KR20010056451A - 아르기닌이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물 - Google Patents

아르기닌이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물 Download PDF

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KR20010056451A
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Abstract

본 발명은 고농도로 재조합 단백질을 생산할 수 있는 동물세포 배양용 배지조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아르기닌을 160 ~ 4200 ㎎/ℓ의 농도로 기존의 배지에 비해 2배 내지 50배 이상 고농도로 첨가함으로써 세포의 초기 성장저해를 억제하고, 세포의 생존율 및 생존기간을 증가시켜 고농도로 재조합 단백질을 생산할 수 있는 동물세포 배양용 배지에 관한 것이다. 특히 본 발명의 아르기닌이 강화된 배지조성물은 동물 세포로부터 고농도로 인간 트롬보포이에틴(Thrombopoietin), 인간 에리트로포이에틴(Erythropoietin), 혈액 응고제(tPA), 항체 등을 생산하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아르기닌이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물{Arginine-enriched medium used for mass-producing recombinant protein in animal cell culture}
본 발명은 고농도로 재조합 단백질을 생산할 수 있는 동물세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아르기닌을 160 ~ 4200 ㎎/ℓ의 고농도로 포함 함으로써 최대 생존 세포수를 늘리고, 세포 성장 저해를 완화하여 고농도로 재조합 단백질을 생산할 수 있는 배지 조성물에 관한 것이다.
1980년대 중반부터 생물공학분야에서 의약품 개발의 일환으로 동물세포의 대량배양을 통한 단일세포군 항체나 치료용 당단백질을 생산하고자 하는 연구와 산업화가 활발히 진행되어 왔다. 그 결과 현재 약 50여개 종류의 단일세포군 항체와 EPO 및 혈액응고제 등이 산업화되어 시판중에 있는데, 미국의 경우 동물세포 유래 생물의약품의 연간 매출액은 1993년 37억불에서 2003년에는 145억불로 매년 15 - 20% 이상의 높은 증가 추세를 보일 것으로 예상되고 있다.
특히, 당단백질의 경우 인체에 투여된 후 분자구조의 안정성과 높은 활성을유지하기 위해서는 당쇄화(Glycosylation)와 번역후 수식과정(post-translational modification)이 매우 중요한데, 미생물에서는 이러한 과정이 불완전하거나 거의 이루어지지 않기 때문에 활성형의 당단백질 생산을 위해서는 반드시 동물세포를 이용하여야 한다.
최근 의학적으로 사용되는 대표적인 당단백질로는 TPO(Thrombopoietin, 이하 'TPO'라 약칭함), EPO(Erythropoietin, 이하 'EPO'라 약칭함) 등이 있다. TPO는 간 또는 신장에서 생산되는 당단백질로 혈소판 수를 조절하는 기능이 있어 혈소판 감소증의 치료에 이용되고 있다. 항암치료 또는 골수이식의 경우와 기타 여러 원인에 의하여 유발되는 혈소판 감소증(thrombocytopenia)은 골수세포내에 존재하는 혈소판 전구세포인 거핵구 콜로니 형성 전구세포들이 항암치료 또는 골수이식의 과정에서 파괴되고 이로 인하여 혈소판의 수가 부족하게 됨으로써 유발되는 질병으로서, 가벼운 외적 자극에 의하여 쉽게 출혈이 일어나며, 혈소판 감소증이 심한 경우 외부적인 자극 없이도 출혈이 일어나게 된다. 또한 출혈이 일어난 경우 지혈이 잘 안되기 때문에 심할 경우에는 사망에까지 이르는 심각한 문제가 되고 있다.
현재까지 이러한 혈소판 감소증을 치료하는 방법으로는 유일하게 혈소판을 수혈하는 방법이 사용되고 있다. 그러나 이는 혈소판 수혈에 필요한 혈액의 제공자가 부족하다는 문제점 외에 에이즈 바이러스 또는 간염 바이러스 등과 같은 혈액유래 감염원에 의한 감염 및 외래 혈소판의 수혈에 따른 면역반응의 유발 등과 같은 부작용이 있다.
