KR20050070512A - 재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 무혈청 배지 및동물세포 배양방법 - Google Patents

재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 무혈청 배지 및동물세포 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 무혈청 배지 및 동물세포 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 일반적으로 사용되고 있는 세포 성장용 무혈청 배지에 N-아세틸 시스테인(NAC) 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 첨가되어 재조합 단백질의 분비속도가 증가된 무혈청 배지 및 세포 성장용 무혈청 배지에서 세포를 일정농도까지 성장시킨 다음, NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 포함된 배지에서 세포 성장을 완전히 시킴으로써 세포의 사멸이 완화되고 재조합 단백질의 분비속도를 증가시키는 동물세포의 배양방법에 관한 것이다.

Description

재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 무혈청 배지 및 동물세포 배양방법{ Cell culture method and serum free meia for improved production of recombinant protein}
본 발명은 재조합 단백질의 생산성을 증가시키는 무혈청 배지 및 동물세포 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 일반적으로 사용되고 있는 세포 성장용 무혈청 배지에 N-아세틸 시스테인(NAC) 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 첨가되어 재조합 단백질의 분비속도가 증가된 무혈청 배지 및 세포 성장용 무혈청 배지에서 세포를 일정 농도까지 성장시킨 다음, NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 포함된 배지에서 세포 성장을 완전히 시킴으로써 세포의 사멸이 완화되고 재조합 단백질의 분비속도를 증가시키는 동물세포의 배양방법에 관한 것이다.
의약용으로 사용되는 재조합 단백질들은 대부분 당단백질로서 재조합 단백질을 구성하는 아미노산의 특정부위에 연결된 당쇄가 단백질의 활성(activity)과 안정성(stability)에 중요한 역할을 한다[Fukuda, M.N. et. al., Blood, 73, 84-89(1989)]. 동물세포에서는 재조합 단백질이 세포 외로 분비되어 정확한 당화가 이루어져 정제공정을 쉽게 하는 장점이 있으며, 따라서 완전한 당화(fully glycosylation)가 이루어져 높은 활성과 안정성을 갖는 재조합 단백질을 얻기 위하여 동물세포와 같은 복잡한 진핵세포가 흔히 사용되고 있다.
그러나, 동물세포와 같은 진핵세포를 숙주세포로 사용하는 경우에는 재조합 대장균이나 재조합 효모를 숙주세포로 사용할 때에 비하여 재조합 단백질의 발현양이 적은 단점이 있다.
이러한 단점을 극복하기 위하여 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(Dihydrofolate Reductase, dhfr), 글루타민 신테테이즈(Glutamine Synthetase, GS), 아데닌 디아미네이즈(Adenine deaminase)와 같은 선택표지(selection marker) 유전자를 이용한 유전자 증폭방법이 사용되고 있다. 유전자 증폭은 세포 안의 유전자 수(copy number)를 크게 늘려 재조합 단백질의 발현 수준을 증가시킨다. 그러나, 실제로 재조합 단백질이 세포외부로 분비되기 위하여 단백질이 합성된 후에 전사 후 수정(posttranslational modification)과정을 거쳐 단백질의 접힘(folding)이 정확하게 이루어져야 한다.
따라서, 많은 양의 재조합 단백질을 얻기 위하여 재조합 단백질이 세포내에서 대량으로 발현되는 것도 중요하지만 발현된 재조합 단백질을 세포외부로 대량 분비시킬 수 있어야 한다.
현재까지 동물세포 배양 시 단백질의 발현 및 분비를 증가시키는데 가장 많이 사용된 것은 소디움 부티레이트(Sodium butyrate)이나, 소디움 부티레이트의 첨가로 인하여 세포의 성장이 멈추고, 세포의 사멸이 유도되는 현상이 나타나는 문제점이 있다[Palermo. D.P. et. al, J.of Biotechnology, 19 35-48(1991), Chotigeat W., et. al., Cytotechnology, 15, 217-221(1994)].
