CN103911339B - 一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法 - Google Patents
一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103911339B CN103911339B CN201310003115.1A CN201310003115A CN103911339B CN 103911339 B CN103911339 B CN 103911339B CN 201310003115 A CN201310003115 A CN 201310003115A CN 103911339 B CN103911339 B CN 103911339B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- serum
- cell
- substratum
- free
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 33
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims abstract description 18
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 9
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 12
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 9
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 claims description 9
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 claims description 9
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 9
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N Ethanolamine Oleate Chemical compound NCCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N 0.000 claims description 7
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 7
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 6
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 6
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 6
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 claims description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 62
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 45
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 abstract description 11
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 abstract description 8
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 abstract description 7
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 26
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 6
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 6
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 5
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical class [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- -1 lipid peroxide Chemical class 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 2
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 2
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 2
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 2
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 101100519221 Homo sapiens PDGFB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 108700021154 Metallothionein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100028708 Metallothionein-3 Human genes 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 102100040990 Platelet-derived growth factor subunit B Human genes 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002514 epidermal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229940098417 hydrocortisone 5 mg Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010438 iron metabolism Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229960002969 oleic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002926 oxygen Chemical class 0.000 description 1
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004537 potential cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- GPPXJZIENCGNKB-UHFFFAOYSA-N vanadium Chemical compound [V]#[V] GPPXJZIENCGNKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法，本发明的基础培养基为DMEM培养基或其与F12培养基的混合；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。与现有技术相比本发明优点为：未添加动物源性或重组白蛋白，避免了可能携带的安全隐患，降低培养基成本；适用于成纤维细胞的原代和传代培养，并保持较好的细胞形态，与血清组细胞的状态和功能相似；不需采用贴壁因子包被，原代24h贴壁率＞60%，传代24h贴壁率＞80%，与血清组细胞无差异；能满足多次传代需要，且传至15代后生长状况仍保持与血清组细胞状态相似；将成纤维细胞从含血清培养中直接转入本发明培养，细胞可顺利贴壁伸展，不需逐渐适应过程。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法。
背景技术
组织工程皮肤是目前组织工程领域的热点，近年来已经有许多产品应用于临床。组织工程皮肤研发中需要解决的一大问题是种子细胞（即表皮细胞与成纤维细胞）的大规模体外培养。
传统的成纤维细胞培养是在基础培养基中添加血清，但是血清的使用会带来风险隐患：①血清中含有细胞生长抑制因子和毒性因子，有潜在细胞毒性；②血清组分复杂，批次间质量存在差异，增加了产品质量控制的难度和不稳定性；③目前血清中各组分及其含量对细胞生长、增殖的作用机制尚不清楚，给研发和应用带来不便；④从安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物（如引起牛海绵状脑炎的朊病毒），给血清的使用带来了不容忽视的安全隐患；⑤由于血清培养基中的蛋白质很难通过普通分离方法彻底去除，，从而造成细胞表达产物分离纯化难度较高，严重影响产品的最终质量。这些不利因素促使了培养方法的改进，用无血清细胞培养基替代血清培养基。
目前针对无血清培养基的研发主要集中在以下几种细胞：疫苗生产细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞等）、干细胞（例如间充质干细胞、胚胎干细胞、表皮干细胞等）和其他细胞（如神经细胞、内皮细胞、软骨细胞等）。无血清培养基针对性很强，没有广泛的适应性，同类型的细胞、甚至不同细胞系或细胞株都可能有各自的无血清培养基，对无血清培养基的适应往往不同。成纤维细胞因其增殖具有血清依赖性，在无血清条件下培养较为困难，所以目前针对成纤维细胞的无血清培养基很少，仅有少数外国企业的无血清培养基，主要有：ATCC公司的Fibroblast Growth Kit
Serum-Free，Sciencell公司的Fibroblast Medium-serum
free(FM-sf)和HyClone公司的FetalClone® III等产品。国内尚无同类产品，也未见文献或专利公开有用于成纤维细胞的无血清培养基的详细资料。
目前，用于其他细胞培养的无血清培养基存在的共同问题：①白蛋白作为血清的主要成分，是无血清培养基中普遍的添加成分，由于牛血清白蛋白（BSA）为动物源性蛋白，可能携带致病因子；目前的无动物源性培养基多是采用重组白蛋白（HSA）替代BSA，导致培养基成本较高。②血清中含有多种贴壁因子，依赖血清的细胞在无血清培养时则不易贴壁，所以在无血清培养贴壁细胞时，需要提前包被贴壁因子，增加了操作的复杂性，而且常用的贴壁因子（如胶原、多聚赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白等）价格昂贵，提高了培养基成本。③多数无血清培养基的使用需给细胞一个适应过程，逐步降低培养基中血清浓度，最终过渡到无血清培养；另外，在用于原代培养时，还需要额外添加2％的血清，使其不成为真正意义上的无血清培养。④无血清培养基传代次数较少，例如，ATCC公司的Fibroblast Growth Kit
Serum-Free培养基在说明书中明确指出，培养10代之后细胞增殖速率减缓。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对成纤维细胞培养的无血清培养基，其中不添加白蛋白和贴壁因子，能够避免血清中复杂成分造成的潜在隐患，使成纤维细胞接近在含血清培养基中的生长增殖状态，从而满足规模生产和应用的需要。
本发明所提出的无血清成纤维细胞培养基是由基础培养基与外源添加物组成，其中，基础培养基为DMEM商用培养基，或DMEM商用培养基与F12商用培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。
所述的混合培养基按体积比DMEM培养基为1～3份、F12培养基为1份；所述的外源添加物为：胰岛素或胰岛素样生长因子（IGF）为1～20 mg/L，转铁蛋白为1～20 mg/L，谷氨酰胺为1～10 mM，三碘甲状腺氨酸（T3）为0.01～5μM，氢化可的松为0.01～5mg/L，地塞米松为0.01～10μg/L，乙醇胺为5～30μM，腺嘌呤为5～30 mg/L，葡聚糖为10～30g/L，亚硒酸钠为1～15μg/L，2-巯基乙醇为50～100μM，维生素E（VE）为2～20mg/L，维生素C（VC）为2～50mg/L，脂类浓缩剂为1mL/L，碱性成纤维生长因子（bFGF）为1～50μg/L，表皮生长因子（EGF）为1～10μg/L，转化生长因子（TGF-β）为1～10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1～10μg/L。