혈소판은 거핵구 전구세포로부터 만들어지는 혈액성분으로서, 출혈을 억제하는 기능을 나타내고, 그 수는 간 또는 신장에서 생성되고 분비되는 당단백질인 TPO에 의하여 조절되는데, TPO는 골수세포내에 존재하는 혈소판의 생산세포인 거핵구 전구세포의 증식과 분화를 촉진시켜 혈소판의 생성을 유도하여 궁극적으로 혈소판 수를 증가시킨다(Lok 등, Nature,369: 565-568 (1994); De savage 등, Nature,369: 533-568 (1994)).
TPO 유전자 중 인간 트롬보포이에틴(hTPO)의 유전자가 1994년에 최초로 cDNA 형태로 클로닝된 이후(Lok 등,Nature,369: 565-568 (1994); De savage 등,Nature, 369: 533-568 (1994); Miyazaki 등,Experimental hematol., 22: 838 (1994); 국제특허공개 제95/18858호) hTPO가 혈소판 수를 조절하는 기능을 갖고 있음을 이용하여 혈소판 감소증을 치료하기 위한 임상실험이 진행되고 있으며(Murray 등,Exp. Hematol., 26: 207-216 (1998)), 이에 따라 TPO의 대량생산에 대한 요구가 증가되고 있다.
동물세포 가운데 가장 널리 이용되는 CHO세포는 안정적인 유전자 이입과 높은 생산성, 그리고 무혈청 배지로의 빠른 적응성 등의 이점을 지니고 있어 숙주세포로 많이 사용되어 왔다. 특히 CHO-DUKX 세포는 dhfr 변이체로서 dhfr 유전자를 선별인자(selection marker)로 사용가능하고 메소트렉세이트(methotrexate, 이하 'MTX'라 약칭함)에 의한 증폭과정을 통하여 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 장점을 갖고 있어 여러가지 치료단백질의 발현, 생산에 이용되고 있다.
동물세포는 세포벽이 없이 원형질 막으로만 되어 있어 외부의 기계적인 힘에 매우 약할 뿐만 아니라, 대사중 탄소 및 에너지원으로부터 전환되어 생긴 많은 양의 젖산(lactic acid)과 에너지원으로 공급된 글루타민으로부터 발생된 암모니아(NH3) 등에 의해 세포의 성장과 대사활동에 심한 저해를 받는다. 일반적으로 유전자가 이입되어 외래 단백질을 생산하는 세포는 그렇지 않은 세포에 비해 더 많은 유전자 복제, 전사, 및 세포내 단백질 합성이 요구되므로 성장이 더욱 느려지는데(Bentley 등,Biotech. Bioeng.35:668, 1990), 특히 MTX에 의해 외래 단백질을 발현하는 유전자가 증폭되어 생산성이 높아질수록 이같은 성장속도의 감소는 더 커지게 되고(Gu 등,Cytotech.18:159, 1996), 심한 경우에는 세포성장이 저해되어 배양 초기에 세포사멸이 일어나게 된다(Singh 등,Biotech. Bioeng.44:720, 1994). 결과적으로 생산되는 단백질의 농도가 매우 낮은 수준에 머무를 수 밖에 없게 되는데 실제로 각각 TPO, EPO 항체를 생산하는 CHO 세포주에 대하여 회분배양을 실시한 결과 이같은 성장저해가 일어남을 확인할 수 있었다.
상기한 세포 성장 저해는 낮은 생산성의 원인이 되므로 이를 막기 위한 최적의 배양조건 확립이 요구되고, 그 중 배지의 최적화는 생산물의 농도를 향상시키는데 가장 중요하다. 현재까지는 배지의 삼투압을 높이거나 배지에 부틸산 나트륨(sodium butyrate)을 첨가하는 방법이 많이 사용되어 왔는데, 이 경우 발현율은 증가하지만 세포의 생존율은 크게 줄어드는 단점이 있었다.