이에, 본 발명자들은 세포의 사멸을 최대한 억제하면서 재조합 단백질을 배양배지로 분비시킬 수 있는 배양방법 개발을 위하여 노력한 결과, NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트가 첨가된 생산용 배지의 사용시 재조합 단백질의 분비속도를 크게 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 동물세포 배양을 통한 재조합 단백질 제조시 단백질의 분비속도를 증가시키는 무혈청 배지로서, 기존의 무혈청 배지에 NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트를 첨가시킨 배지를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 세포를 일정농도로 성장시킨 다음, NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트가 포함된 배지에서 세포를 완전히 성장시켜 재조합 단백질의 분비속도가 향상된 동물세포의 배양방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 동물세포 배양용 무혈청배지에 있어서, 상기 배지에 N-아세틸 시스테인 단독, 또는 N-아세틸 시스테인과 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 첨가된 무혈청배지에 그 특징이 있다.
또한, 재조합 단백질 생산용 동물세포의 배양방법에 있어서, 무혈청 배지에서 동물세포를 1.5 ×106 ∼ 1 ×107 cells/ml로 성장시킨 다음, N-아세틸 시스테인 단독, 또는 N-아세틸 시스테인과 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 포함된 배지에서 세포를 완전히 성장시켜 재조합 단백질 생산성이 향상된 동물세포의 배양방법에 또 다른 특징이 있다.
이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 일반적으로 사용되고 있는 세포 성장용 무혈청 배지에 N-아세틸 시스테인(NAC) 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 첨가되어 재조합 단백질의 분비속도가 증가된 무혈청 배지 및 세포 성장용 무혈청 배지에서 세포를 1.5 ×106 ∼ 1 ×107 cells/ml로 성장시킨 다음, NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 포함된 배지에서 세포를 완전히 성장시킴으로써 세포의 사멸이 완화되고 재조합 단백질의 분비속도를 증가시키는 동물세포의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 무혈청 배지는 일반적으로 사용되는 무혈청 배지라면 어느 것이라도 상관없으며, 예를 들어 무혈청 배지는 탄수화물, 비타민류, 아미노산류, 무기염류, 미량원소 및 기타 성분류로 구성되며, 특히 시그마(sigma)사의 CHO PFM 또는 하이클론(Hyclone)사의 SFM4CHO 배지 등이 바람직하다. 또한, 본 발명자들에 의해 개량된 무혈청배지(탄수화물, 비타민류, 아미노산류, 무기염류, 미량원소 및 기타 성분류로 구성된 무혈청배지에 인슐린 유사인자, 섬유아세포 성장인자, 상피세포 성장인자, 단백질 가수분해산물, 이온 킬레이터, 계면활성제, 에탄올아민 및 셀레늄이 첨가된 배지; CHO-SFM-SGM1 배지)로 본 발명을 수행할 경우에 더욱 바람직하다.
본 발명에 사용되는 동물세포로는 CHO 세포를 포함하여 외래단백질 생산을 위하여 유전자 조작된 동물세포이면 어느 것이든지 가능하며, 재조합 단백질도 인터페론-베타에만 국한되지 않고 분비 단백질이면 어느 것이든지 사용될 수 있으나 당쇄를 가지고 분비되는 단백질이 사용되는 것은 더욱 바람직하다.
또한, NAC의 사용량은 0.1 ∼ 20 mM이 바람직한데, 0.1 mM 미만일 경우에는 재조합 단백질의 분비 속도 향상 효과가 미비하며, 20 mM 초과할 경우에는 세포가 급격히 사멸하는 문제점이 있다. 또한, 소디움 부티레이트의 경우에는 0.1 ∼ 4 mM를 사용하는 것이 바람직하며, 0.1 mM 미만일 경우에는 재조합 단백질의 발현과 분비를 증가시키는 효과가 미비하며, 4 mM을 초과할 경우에는 세포의 성장이 멈추고 세포의 사멸이 유도되는 문제점이 있다.
특히, 상기 NAC 또는 소디움 부티레이트를 첨가시기가 중요한데, 이는 세포의 성장이 1.5 ×106 ∼ 1 ×107 cells/ml 정도 이루어 진 다음에 첨가시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 세포 성장이 1.5 ×106 ∼ 1 ×107 cells/ml 정도 이루어진 후에는 세포 사멸되거나 더 이상의 성장이 일어나지 않아 성장률이 거의 증가되지 않는 다. 하지만 본 발명에서처럼 NAC 또는 소디움 부티레이트를 첨가하고 계속 세포배양을 수행할 경우에는 세포 사멸이 완화되어 세포 성장을 극대화시킬 수 있어 재조합 단백질 분비속도가 증가되는 것이다.