本发明的无血清成纤维细胞培养基，不添加动物源性白蛋白和重组白蛋白以及贴壁因子，适用于人成纤维细胞的原代和传代培养，以及由血清环境直接转入无血清环境的人成纤维细胞体外培养，所培养细胞的生长状态与含血清培养的效果一致。
细胞在无血清培养时必须加有活性因子，以取代血清支持细胞生长，如各种激素、生长因子和转运蛋白等，其中起主要作用的有3～4种，普遍认为胰岛素、转铁蛋白、谷氨酰胺和亚硒酸钠是无血清培养中的必需成份。
本发明组分中激素的作用为：激素是血清的重要成分之一，无血清培养基中激素缺乏会导致细胞无法正常增殖。本发明组分中包含了血清激素的几种主要组分，能最大限度的模拟血清环境，满足细胞生长，其中所含激素类化合物的作用如下。
胰岛素和IGF：在无血清培养条件下，缺乏血清会使细胞的有丝分裂停止在细胞周期的G1期，使细胞失去分裂能力，最终衰老死亡；胰岛素及IGF能够激活包括小分子G蛋白Ras在内的几种信号通路，最终激活MAPKs (Mitogen-activated
protein kinases），启动 DNA、蛋白质和脂肪酸的合成，使细胞由G1期进入S期，促进细胞分裂增殖；
T3是甲状腺激素的主要活性成分，在细胞分化、生长、发育及维持机体平衡稳态等方面发挥着关键作用，能够促进DNA合成和细胞对葡萄糖的吸收，近年来研究发现T3还具有调节细胞铁代谢的作用；
地塞米松和氢化可的松：属于糖皮质激素，对成纤维细胞的增殖作用是双向的，受细胞来源、接种密度、细胞代谢状态、激素作用时间长短等因素影响，对细胞起促进或抑制作用；在本发明的浓度范围内，这两种糖皮质激素能够促进成纤维细胞的生长。
本发明组分中的抗氧化剂的作用为：细胞的生理代谢会产生自由基，自由基在细胞内聚集会导致细胞膜上的不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物，这种过氧化物能破坏细胞膜及其亚细胞器膜的结构，使膜肿胀、融合从而导致细胞死亡。在无血清培养时，因缺少血清中的抗氧化体系，细胞更容易积累自由基，因此需要通过添加抗氧化剂保护细胞不受自由基损伤。本发明与其他无血清培养基相比，抗氧化剂种类从常用的一两种增加至四种，依靠多种抗氧化剂之间的协同作用，能有效控制细胞氧化损伤，大大延长细胞培养代数。
VE和VC：维生素E能阻止类脂的氧化作用，清除脂质自由基，防止不饱和脂肪酸过氧化物的生成，对生物膜起保护作用。VE与硒共同使用，能降低组织中过氧化物的水平。维生素C能中和体内所产生的自由基，从而减轻自由基所造成的氧化损伤，参与生物氧化和还原及细胞呼吸过程，同时有促进酪氨酸和色氨酸代谢以及胶原合成作用。VC与VE共同使用具有协同效应，VC能将生育酚氧自由基再生转化为VE，同时通过清除氧自由基来减少VE的消耗；
亚硒酸钠：硒是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的必需成分，参与过氧化物的分解，通过添加亚硒酸钠增加GSH-Px的活性，能对细胞产生抗氧化保护作用；
2-巯基乙醇：常用于二硫键的还原，在培养基中可以作为抗氧化剂，使谷胱甘肽维持在还原状态，有效提高细胞内还原性谷胱甘肽（GSH）的含量，从而通过GSH抵御过氧化氢对细胞的损伤。
本发明中所含细胞生长因子的作用为：血清中含有多种细胞生长因子，生长因子能加强蛋白质基因的转录，加速细胞由G0-G1、G1-S期的转换，缩短细胞群体倍增时间，促进细胞分裂与增殖；缺乏细胞生长因子，成纤维细胞会出现增殖缓慢，传代次数减少的现象。
本发明中所含合成前体的作用为：脂类浓缩剂能提供细胞膜合成及细胞生长所需的脂质，本发明使用的商用脂类浓缩剂主要成分包括：花生四烯酸、亚油酸、豆蔻酸、亚麻酸、油酸、胆固醇、棕榈烯酸、棕榈酸、硬脂酸。腺嘌呤是核酸的组成成分，在体内参与RNA和DNA合成，在促进细胞分裂中起活化作用。乙醇胺是磷脂和细胞膜合成的前体物质，对细胞生长有促进作用。
本发明中所含转金属蛋白的作用为：成纤维细胞表面有转铁蛋白受体，受体与转铁蛋白复合物结合是细胞获取必需微量元素铁的主要来源，转铁蛋白还具有生长因子的性质，促进细胞增殖，并与其他微量元素如钒等结合，有助于细胞吸收。缺少转铁蛋白，细胞将因无法吸收微量元素而死亡。
本发明中所含谷氨酰胺的作用为：谷氨酰胺是细胞培养基中的必需成分，可作为细胞生长的主要能源和氮源，是细胞合成嘌呤、嘧啶、蛋白质及多肽必需的氨基酸，谷氨酰胺的缺乏会导致细胞生长不良甚至死亡。
本发明中所含葡聚糖的作用为：细胞渗透压对细胞的生长至关重要，培养基中渗透压的改变会导致细胞收缩或溶胀，使DNA和蛋白遭到破坏，细胞周期停滞，最终导致细胞死亡。本申请人通过实验发现，葡聚糖具有渗透压缓冲能力，可用于维持培养基中的正常渗透压，使细胞免受损伤；葡聚糖同时对激素、生长因子等也具有非特异的保护作用。
本发明无血清成纤维细胞培养基的制备方法为：采用超纯水配制基础培养基；为使培养效果更好，可在DMEM培养基中混入F12培养基，得到基础培养基；在基础培养基中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入三碘甲状腺氨酸、氢化可的松、地塞米松、腺嘌呤、亚硒酸钠、2-巯基乙醇、VE、VC、脂类浓缩剂、谷氨酰胺、乙醇胺、bFGF、EGF、TGF-β、PDGF、胰岛素或胰岛素样生长因子、转铁蛋白；调pH至7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4℃保存。
采用本发明无血清成纤维细胞培养基培养原代成纤维细胞按以下操作：1）将消化后获得的成纤维细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清成纤维细胞培养基重悬，按0.5×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；2）培养1天后换液，之后每2~3天换液一次；3）待细胞生长汇合至60％时，可进行传代。
采用本发明无血清成纤维细胞培养基培养传代成纤维细胞按以下操作：1）将消化获得的细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清培养基重悬细胞，按1×104～5×104个/cm2的细胞密度接种培养；2）每2~3天换液一次，待细胞生长汇合至80％时，进行下一次传代。