동물 세포는 배양시 필요로 하는 영양소 구성이 매우 복잡하여 배지 중에 아미노산, 비타민 등의 첨가가 필수적이며, 성장조절인자가 많이 들어있는 혈청이 요구된다. 이 같은 배지내 성분 연구는 주로 무혈청 배지 제조와 관련하여 이루어져 왔는데, 무혈청 배양시 세포의 생존율을 높이기 위해서 다양한 배지첨가물이 개발되어 왔을 뿐만 아니라 대사공학적 측면으로의 접근도 시도되어 왔다. 특히 최근엔 하이브리도마(Hybridoma)의 세포예정사와 관련하여 아미노산의 역할에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데(Franek and Sramkova,Cytotech.23:231, 1997 ; Mercille and Massie,Biotech. and Bioeng.44:1140, 1994), 배지에 여러 종류의 아미노산 복합체나 아미노산 유사체를 첨가함으로써 세포사멸을 막으려는 노력이 행해져 오고 있다. 구체적으로는 CHO 세포에 글루타민을 처리한 경우(Sanfeliu 등,Biotechnol. Bioeng.64:46, 1999)와 하이브리도마에 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘(Franek and Sramkova,Cytotechnol.23:23, 1997), 글루타민(Franek,Biotechnol. Bioeng.45:86, 1995), 메티오닌(Perreault 등,Cytotechnol.13:99, 1994), 암세포에 시스테인(Mercille 등,Biotechnol. Bioeng.44:1140, 1994)을 첨가한 경우가 알려져 있으나 아르기닌을 강화한 배지를 사용함으로써 재조합 당단백질을 고농도로 생산할 수 있음은 전혀 보고된 바가 없다.
TPO 생산공정에서도 상기한 초기 세포성장저해는 생산성 증가에 심각한 문제점으로 작용한다. 또한 이는 생산 공정뿐 아니라 세포주 제조 과정에서도 매우 큰 어려움을 가져다 주는데, 특히 유전자 증폭을 위해서 더 높은 농도의 MTX를 처리하는 동안 세포의 사멸이 빈번히 일어나 배양에 문제점이 야기되었다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명자들은 동물 세포를 통한 재조합 단백질의 생산시 고농도로 재조합 단백질을 생산할 수 있는 배지 조성물을 얻기 위해 연구한 결과 배지 중에 아르기닌을 160 ~ 4200 ㎎/ℓ 농도로 첨가하면 세포의 생존기간 및 생존율이 높아져 결과적으로 재조합 단백질을 고농도로 얻을 수 있음을 알아냄으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질의 생산시에 세포의 초기 성장저해를 막고, 세포 생존율을 높임으로써 고농도로 재조합 단백질을 생산 할 수 있는 배지 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 아르기닌이 강화된 배지 조성물에서의 아르기닌 농도에 따른 세포 성장 상태를 나타낸 것이고,
-●- 84 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유된 기본 IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium).
-■- 168 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM.
-▼- 420 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM.
도 2는 아르기닌이 강화된 배지 조성물에서의 아르기닌 농도에 따른 TPO의 생산 정도를 나타낸 것이고,
-●- 84 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유되어 있는 기본 IMDM.
-■- 168 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM.
-▼- 420 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM.
도 3은 아르기닌이 강화된 배지 조성물에서 아르기닌의 농도에 따른 세포의생존율을 나타낸 것이고,
도 4는 아르기닌 이외의 아미노산이 기본 배지 대비 3×의 농도로 강화된 배지 조성물에서 세포의 생존율을 상대적인 MTT 측정 값으로 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 아르기닌 성분이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '아르기닌 성분이 강화된 배지'는 기본 배지에 아르기닌이 높은 농도로 첨가된 배지를 의미한다.
상기에서 '기본 배지'는 동물 세포의 배양시 사용되는 공지된 배지를 의미하는데 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium), MEM(Minimum essential mediumeagle), RPMI 1640 배지, 배지 199, DMEM/F12, IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium) 등을 포함하는 그룹 중에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 재조합 단백질을 생산하기 위한 공지의 동물 세포 배양용 배지 또는 이들의 변형된 배지도 모두 본 발명에서 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 재조합 단백질의 생산을 위한 동물 세포의 배양시 초기의 세포성장 억제를 막고, 최대 생존 세포수를 높임으로써 TPO 재조합 단백질의 생산성을 높이기 위해 높은 농도의 아르기닌이 함유되도록 한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 배지 조성물은 기본 배지에 아르기닌 농축액을 160 ~ 4200 ㎎/ℓ의 농도로 첨가하여 제조된다. 상기에서 기본 배지의 아르기닌 함유량은 70 ~ 200 ㎎/ℓ이다.
본 발명자들이 동물세포에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 기본 배양 배지에 여러 종류의 아미노산과 기타 영양분 각각을 첨가하여 조사한 결과에 따르면, 초기의 세포 성장 저해를 방지하는데 아르기닌이 다른 성분과는 비교할 수 없을 정도로 탁월한 효과를 나타내었다. 이는 동물 세포에서 재조합 단백질 생산시 나타나는 세포예정사가 높은 농도의 아르기닌에 의해 저해되었거나, 또는 재조합 단백질 생산으로 인해 늘어난 세포내 아르기닌의 소모량이 첨가된 아르기닌으로 인해 세포에 충분히 공급되었기 때문인 것으로 예상된다. 더욱이 아르기닌은 안정성 및 배지에 대한 용해도가 높고, 세포에 독성을 나타내지 않으며, 가격도 비교적 낮아 아르기닌이 강화된 배지 조성물은 배양공정에 있어 매우 효율적이라 할 수 있다.
본 발명의 배지조성물을 이용하여 생산할 수 있는 재조합 단백질로는 CSF(Colony-stimulating factor), 혈액 인자(blood factor), 성장호르몬, 인터페론 (interferon), 효소단백질, 항체 등이 있으며, 특히 당단백질인 TPO, EPO, 혈액 응고제 등이 바람직하고 이중에서도 TPO의 수율을 현저히 높일 수 있다. 또한 본 발명의 배지 조성물은 상기 재조합 단백질을 생산하기 위해 통상적으로 널리 사용되는 동물세포의 배양에 이용되는데 바람직하게는 CHO, BHK-21(Baby Hamster Kidney) 등의 사람, 원숭이, 햄스터 유래의 신장세포, HeLa, NIH 3T3, 랫트 배섬유아세포(embryo fibroblasts) 등의 세포를 이용할 수 있고, 보다 바람직하게는 CHO dhfr 변이체의 배양에 이용된다. 본 발명에서는 바람직한 실시예의 하나로 CHO DUKX B11 세포를 이용하여 TPO를 생산하였다.
본 발명의 배지 조성물은 아르기닌 농축액을 160 ~ 4200 ㎎/ℓ의 농도로 DMEM, MEM 등 동물세포의 배양에 일반적으로 사용되는 배지 또는 IMDM 등의 변형된 배지에 첨가하여 제조할 수 있다. 아르기닌 농축액을 첨가하여 배지에 적절한 농도의 아르기닌이 함유될 수 있도록 하는데, 아르기닌 농도가 2배에서 50배에 이르기까지는 배지내에 아르기닌이 많이 함유될수록 생존세포수도 비례적으로 증가하지만 50배를 초과할 경우에는 포화농도가 되어 생존세포수는 더 이상 크게 증가하지 않는다.
그러나, 50배를 초과하여 첨가되었을 경우에도 세포독성은 발생하지 않으며,아르기닌 이온화에 의한 삼투압 증가도 미미하고, 아르기닌이 첨가된 경우와 그렇지 않은 경우를 비교한 결과, 세포의 전체 아미노산이나 포도당(glucose) 및 젖산(lactate)의 소모/배출 양상은 큰 차이가 없음을 확인하였다. 즉 주목할 만한 세포내 생리의 변화는 없다. 결과적으로 아르기닌 효과의 임계농도의 측면에서 2배 내지 50배를 첨가하는 것이 바람직하며, 아르기닌의 첨가량과 효과의 상관관계를 고려하였을때 기본 배지보다 10배 내지 20배 더 많은 아르기닌이 함유되는 것이 더욱 바람직하다.
아르기닌 농축액은 증류수에 16.8 ~ 84 g/ℓ의 고농도 아르기닌이 녹아 있는 용액이며, 이렇게 만들어진 농축액은 -20℃ 이하에서 장기 보관이 가능하다.
세포의 성장저해를 막기 위해서는 배양 중에 배양배지를 본 발명의 배지 조성물로 교환하거나, 세포가 사멸하기 전에 적절한 양의 아르기닌 농축액을 배양배지에 유가할 수 있는데, 배양초기부터 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 우선 배지내 아르기닌 농도에 따른 세포의 성장 상태를 확인하였는데 84 ~ 420 mg/ℓ 농도의 아르기닌을 함유하고 있는 IMDM에 배양한 경우 배지내 함유된 아르기닌의 농도에 비례하여 세포의 성장률도 증가함을 확인할 수 있었다. 배지내 아르기닌의 농도에 따라 생산되는 TPO의 양을 확인해 본 결과 84 ~ 420 mg/ℓ 농도의 아르기닌이 함유된 배지에서 배양하여 얻은 TPO의 생산량은 배지내 아르기닌의 농도에 비례하여 기본 배지 대비 최대 약 4.3 배까지 증가함을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
배지내 아르기닌 농도에 따른 생존 세포수를 측정하기 위해서 기본 배지의 2 ~ 100배의 농도 범위로 아르기닌을 첨가하였을 경우 아르기닌 농도가 기본 배지의 50배인 경우까지는 아르기닌 농도에 비례하여 생존세포수도 증가하다가 50배 이상에서는 더 이상 증가하지 않음을 확인하였다. 이는 아르기닌의 농도가 기본 농도 대비 50배 까지는 농도에 비례하여 세포의 생존을 유지하는 효과를 보이다가 그 이상의 농도에서는 포화되어 더 이상 세포의 생존에 필요한 효과를 나타내지 않음을 보여주는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 아르기닌 성분이 강화된 배지 조성물에서의 동물세포의 성장
CHO dhfr 돌연변이체 세포(ATCC CRL 9096)를 pDCT(대한민국 특허 99-25143 )로 형질전환시켜 TPO 생성 능력을 가진 형질전환체 WF21을 제조하고, 이를 TPO 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포주로서 사용하였다. 상기한 WF21 세포주를 6-웰 플레이트(Nunc, 덴마크)상에 3 ㎖의 배지에 웰당 2×105세포/웰의 농도로 접종하였다. 배지는 각각 84 mg/ℓ의 아르기닌(Sigma, 미국)을 함유하고 있는 기본 IMDM (GibcoBRL, 미국), 기본 배지의 2배인 168 mg/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM, 기본배지의 5배인 420 mg/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM를 사용하였고, 각각의 배지에는 10% dFBS (dialyzed fetal bovine serum)와 20 nM MTX가 첨가되었다.
접종된 세포는 37℃, 5% CO2의동물세포 배양용 인큐베이터(Forma Scientific, 미국)에서 5일간에 걸쳐 회분식으로 배양하였으며, 세포수는 세포계수기(hemocytometer ; Hausser Scientific, 미국)를 이용하여 트립판 블루 염색법(Trypan blue dye exclusion method ; Freshney, 1994, Culture of animal cells, pp.268-270)으로 측정하였다.
그 결과 84 mg/ℓ의 아르기닌을 함유하고 있는 기본 IMDM에 배양한 경우, 배양 시작후 2일째에 최고 세포 농도인 3.1×105세포/웰에 도달한 후 곧바로 세포수가 감소하는 반면, 168 mg/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM의 경우 3일째에 최고 세포 농도인 5.9×105세포/웰에 도달한 후 세포수가 감소하였고, 420 mg/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM의 경우 5일째에 이르러도 세포수의 감소없이 1.5×106세포/웰의 높은 농도를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
<비교예 1> 기본 배지조성물에서의 동물세포의 성장
84 mg/ℓ의 아르기닌을 함유하고 있는 기본 IMDM을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 WF21 세포주를 배양한 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 세포수를 측정하였다(도 1 참조).
이상의 비교예 1로부터 동물세포 배양시에 아르기닌이 강화된 배지를 사용할 경우 세포의 생존기간이 연장되고, 최대 세포농도가 증가됨을 확인하였다.
<실시예 2> 아르기닌이 강화된 배지 조성물에서의 재조합 단백질의 생산
각각 기본 IMDM, 168 mg/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM, 그리고 420 mg/ℓ의 아르기닌이 함유된 IMDM에서 WF21 세포주를 실시예 1과 동일한 방법으로 회분배양한 다음, WF21 세포주가 생산한 TPO의 농도를 샌드위치 ELISA(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 분석하였다. 코팅 항원으로는 사람 TPO(hTPO)에 대한 마우스 모노크로날 항체(R&D System, 미국), 2차 항체(Secondary antibody)로는 바이오틴(Biotin)이 부착된 항hTPO 모노클로날 항체를 사용하였고, 스트렙타비딘-퍼록시다아제(Streptavidin-peroxidase ; Sigma, 미국)와 상기 효소의 기질인 TMB(3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidine Base ; GibcoBRL , 미국)를 이용하여 발색시킨 후 1 M 황산용액으로 반응을 정지시켰다. 표준(Standard)으로는 생산된 TPO를 TPO ELISA Kit(QuantikineTM; R&D System, 미국)를 이용하여 정량한 후 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 ng/㎖의 농도가 되도록 희석하여 사용하였다. 마이크로플레이트 분석기(Microplate Reader 모델 550 ; BioRad, USA)를 이용하여 450 nm에서 발색 정도를 측정하였다. 결과는 하기 표 1에 요약하여 나타내었다.
아르기닌 농도에 따른 TPO 의 변화
배지내 아르기닌 농도(㎎/ℓ) 최고 TPO 농도 (ng/㎖)
84 226.28
168 425.40
420 972.84
상기 표 1에 따르면 168 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유된 배지에서 배양하여 얻은 TPO의 농도는 기본배지에서 배양한 경우에 비해 약 2.1배, 420 ㎎/ℓ의 아르기닌이 함유된 배지에서 배양하여 얻은 TPO의 농도는 기본 배지에 비해 약 4.3배 높음을 확인할 수 있었다 (도 2 참조).
<비교예 2> 기본 배지조성물에서의 재조합 단백질의 생산
84 mg/ℓ의 아르기닌을 함유하고 있는 기본 IMDM을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 조건으로 세포를 배양하고, 동일한 방법으로 ELISA를 시행하였다.
표 1에서 보는 바와 같이 동물 세포로부터 재조합 단백질을 생산할 때, 168 ㎎/ℓ에서 420 ㎎/ℓ까지 아르기닌이 강화된 배지 조성물을 출발 배지로 사용하는 경우 공지의 84 mg/ℓ의 아르기닌이 포함된 기본 배지를 사용한 경우보다 생산량을 4.3 배까지 증가시킴을 확인하였다.
<실시예 3> 아르기닌 농도와 생존세포수와의 관계
6-웰 플레이트에 3 ㎖의 IMDM 기본배지를 채운 후 아르기닌이 기본 배지 대비 각각 1배, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 함유되도록 아르기닌 농축액을 넣어주고, 각각의 배지에 2x105세포/웰의 농도로 세포를 접종한 후 배양을 시작하여 9일째 이르렀을 때 실시예 1과 동일한 방법으로 생존 세포수를 측정하였다(도 3 참조). 결과는 하기 표 2에 요약하여 나타내었다.
그 결과 아르기닌 농도가 기본 배지 대비 50 배 일때까지는 아르기닌 농도에 비례하여 생존세포수도 증가하다가 그 이상에서는 생존세포수가 더 이상 증가하지 않음을 확인하였다.
아르기닌 농도에 따른 생존 세포수의 변화
배지내 아르기닌 농도 (㎎/ℓ) 생존 세포수(세포/웰)
84 (1×) 2.1 × 105
168 (2×) 4.2 × 105
420 (5×) 1.65 × 106
840 (10×) 2.47 × 106
1680 (20×) 3.95 × 106
4200 (50×) 4.35 × 106
8400 (100×) 4.38 × 106
<비교예 3> 배지내 강화된 물질의 변화에 따른 최대 세포 농도의 변화.
배지내 강화시킨 물질을 각각 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판,티로산, 발린으로 사용하여 WF21 세포를 실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 다음, 상대적인 MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide ; Thiazolyl blue) 값을 측정함으로써 최대 생존 세포수를 아르기닌이 강화된 경우와 비교 분석하였다(도 4 참조). MTT 값은 상기한 아미노산들을 기본 배지 대비 3×의 농도로 각각 IMDM에 첨가하고, 5일 후에 MTT를 5 ㎎/㎖의 농도로 가하여 같은 조건에서 4시간 더 배양한 후 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader 모델 550 ; BioRad, USA)로 540 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 생존 세포수를 분석하였다. 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
배지내 강화된 물질에 따른 최대 세포 농도의 변화
강화 물질 처리 농도(㎎/ℓ) 상대적 MTT 값
무처리구 - 1
아르기닌 168 4.18
알라닌 50 1.05
아스파라긴 50 0.93
글루타민 1168 0.89
글리신 60 1.35
히스티딘 84 1.09
이소루신 210 1.18
리신 292 1.06
메티오닌 60 1.05
페닐알라닌 132 1.11
프롤린 80 1.05
세린 84 1.23
트레오닌 190 1.14
트립토판 32 1.15
티로신 208 1.04
발린 188 1.33
상기 표 3의 결과에서와 같이 아르기닌과 다른 아미노산을 첨가했을 경우의
MTT 값을 비교하여 보면 아르기닌이 월등히 높은 MTT 값을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 아르기닌의 첨가시에 생존 세포수가 월등히 증가할 뿐 아니라 세포로부터 고농도의 재조합 단백질을 얻을 수 있음을 의미하는 것이다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 동물세포를 통한 재조합 단백질의 생산시에 아르기닌 성분이 강화된 배지조성물을 사용함으로써 동물 세포의 초기 성장 저해를 막고, 세포의 생존율을 높여 세포의 최대 농도를 증가시킴으로써 종래의 기본배지를 사용할 경우보다 월등히 높은 고농도의 재조합 단백질을 생산하는데 효과적이다.

Claims (6)

  1. 기본 배지에 아르기닌을 160 ~ 4200 ㎎/ℓ의 고농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 재조합 단백질은 트롬보포이에틴(TPO), 에리트로포이에틴 (EPO), 혈액응고제(tPA), 항체를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 배지 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 기본 배지는 DMEM, MEM, RPMI 1640 배지, 배지 199, DMEM/F12, IMDM을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 배지 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 동물세포는 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, NIH 3T3, 랫트 배섬유아 세포를 포함한 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, CHO 세포는 CHO dhfr 변이체인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 배지 조성물은 포도당 1 ~ 4.5 g/ℓ, 아르기닌 0.07 ~ 0.2 g/ℓ, 글루타민 0.1 ~ 0.6 g/ℓ, 기타 아미노산 0.001 ~ 0.15 g/ℓ의 성분을 갖는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
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