한편, 본 발명에 따른 동물세포 배양시 무혈청 배지를 계속 사용하면서 상기 NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트를 첨가할 수도 있고, 혹은 배지 자체를 NAC 단독 또는 NAC와 소디움 부티레이트가 첨가된 배지로 교환하여 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명은 연속교반식 생물반응기(Continuous stirred tank reactor)의 회분식 배양(batch culture) 방법 및 연속식 배양(Perfusion Culture) 방법에도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 배지를 사용하여 세포배양하면 재조합 단백질의 분비속도가 NAC 또는 NAC와 소디움 부티레이트가 포함되지 않은 배지와 비교하여 월등히 향상됨을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 무혈청 배지에 NAC 단독 첨가시 단백질의 분비 및 세포 생존율 확인
세포배양 배지에 NAC 단독 첨가 시 재조합 단백질의 분비속도 변화와 세포 생존율의 변화 여부를 알아보기 위하여, 대조군으로 사용한 무혈청배지로는 CHO-SFM-SGM1 배지[탄수화물, 비타민류, 아미노산류, 무기염류, 미량원소 및 기타 성분류로 구성된 무혈청배지에 인슐린 유사인자, 섬유아세포 성장인자, 상피세포 성장인자, 단백질 가수분해산물, 이온 킬레이터, 계면활성제, 에탄올아민 및 셀레늄이 첨가된 배지, 특허출원 제 2003-99633호]이고, 이 배지에 NAC를 첨가하여 세포 배양을 수행하였다.
먼저, 인터페론 베타를 생산하도록 형질전환된 CHO세포를 α-MEM(Gibco사) 배지에 10%의 소태아 혈청(FBS, Hyclone사)이 포함된 배지를 사용하여 T-플라스크에 접종, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 약 2일간 배양하였다. 세포가 충분히 자라 약 90% 포화 상태(concluence)에 이르렀을 때 배양액을 제거하고 PBS용액으로 세척한 후, 0.1% 트립신 용액으로 플라스크에 부착된 세포를 떼어내어 CHO-SFM-SGM1 배지가 든 삼각 플라스크에 접종하여 무혈청 부유배양을 실시하였다. 이중에서 약 3 ×105 세포주/ml 접종하여 3일간 배양하였다. 3일간 배양 후 세포 농도가 1.5 ×106 세포주/ml 이상의 농도에 도달한 다음, 배양액에 NAC 10 mM를 첨가하여 2일간 추가 배양하면서 NAC가 첨가되지 않은 대조군과 단백질 분비량 및 생존율을 비교하였다[표 1].
실험군 단백질 분비 속도(㎍/106 세포주/day) 세포 생존율(%)
대조군 0.25 93
NAC 첨가군 0.51 95
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, NAC가 첨가된 배양액에서는 대조군에 비해 약 2배의 단백질 분비가 증가하였으며 세포 생존율도 개선되는 결과를 보였다.
비교예 1: 소디움 부티레이트 단독 첨가시 단백질의 분비 및 세포 생존율 확인
소디움 부티레이트는 단백질의 발현량을 증진시키는데 가장 광범위하게 사용되는 물질이다. 그러나, 이를 사용시 단백질의 분비량을 크게 증진시킬 수 있으나 세포의 사멸을 촉진하게 되어 지속적인 배양이 어려운 단점이 있었다.
상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양하여 무혈청 부유배양 3일차에 NAC 대신에 소디움 부티레이트 1 mM를 첨가하여 단백질의 농도와 세포 생존율을 소디움 부티레이트를 첨가하지 않은 대조군과 비교하였다[표 2].
실험군 단백질 분비 속도( ㎍/106 세포주/day) 세포 생존율(%)
대조군 0.25 93
소디움 부틸레이트 첨가군 0.78 75
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 소디움 부티레이트를 첨가하였을 경우 대조군 보다 단백질 분비 속도는 약 2.5배 증가하였으나 생존율은 75% 수준으로 크게 저하되었다.
실시예 2: 소디움 부티레이트와 NAC를 동시에 첨가하였을 때 단백질의 분비 및 세포 생존율 확인
상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양하여 무혈청 부유배양 3일차에 소디움 부티레이트 1 mM와 NAC 10 mM를 동시에 첨가하여 단백질의 농도와 세포 생존율을 첨가하지 않은 대조군과 비교하였다[표 3].
실험군 단백질 분비 속도(㎍/106 세포주/day) 세포 생존율(%)
대조군 0.25 93
소디움 부틸레이트 +NAC 첨가군 1.24 93.5
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 소디움 부티레이트와 NAC를 첨가하였을 경우 대조군 보다 단백질 분비 속도는 약 5배 증가하였고 생존율은 대조군과 유사하였다.
실시예 3: 배양기 이용한 회분식 배양에서의 소디움 부티레이트와 NAC를 동시 첨가 효과 확인
상기 실시예에서 확인한 결과를 토대로 배양기에서의 효과를 확인하기 위해 7.5리터 배양기(Celligen plus, NBS사)에서 회분식 배양을 실시하였다.
인터페론 베타를 생산하도록 형질전환된 CHO세포를 ??-MEM(Gibco사) 배지에 10%의 소태아 혈청(FBS, Hyclone사)이 포함된 배지를 사용하여 T-플라스크에 접종, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 약 2일간 배양하였다. 세포가 충분히 자라 약 90% 포화 상태(concluence)에 이르렀을 때 배양액을 제거하고 PBS용액으로 세척한 후 0.1% 트립신 용액으로 플라스크에 부착된 세포를 떼어내어 CHO-SFM-SGM1 배지 100 ml이 든 250 ml 스핀너 플라스크에 접종하여 무혈청 부유배양을 실시하였다. 이중에서 약 3 ×105 세포주/ml로 접종하여 3일간 배양한 후 약 1.2 ×106 세포주/ml 농도에서 CHO-SFM-SGM1 배지 400 ml이 든 1리터 스핀너 플라스크로 전량 이송 배양하였다. 1리터 플라스크 2개를 3일간 배양하여 약 1.2 ×106 세포주/ml 농도에서 배양액 전량을 CHO-SFM-SGM1 배지 2.5리터가 들어 있는 배양기에 전량 이송 배양기 가동을 실시하였다. 배양은 37 ℃로 실시하였고 공기와 산소의 주입으로 50% 이상의 용존산소 농도를 유지하고 소디움 바이카보네이트와 이산화탄소가스의 주입으로 pH 7.2를 유지하면서 배양하였다. 배양 2일차에 CHO-SFM-SGM1 배지를 1.5리터 주입하여 최종 배양 부피를 5리터로 유지하면서 배양하고 배양 6일차에 세포농도가 1.5 ×106 세포주/ml 도달시 소디움 부티레이트 1 mM와 NAC 10 mM를 주입하여 9일차까지 배양하여 CHO-SFM-SGM1 배지로 끝까지 배양한 대조군과 세포 성장도, 생존율 및 단백질의 생산 농도를 비교하였다.
도 1은 세포 성장도와 생존율을 비교한 것으로, 소디움 부티레이트와 NAC 첨가군이 대조군과 세포 성장도는 다소 낮으나 생존율은 유사하였다.
도 2는 단백질의 생산농도를 비교한 것으로, 소디움 부티레이트와 NAC를 첨가한 시험군이 대조군보다 첨가시점부터 큰 폭으로 증가하여 최종적으로 약 5배의 상승을 가져 왔다.
실시예 4: 배양기 이용한 연속 배양에서의 소디움 부티레이트와 NAC 첨가 배지의 효과 확인
상기의 회분식 배양에서 확인한 결과를 토대로 연속배양에서의 효과를 확인하기 위해 15 ㎛의 메쉬크기를 갖는 스핀필터가 장착된 7.5리터 배양기(Celligen plus, NBS사)에서 연속식 배양을 실시하였다.
상기 실시예 4에서 실시된 방법으로 회분식 배양을 실시하여 세포 농도가 1.2 ×106 세포주/ml 도달시 배지교환식 연속배양을 실시하였다. 최초 세포성장용 교환배지는 CHO-SFM-SGM1 배지 또는 시판중인 상업화된 하이클론사의 HyQ SFM4CHO와 시그마사의 Sigma Protein free media(C5467)의 1:1 혼합배지를 사용하였으며, 배지교환비율을 하루에 배양액 부피대비 0.5 ∼ 4배의 속도로 교환하여 세포농도를 7 ×106 세포주/ml까지) 성장시킨 후 생산배지로 교체하여 배지교환을 하면서 연속배양을 실시하여 단백질을 생산하였다. 생산용 교환배지로는 소디움 부티레이트 1 mM와 NAC 10 mM가 첨가된 CHO-SFM-SGM1 배지 또는 소디움 부티레이트 1 mM와 NAC 10 mM가 첨가된 상업화 배지를 사용하였다. 이와 같은 방법으로 약 25일간 배양하여 소디움 부티레이트만 첨가된 배지로 생산배양을 수행한 대조군과 세포성장도, 생존율 및 단백질 생산 농도를 비교하였다.
도 3은 연속배양시 세포 성장도와 생존율을 비교한 것으로, 소디움 부티레이트와 NAC를 함께 사용한 생산용 배지로 교환한 시험군은 대조군과 비교시 세포성장이 8 ×106 세포주/ml에서 12 ×106 세포주/ml에서 일정하게 유지되었고 대조군은 8 ×106 세포주/ml에서 10 ×106 세포주/ml로 유지된 후 하향세를 나타내 최종세포농도가 5 ×106 세포주/ml까지 낮아졌다. 생존율은 시험군이 90% 이상을 유지한데 비해 대조군은 계속 하향세를 나타내며 최종 75% 수준으로 떨어졌다. 이는 대조군의 경우 소디움 부티레이트에 의한 세포사멸이 누적되어 배양시간이 길어질 수록 세포성장과 생존율이 낮아진데 비해 소디움 부티레이트와 NAC가 함께 첨가된 생산배지 사용시 소디움 부티레이트에 의한 세포사멸을 NAC가 완화시켜주면서 배양시간이 길어져도 세포성장과 생존율을 안정적으로 유지시킴을 나타낸다.
도 4는 연속배양시 단백질 생산농도를 나타낸 것으로, 소디움 부티레이트와 NAC를 함께 사용한 생산용 배지로 교환한 시험군은 생산배양기 동안 단백질 농도가 약 10 ∼ 15 ㎍/ml로 유지되었으나 대조군은 3 ∼ 8 ㎍/ml으로 유지되어 최종 생산량이 시험군이 대조군 보다 약 4배 향상되었다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 무혈청 배지에 NAC 또는 NAC와 소디움 부티레이트를 함유한 배지에서 배양하면 세포의 사멸현상을 완화시키고 단백질의 분비속도를 최소 2배 이상 증가시킬 수 있어 동물세포를 이용한 재조합 단백질 생산성을 크게 향상시킬 수 있다.
도 1은 소디움 부티레이트와 NAC가 첨가된 배지의 세포 성장도와 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 소디움 부티레이트와 NAC가 첨가된 배지의 단백질의 생산농도를 비교한 그래프이다.
도 3은 소디움 부티레이트와 NAC가 첨가된 배지를 이용한 연속배양시 세포 성장도와 생존율을 비교한 그래프이고,
도 4는 소디움 부티레이트와 NAC가 첨가된 배지를 이용한 연속배양시 단백질 생산농도를 나타낸 그래프이다.

Claims (3)

  1. 동물세포 배양용 무혈청배지에 있어서, 상기 배지에 N-아세틸 시스테인 단독, 또는 N-아세틸 시스테인과 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 첨가된 것임을 특징으로 하는 무혈청배지.
  2. 재조합 단백질 생산용 동물세포의 배양방법에 있어서, 무혈청 배지에서 동물세포를 1.5 ×106 ∼ 1 ×107 cells/ml로 성장시킨 다음, N-아세틸 시스테인 단독, 또는 N-아세틸 시스테인과 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 포함된 배지에서 세포를 완전히 성장시키는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생산성이 향상된 동물세포의 배양방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 N-아세틸 시스테인이 0.1 ∼ 20 mM 함유되고, 소디움 부티레이트가 0.1 ∼ 4 mM 함유된 것임을 특징으로 하는 동물세포 배양방법.
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