与现有技术相比，本发明的优点是：①未添加动物源性白蛋白和重组白蛋白，避免了可能携带的安全隐患，同时降低了培养基成本，有利于规模化培养；②同时适用于人成纤维细胞的原代和传代培养，而且原代培养不添加血清，原代细胞在本发明培养基中能够保持较好的细胞形态，呈细长梭状、边缘清晰、伸展良好，细胞增殖旺盛，与含血清培养基培养的成纤维细胞状态相似（见附图2）；③在培养成纤维细胞前不需要用贴壁因子包被，实验证明，原代和传代成纤维细胞均可以贴壁，原代24小时贴壁率在60%以上，传代24小时贴壁率在80%以上，与含血清培养基培养的成纤维细胞无差异；④能满足多次传代需要，培养代数较长，本发明培养基能维持成纤维细胞从原代传至15～20代，且传至15代后仍然能保持与含血清培养基培养的成纤维细胞相似的生长状况，细胞在无血清组中伸展良好，形态为长梭形，悬浮细胞少，分布均一，呈单层极性排列（见附图1）；实验证明，将相同数量的细胞分别接种至含血清培养基和本发明无血清培养基中，培养6天后，含血清组与无血清组中的细胞密度相差不明显，说明成纤维细胞在本发明培养基中增殖速率与含血清培养基接近或相当，生长前期无血清组细胞增殖速率甚至稍快于血清对照组（见附图3）；⑤将成纤维细胞从含血清培养基中直接转移至本发明培养基中，细胞可顺利贴壁伸展，不需逐渐适应无血清的生长环境；⑥成纤维细胞在无血清培养时能保持与血清组相似的功能，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测不同培养基中成纤维细胞分泌的角质细胞生长因子（KGF）含量，发现成纤维细胞在本发明培养基中分泌的KGF含量与血清组相差不大，说明本发明培养基中成纤维细胞功能未受到影响（见附图4）。
附图说明
附图1为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的传代成纤维细胞效果对比的显微照片，其中A为无血清培养组（无血清组），B为含血清培养组（血清组）；通过观察两组细胞形态，可知成纤维细胞在本发明培养基中传至15代后依旧保持与血清组相似的生长状况，说明无血清培养基足以维持成纤维细胞的良好生长。
附图2为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的原代成纤维细胞生长状态对比的显微照片，其中C为无血清组的细胞形态，D为血清组的细胞形态，E为无血清组从原代传至第20代的细胞形态，F为血清组从原代传至第20代的细胞形态；可以看出，本发明培养基能够成功培养原代成纤维细胞，细胞形态与血清组相似，且从原代传至第20代仍保持稳定的细胞形态。
附图3为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的成纤维细胞生长对比曲线，图中SFM曲线（serum-free medium）为无血清组的，SCF曲线（serum-content medium）为血清组的，可见成纤维细胞在无血清培养基中增殖速率与含血清培养的生长状态接近。
附图4为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的成纤维细胞分泌角质细胞生长因子（KGF）的ELISA检测结果对比表，结果显示，两组之间KGF含量相差不大，无血清组甚至略高，说明本发明培养基所培养成纤维细胞的功能与血清组的相似。
具体实施方式
以下结合实例说明本发明技术方案的具体实施方式和使用效果。
实例中所使用的DMEM商用培养基和F12商用培养基均购自Gibco公司，各种细胞生长因子购自peprotech公司，脂类浓缩剂购自Gibco公司，其余试剂均购自sigma公司。
实施例
1
、人成纤维细胞的原代培养
配制培养基：将DMEM培养基与F12培养基按3︰1的体积比混合；按30g/L加入葡聚糖搅拌溶解后，再分别加入三碘甲状腺氨酸5μM、氢化可的松5mg/L、地塞米松5μg/L、腺嘌呤20mg/L、亚硒酸钠15μg/L、2-巯基乙醇50μM、VE 5mg/L、VC 50mg/L、脂类浓缩剂1mL/ L、谷氨酰胺5mM、乙醇胺5μM、bFGF 50μg/L、EGF 10μg/L、TGF-β 10μg/L、PDGF 10μg/L、胰岛素10mg/L、转铁蛋白10mg/L；用HCI溶液调pH至7.2，定容后用0.2μm滤膜过滤除菌，得到无血清成纤维细胞培养基。
使用实例：将消化后的人成纤维细胞用PBS溶液清洗；离心后用所配制的无血清成纤维细胞培养基重悬，按2×104个/cm2接种至培养瓶中，置入培养箱在37℃、5％CO2条件下培养；24h后换液，继续培养，之后每隔2d换液。原代细胞在无血清培养基中能较快贴壁，24h内贴壁率可达60～70%，10天左右细胞达到60%汇合，即可进行传代培养。
原代细胞在本发明培养基中能够保持较好的细胞形态，细胞呈细长梭状、边缘清晰、伸展良好，细胞增殖旺盛，与含血清培养基培养的成纤维细胞状态相似（参见附图2）。
实施例
2
、人成纤维细胞的传代培养
配制培养基：以DMEM培养基为基础培养基，按10g/L加入葡聚糖搅拌溶解后，再分别加入三碘甲状腺氨酸1μM、氢化可的松0.05mg/L、地塞米松0.05μg/L、腺嘌呤30mg/L、亚硒酸钠2μg/L、2-巯基乙醇100μM、VE 5mg/L、VC 10mg/L、脂类浓缩剂1mL/L、谷氨酰胺2mM、乙醇胺20μM、bFGF 10μg/L、EGF 5μg/L、TGF-β 2μg/L、PDGF 2μg/L、胰岛素样生长因子5mg/L、转铁蛋白5mg/L；用HCI溶液调pH至7.2，定容后用0.2μm滤膜过滤除菌，得到无血清成纤维细胞培养基。
使用实例1：将实施例1原代培养至60%汇合的细胞消化后，用PBS溶液清洗，离心弃上清后用本实例所配制无血清培养基重悬细胞，按1×104个/cm2的细胞密度接种，置于37℃、5％CO2条件培养箱进行培养；每隔3天换一次液，待细胞生长汇合至80％时，可进行下一次传代。
使用实例2：将含血清培养基中培养的人成纤维细胞用PBS清洗以去除残余血清；经胰蛋白酶消化后，用PBS溶液清洗一次，离心弃上清后用本实例所配制的无血清培养基重悬细胞，按2×104个/cm2的细胞密度接种培养；每隔2d换一次液，待细胞生长汇合至80%时，可进行下一次传代。
传代细胞24h内贴壁率可达80%，细胞生长3～4d后可传代，无论是从原代细胞转入无血清培养的成纤维细胞，还是从血清培养中直接转移至无血清培养的成纤维细胞，均可在无血清培养基中传15代左右，且后期依旧能保持与血清组相似的生长状况，细胞伸展良好，形态为长梭形，悬浮细胞少，分布均一，呈单层极性排列（参见附图1）。
Claims (3)
1.一种无血清成纤维细胞培养基，是由基础培养基与外源添加物组成，其特征在于，基础培养基为DMEM培养基，或DMEM培养基与F12培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子；所述的外源添加物为：胰岛素或胰岛素样生长因子为1～20mg/L，转铁蛋白为1～20mg/L，谷氨酰胺为1～10mM，三碘甲状腺氨酸为0.01～5μM，氢化可的松为0.01～5mg/L，地塞米松为0.01～10μg/L，乙醇胺为5～30μM，腺嘌呤为5～30mg/L，葡聚糖为10～30g/L，亚硒酸钠为1～15μg/L，2-巯基乙醇为50～100μM，VE为2～20mg/L，VC为2～50mg/L，脂类浓缩剂为1mL/L，bFGF为1～50μg/L，EGF为1～10μg/L，TGF-β为1～10μg/L，PDGF为1～10μg/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的混合培养基按体积比DMEM培养基为1～3份、F12培养基为1份。
3.制备权利要求1所述的无血清成纤维细胞培养基的方法，其特征在于，采用超纯水配制基础培养基；在基础培养基中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入三碘甲状腺氨酸、氢化可的松、地塞米松、腺嘌呤、亚硒酸钠、2-巯基乙醇、VE、VC、脂类浓缩剂、谷氨酰胺、乙醇胺、bFGF、EGF、TGF-β、PDGF、胰岛素或胰岛素样生长因子、转铁蛋白；调pH至7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4℃保存。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310003115.1A CN103911339B (zh) | 2013-01-06 | 2013-01-06 | 一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310003115.1A CN103911339B (zh) | 2013-01-06 | 2013-01-06 | 一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103911339A CN103911339A (zh) | 2014-07-09 |
| CN103911339B true CN103911339B (zh) | 2016-04-27 |
Family
ID=51037347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310003115.1A Active CN103911339B (zh) | 2013-01-06 | 2013-01-06 | 一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103911339B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107937335A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-04-20 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITUB20152804A1 (it) * | 2015-08-03 | 2017-02-03 | Blast Res S R L | Mezzo di coltura cellulare privo di siero. |
| CN106520673A (zh) * | 2016-12-24 | 2017-03-22 | 严志海 | 一种成纤维细胞培养基及其制备方法 |
| CN106635972B (zh) * | 2017-02-23 | 2019-03-19 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 成纤维细胞的培养基及其制备方法 |
| CN106834213B (zh) * | 2017-03-27 | 2021-03-02 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 一种诱导多能干细胞形成毛乳头细胞的诱导培养基及诱导方法 |
| CN107326005B (zh) * | 2017-06-18 | 2021-03-19 | 广东博溪生物科技有限公司 | 一种无外源支架的真皮构建方法及培养液 |
| CN107312745B (zh) * | 2017-06-18 | 2023-03-03 | 广东博溪生物科技有限公司 | 一种无血清的上皮细胞培养液 |
| CN107287152B (zh) * | 2017-06-18 | 2021-03-19 | 广东博溪生物科技有限公司 | 用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法及培养液 |
| CN107418926B (zh) * | 2017-08-24 | 2018-07-06 | 上海科医联创生物科技有限公司 | 一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基及其制备方法 |
| CN110343660A (zh) * | 2018-04-08 | 2019-10-18 | 生物角（厦门）科技有限公司 | 一种间充质干细胞无血清培养基组合物 |
| CN108676773A (zh) * | 2018-05-17 | 2018-10-19 | 广东芙金干细胞再生医学有限公司 | 一种延缓间充质干细胞衰老的培养液及制备方法 |
| CN110448519B (zh) * | 2019-08-27 | 2022-08-30 | 西安艾尔菲生物科技有限公司 | 人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体及其制备方法和应用 |
| CN110551683B (zh) * | 2019-08-27 | 2021-05-14 | 西安艾尔菲生物科技有限公司 | 人成纤维细胞无血清培养基和制备方法及人成纤维细胞无血清调节培养液的获取方法 |
| CN112048463A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-08 | 赵峻岭 | 一种细胞培养用血清替代物 |
| CN112725269B (zh) * | 2021-02-26 | 2022-11-22 | 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 | 一种无血清培养基的添加剂及其制备方法和应用 |
| CN113481149A (zh) * | 2021-08-10 | 2021-10-08 | 长春卓谊生物股份有限公司 | 一种筛选不同批次胎牛血清的方法 |
| CN113648276A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-16 | 广州市万千粉丝化妆品有限公司 | 一种间充质细胞的血清蛋白完全培养液的制备方法及在化妆品中的应用 |
| CN115216439A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-10-21 | 四川大学华西医院 | 一种成纤维细胞制备方法及应用 |
| CN116396928A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-07-07 | 细新(上海)医疗科技有限公司 | 一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用 |
| CN116804183B (zh) * | 2023-05-23 | 2024-05-17 | 北京大学口腔医学院 | 提取和长期培养唾液腺腺样囊性癌相关成纤维细胞的方法及培养基 |
| CN118291371A (zh) * | 2024-04-03 | 2024-07-05 | 椎元医学技术(上海)有限公司 | 一种生物制剂及其制备方法与应用 |
| CN118185867B (zh) * | 2024-05-14 | 2024-08-02 | 广东赛尔生物科技有限公司 | 一种耳后皮肤来源的成纤细胞的培养方法及培养基 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000517188A (ja) * | 1996-08-30 | 2000-12-26 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用 |
-
2013
- 2013-01-06 CN CN201310003115.1A patent/CN103911339B/zh active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107937335A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-04-20 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103911339A (zh) | 2014-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103911339B (zh) | 一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法 | |
| CN102827804B (zh) | 适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基及方法 | |
| CN103060264B (zh) | 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 | |
| CN101864393B (zh) | 一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基 | |
| US7462487B2 (en) | Cell culture media | |
| CN104630138B (zh) | 一种无血清软骨细胞培养液 | |
| WO2013113196A1 (zh) | 一种新生大鼠海马神经元原代培养的培养液及其制备方法和应用 | |
| CN106434532A (zh) | 一种培养肝细胞的培养基及其制备方法 | |
| CA2383460C (en) | Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions | |
| CN112779220B (zh) | 一种用于神经干细胞扩增的培养基 | |
| CN104164404A (zh) | 一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系的用途 | |
| US20240254453A1 (en) | Cell culture medium and supplements for corneal and skin cell culture | |
| KR20150018348A (ko) | 무단백질·무지질 배지 순화 세포주를 사용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| Léry et al. | A new serum-free medium for lepidopteran cell culture | |
| KR20220160142A (ko) | 소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법 | |
| US20110143432A1 (en) | Use of extract of selenium-enriched yeast (se-ye) in mammalian cell culture media formulations | |
| KR101459674B1 (ko) | 녹용 세포의 배양 방법 | |
| CN112359011B (zh) | 培养基补充剂、培养基补充组合物、培养基及培养方法 | |
| CN106244544A (zh) | 一种dc细胞无血清培养基 | |
| CN107043742A (zh) | 一种培养肝细胞的无血清培养基及其制备方法 | |
| CN116478914A (zh) | 无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液 | |
| TW200526782A (en) | Medium for preparing feeder cells for embryonic stem cells and feeder cells | |
| CN117778301A (zh) | 一种无血清培养基及其在细胞培养肉中的应用 | |
| CN117957308A (zh) | 用于细胞肉生产的细胞培养基和补充剂 | |
| CN115896008A (zh) | 一种低血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 710065 Shaanxi City, south of the Second Ring Road, Qinglong District Albert urban vision, building 11003, No. 1, No. Patentee after: Shaanxi Bo Bo Biological Technology Group Co., Ltd. Address before: 710065 Shaanxi City, south of the Second Ring Road, Qinglong District Albert urban vision, building 11003, No. 1, No. Patentee before: Shaanxi Bohong Biotechnology Co., Ltd. |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Serum-free fibroblast cell culture medium and preparation method thereof Effective date of registration: 20180726 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Xianyang corporate finance Company limited by guarantee Pledgor: Shaanxi Bo Bo Biological Technology Group Co., Ltd. Registration number: 2018610000114 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20190809 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Xianyang corporate finance Company limited by guarantee Pledgor: Shaanxi Bo Bo Biological Technology Group Co., Ltd. Registration number: 2018610000114 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Serum-free fibroblast cell culture medium and preparation method thereof Effective date of registration: 20190809 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Xianyang corporate finance Company limited by guarantee Pledgor: Shaanxi Bo Bo Biological Technology Group Co., Ltd. Registration number: Y2019980000031 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20201019 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Xianyang corporate finance Company limited by guarantee Pledgor: SHAANXI BIOHONG BIOTECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2019980000031 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A serum-free fibroblast culture medium and its preparation method Effective date of registration: 20201021 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Xianyang corporate finance Company limited by guarantee Pledgor: SHAANXI BIOHONG BIOTECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006998 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20210531 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Xianyang corporate finance Company limited by guarantee Pledgor: SHAANXI BIOHONG BIOTECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2020980006998 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210929 Address after: 710100 19th floor, building 3, Aerospace City Central Plaza, No. 666, East Chang'an Street, Chang'an District, Xi'an City, Shaanxi Province Patentee after: Xi'an Bohong Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 710065 No. 11003, building 1, Weiye City vision, Qinglong community, South Second Ring Road, Xi'an City, Shaanxi Province Patentee before: SHAANXI BIOHONG BIOTECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |