 JP JP8015273A patent/JP3005464B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 ZA ZA96734A patent/ZA96734B/xx unknown
- 1996-01-31 NZ NZ280919A patent/NZ280919A/en unknown
- 1996-01-31 AU AU42244/96A patent/AU700509B2/en not_active Ceased
- 1996-01-31 TW TW085101206A patent/TW403760B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 CN CN96105578A patent/CN1132842C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 CZ CZ1996290A patent/CZ286509B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-08-06 US US08/906,957 patent/US5856142A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI702289B (zh) | 用於胜肽生產之融合夥伴 | |
| EP0786009B1 (en) | Process for bacterial production of heterologous polypeptides with disulphide bonds | |
| JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ | |
| US20030199676A1 (en) | Universal procedure for refolding recombinant proteins | |
| US6333175B1 (en) | Yield when disulfide-bonded proteins are secreted | |
| WO1998018946A1 (en) | Process for bacterial production of polypeptides | |
| EP1309604B1 (en) | Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides | |
| EA000017B1 (ru) | Агент экстракции периплазматического рекомбинантного белка, способ получения периплазматического рекомбинантного белка и способ культивирования прокариотического микроорганизма | |
| JP2016512266A (ja) | たんぱく質精製の新規な方法 | |
| AU2001284914A1 (en) | Phage-dependent Superproduction of Biologically Active Protein and Peptides | |
| KR20020026366A (ko) | 단백질의 생산 | |
| JP3550409B2 (ja) | ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼ | |
| JP2657383B2 (ja) | 新規な加水分解酵素とその製造方法 | |
| US20060127973A1 (en) | Dna sequences of major secreted proteins from the ciliate tetrahymena and use thereof | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| KR20010109348A (ko) | 췌장의 프로카복시-펩티다제 ｂ, 이의 동질 효소 및뮤테인의 제조 방법, 및 이들의 용도 | |
| RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
| WO2009054754A1 (fr) | Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine | |
| KR100890187B1 (ko) | Ｔｓｆ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| JP3489865B2 (ja) | ヒト成長ホルモンの製造法 | |
| Jiang et al. | The expression of proUK in Escherichia coli: the vgb promoter replaces IPTG and coexpression of argU compensates for rare codons in a hypoxic induction model | |
| EP3221449B1 (en) | Process for refolding recombinant chymotrypsin | |
| CN117659212A (zh) | 一种表皮细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法与应用 | |
| CA3168571A1 (en) | Production of soluble recombinant protein | |
| KR20020008530A (ko) | 훼리틴 유전자 발현을 위한 형질전환된 재조합 효모균주및 이를 이용한 재조합 훼리틴 생산방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ KZ KG TJ TM |
|
| PD4A | Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |