CN117778301A

CN117778301A - 一种无血清培养基及其在细胞培养肉中的应用

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Publication number: CN117778301A
Application number: CN202311733335.XA
Authority: CN
Inventors: 薛长湖; 殷浩文; 郑洪伟; 王明昊; 杨鲁; 许维娜
Original assignee: Quanzhou Marine Biological Industry Research Institute; Ocean University of China
Current assignee: Quanzhou Marine Biological Industry Research Institute; Ocean University of China
Priority date: 2023-12-15
Filing date: 2023-12-15
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种无血清培养基及其在细胞培养肉中的应用。所述培养基包括基础培养基、基础添加物和细胞补充因子；其中，细胞补充因子包括0.01‑0.5mL/mL的KnockOut、0.01‑100ng/mL的碱性成纤维生长因子、0.01‑1000μg/mL的胎球蛋白、0.01‑100mg/mL的人血清白蛋白。本发明经过反复实验调整，在基础培养基的基础上，通过添加基础添加物(维生素、非必需氨基酸、脂质、ITS、Hepes、谷丙二肽)和细胞补充因子(KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白)并调整各成分的用量，得到了可以实现快速恢复大黄鱼卫星细胞的细胞形态并且快速增殖，连续传代达到7代的无血清培养基，并给出了其在细胞培养肉中的应用。

Description

一种无血清培养基及其在细胞培养肉中的应用

技术领域：

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种无血清培养基及其在细胞培养肉中的应用。

背景技术：

由于温室气体和人口的增加导致的动物福利和环境问题，传统养殖业正面临巨大挑战，细胞培养肉是指在无菌环境下通过组织细胞培养产生的动物肌肉细胞，而不是传统的动物肌肉食品。细胞培养肉作为一项肉类生产的创新技术主要包括种子细胞提取、细胞扩增、细胞分化及食品化技术，可以大幅提高肉类生产效率。胎牛血清富含细胞生长增殖所需的生长因子、激素、氨基酸及脂质等物质，广泛应用于细胞培养。传统细胞培养严重依赖血清培养基，本质上是不可持续的，并暴露出成本昂贵、动物伦理、批次间不稳定等问题，与细胞培养肉的“清洁”属性严重相悖，使得低成本无血清培养基成为重要的研发趋势。

卫星细胞源于脊椎动物胚胎形成早期的中胚层，是一种扁平、有突起的细胞，是骨骼肌再生的必要条件。肌纤维受损后，卫星细胞可以快速增殖分化融合形成新的肌纤维。同样，细胞培养肉在体外选择性获取卫星细胞后进行快速增殖并诱导分化，促使大量卫星细胞融合形成肌纤维。目前，领域内虽然有报道相关无血清培养基配方，但是不同细胞的营养需求、代谢差异等原因导致无血清培养基不具有普适性。迄今为止，未见报道适应于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是目前未见报道适应于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基。

为解决上述问题，本发明经过反复实验调整，在基础培养基的基础上，通过添加基础添加物(维生素、非必需氨基酸、脂质、ITS、Hepes、谷丙二肽)和细胞补充因子(KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白)并调整各成分的用量，得到了可以实现快速恢复大黄鱼卫星细胞的细胞形态并且快速增殖，连续传代达到7代的无血清培养基，并给出了其在细胞培养肉中的应用。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种无血清培养基，所述培养基包括基础培养基、基础添加物和细胞补充因子；其中，细胞补充因子包括体积比0.1％-20％的KnockOut、0.01-100ng/mL的碱性成纤维生长因子、0.01-1000μg/mL的胎球蛋白、0.01-100mg/mL的人血清白蛋白。

无血清培养基必需依据特定的细胞的营养需求和代谢差异重新复配定制。通过基础培养基筛选选取适合大黄鱼卫星细胞生长的DMEM/F12培养基，基于此细胞活性仅为血清培养基的60％左右，并且无法传代，无法满足实际应用需求。在此基础上筛选细胞生长因子以促进大黄鱼卫星细胞增殖并实现连续传代，其中，KnockOut是一种包含激素、生长因子、结合蛋白等细胞生长所必须的营养物质，KnockOut血清替代物用于哺乳动物干细胞无血清替代方案，但是在单独适用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基中，细胞无法生长并且大量死亡。碱性成纤维生长因子是成纤维细胞生长因子家族的成员，参与调解细胞增殖、生长和分化等多种生理功能。胎球蛋白是一种血浆糖蛋白，具有促进细胞黏附和生长的作用。人血清白蛋白可以运输脂肪酸、氨基酸、激素等作用，并且在无血清培养基中可以起到减缓抗生素对细胞的负面影响。表皮细胞生长因子作为一种生长因子可以促进上皮细胞增殖，上述物质单独添加均无法有效的促进大黄鱼卫星细胞增殖。通过将上述物质复配和筛查发现大黄鱼卫星细胞在KnockOut、碱性成纤维生长因子、表皮细胞生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白复配的无血清培养基中可以实现快速恢复细胞形态并且快速增殖，连续传代达到7代，而表皮细胞生长因子在这个无血清体系中不能有效促进细胞增殖因此被排除。

进一步的，所述基础培养基为MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种或多种组合。所述基础培养基选择DMEM/F12培养基，本发明研究表明通过添加上述添加物，DMEM/F12培养基比MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基更适合大黄鱼卫星细胞的生长。

进一步的，所述基础添加物包括体积比0.01-10％的维生素、0.01-10％的非必需氨基酸、0.01-10％的脂质、0.01-10％的ITS、0.01-10mg/mL的Hepes、0.01-1000μg/mL的谷丙二肽。其中，维生素是一类维持细胞生长和调节细胞代谢的生物活性物质；非必需氨基酸的添加可以显著降低细胞培养是细胞自身生产非必需氨基酸的副作用；脂质作为细胞膜的结构组分，在信号传输过程中起到重要作用；ITS中包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠，其中，胰岛素含量为0.01-100mg/mL，转铁蛋白含量为0.01-100mg/mL，亚硒酸钠含量为0.01-100μg/mL；Hepes是一种非挥发性两性离子化学缓冲剂，可以在体系中起到一定pH缓冲作用；谷丙二肽可以参与蛋白质的合成和葡萄糖的产生。

进一步的，所述无血清培养基还包括青霉素-链霉素-两性霉素B溶液。青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1。

本发明研究表明所述用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基，可以满足大黄鱼卫星细胞的培养要求，细胞形态正常，相较于通用型生长培养基DMEM/F12含10％胎牛血清，本发明提供的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基不含血清成分，可以用于大规模产业化应用。

本发明中，上述用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基中各组分均为正常市售产品。

本发明还提供了上述无血清培养基在细胞培养肉中的应用。将大黄鱼卫星细胞接种于用于大黄鱼卫星细胞的上述无血清培养基中可以快速增殖并连续传代。

进一步的，将大黄鱼卫星细胞接种至所述的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基中，每两天换液一次，接种后第三天对细胞进行形态学观察并用TrypLE酶消化，得到细胞悬液计数后重新接种至新鲜的培养基中。

进一步的，大黄鱼卫星细胞接种量为1×10⁴～2×10⁵个/mL无血清培养基。

进一步的，大黄鱼卫星细胞培养条件为28℃的潮湿无菌环境。

本发明的有益效果在于：

(1)黄鱼卫星细胞的快速增殖是细胞培养肉生产的关键环节之一，本发明提供的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基在基础培养基为基础，通过添加多种促进细胞生长的物质，消除了大黄鱼卫星细胞对胎牛血清的依赖，从而避免使用血清所带来的一系列问题。

(2)本发明提供的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基使大黄鱼卫星细胞至少连续传7代(21天)且快速增殖。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基基础添加物的不同成分的细胞活力情况：其中，与仅培养基组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图2为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基基础培养基细胞活力情况：其中，与F10培养基组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

图3为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基细胞补充因子的不同成分的细胞活力情况：其中，与仅培养基组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图4为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基细胞补充因子排除法比较细胞活力情况：其中，与①组相比，@P＜0.05，@@P＜0.01。

图5为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基验证缺少胎球蛋白或表皮细胞生长因子对细胞活力的差异表现：其中，与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比，&&P＜0.01。

图6为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基。

图7为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基培养大黄鱼卫星细胞传7代明场图。

具体实施方式：

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径获得试剂和材料。

大黄鱼卫星细胞为实验室采用常规方法制备所得，分离大黄鱼幼鱼肌肉组织，分别采用0.2％胶原酶Ⅰ和0.1％胰蛋白酶溶液酶解，使用100μm纱布过滤后并离心，使用完全培养基重悬后接种于T25瓶放在28℃的潮湿无菌环境中培养。

实施例1用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基常见添加物的促增殖效果探究

(1)鼠尾胶原蛋白Ⅰ型铺板：用0.006M的无菌乙酸溶液将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型稀释到0.012mg/mL，以5μg/cm²浓度添加至24孔细胞培养板中，置于4℃冰箱过夜，PBS润洗后用于细胞接种。

(2)细胞接种：将约5×10⁴个大黄鱼卫星细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，以CCK-8试剂测定细胞活力，评价用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基添加物的促增殖效果。

(3)用于大黄鱼卫星细胞的细胞增殖培养基配制：DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

ITS由胰岛素(1mg/mL)、转铁蛋白(0.6mg/mL)、亚硒酸钠(0.7μg/mL)组成。

首先设置基础添加物的不同成分的浓度，其中维生素添加量：0.5％、1％、2％；非必需氨基酸添加量：0.5％、1％、2％；脂质添加量：0.5％、1％、2％；ITS添加量：0.5％、1％、2％；Hepes添加量：0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL；谷丙二肽添加量：100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL，结果如图1所示：同仅培养基组相比，维生素添加量：0.5％、1％、2％；非必需氨基酸添加量：0.5％、1％、2％；脂质添加量：0.5％、1％、2％；ITS添加量：0.5％、1％、2％；Hepes添加量：0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL；谷丙二肽添加量：100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL均可以实现细胞OD₄₅₀的上升，部分组具有显著性(*P＜0.05，**P＜0.01)，各组对细胞均有促进增殖的作用。因此上述基础添加物的不同成分的浓度均可以不同程度促进细胞增殖。选取各组中的OD₄₅₀最大值所对应的浓度即为最佳浓度，如表1所示，确定基础添加物的不同成分的最佳浓度，并将基础添加物的不同成分的最佳浓度组合起来作为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基基础添加物。

表1：基础添加物的不同成分的最佳浓度

成分	添加量
		维生素	1％
非必需氨基酸	1％
		脂质	1％
ITS	1％
		Hepes	5mg/mL
谷丙二肽	500μg/mL

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与仅培养基组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，大黄鱼卫星细胞形态正常，细胞数量为1×105个/mL，DMEM/F12含10％胎牛血清细胞数量为4×105个/mL。

实施例2用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基基础培养基选择

(2)细胞接种：将约5×10⁴个大黄鱼卫星细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，以CCK-8试剂测定细胞活力，评价用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基基础培养基的促增殖效果。

(3)用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基基础培养基选择：基础培养基为MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基。

基础培养基添加青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

基础培养基添加实施例1中所述基础添加物的不同成分的最佳浓度，结果如图2所示，同F10培养基组相比，DMEM培养基和DMEM/F12培养基组均具有显著性差异(#P＜0.05，##P＜0.01)，而DMEM/F12培养基组的OD₄₅₀值高于DMEM培养基组，确定DMEM/F12作为用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基基础培养基。

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与F10培养基组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，大黄鱼卫星细胞形态正常，DMEM/F12培养基组细胞数量为1×10⁵个/mL，同MEM培养基、DMEM培养基、F10培养基组相比数量最高，大黄鱼卫星细胞培养状态最好。

实施例3用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基的制备

(3)用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基的制备：DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，DMEM/F12基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

基础培养基添加实施例1中所述基础添加物的不同成分的最佳浓度。首先设置细胞培养补充因子的不同成分的浓度，其中KnockOut添加量：5％、10％、20％；碱性成纤维生长因子添加量：5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；表皮细胞生长因子添加量：5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；胎球蛋白添加量：5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL；人血清白蛋白添加量：0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL；结果如图3所示：同仅培养基组相比，KnockOut添加量：5％、10％、20％；碱性成纤维生长因子添加量：5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；表皮细胞生长因子添加量：5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；胎球蛋白添加量：5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL；人血清白蛋白添加量：0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL均可以实现细胞OD₄₅₀的上升，部分组具有显著性(*P＜0.05，**P＜0.01)，各组对细胞均有促进增殖的作用。因此上述细胞培养补充因子的不同成分的浓度均可以不同程度促进细胞增殖，选取各组中的OD₄₅₀最大值所对应的浓度即为最佳浓度。

在28℃的潮湿无菌环境中培养3d，大黄鱼卫星细胞在单因子添加的培养基中无法恢复原始细胞形态，大黄鱼卫星细胞死亡率较高。

确定细胞培养补充因子的不同成分的最佳浓度后，将不同成分的最佳浓度组合起来以增加细胞活力水平并促使细胞恢复细胞形态。基于排除法，首轮排除实验分为以下六组：①，KnockOut、碱性成纤维生长因子、表皮细胞生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白；②，KnockOut、碱性成纤维生长因子、表皮细胞生长因子、胎球蛋白；③，KnockOut、碱性成纤维生长因子、表皮细胞生长因子、人血清白蛋白；④，KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白；⑤，KnockOut、表皮细胞生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白；⑥，碱性成纤维生长因子、表皮细胞生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白，分别添加至无血清培养基中，结果如图4所示，同①比较，④组无显著性差异，②、③、⑤、⑥组具有显著性差异，同时，③在显著性差异的组别中具有最高OD₄₅₀值，即细胞补充因子缺少胎球蛋白或表皮细胞生长因子对细胞活力的影响均较小。

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与①组相比，@P＜0.05，@@P＜0.01。

胎球蛋白可以促进细胞黏附和增殖，表皮细胞生长因子作为一种生长因子可以促进上皮细胞增殖。为了进一步验证缺少胎球蛋白或表皮细胞生长因子对细胞活力的差异表现，第二轮排除实验分为以下三组：①KnockOut、碱性成纤维生长因子、表皮细胞生长因子、人血清白蛋白；②，KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白；分别添加至无血清培养基中，结果如图5所示。

注：各组之间使用GraphPadPrism8.0进行单因素方差分析再使用Dunnett法进行多重比较；与DMEM/F12含10％胎牛血清组相比，&&P＜0.01。

无血清培养基中缺少表皮细胞生长因子比缺少胎球蛋白的细胞活力更好。

最终经过筛选得到一种用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基，包括基础培养基DMEM/F12和添加物(表2)，其中添加物包括无血清培养基探究中选择的基础添加物和经过后续排除法筛选的四种细胞培养补充因子：KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白，细胞形态正常，细胞死亡率低。

表2细胞补充因子

成分	添加量
		KnockOut	10％
碱性成纤维生长因子	10ng/mL
		胎球蛋白	50μg/mL
人血清白蛋白	1mg/mL

实施例4用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基在细胞培养肉中的应用

卫星细胞的快速增殖和稳定传代是细胞培养肉生产过程中的关键步骤，通过实施例3制备的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基包含基础培养基(DMEM/F12)和添加物，其中添加物包括表1的基础添加物(维生素、非必需氨基酸、脂质、ITS、Hepes、谷丙二肽)和表2的细胞补充因子(KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白)，如图6所示，被应用在细胞培养肉生产过程中。

(1)鼠尾胶原蛋白Ⅰ型铺板：用0.006M的无菌乙酸溶液将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型稀释到0.012mg/mL，以5μg/cm2浓度添加至24孔细胞培养板中，置于4℃冰箱过夜，PBS润洗后用于细胞接种。

(2)细胞接种：将约5×104个大黄鱼卫星细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，在28℃的潮湿无菌环境中培养3d。

(3)细胞传代：记录细胞形态后使用TrypLE酶消化，得到细胞悬液计数后重新将约1×105个大黄鱼卫星细胞接种在预铺鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的24孔板中，至少传7代。

结果如图7所示，细胞接种在上述用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基中并在28℃的潮湿无菌环境中培养3d可以达到传代条件并且至少传7代。证明本发明制备的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基有效的促进了大黄鱼卫星细胞在细胞培养肉生产过程中快速增殖和稳定传代，为细胞培养肉提供了充足的细胞，有利于细胞培养肉产业化生产。

除了通过实施例1、实施例2和实施例3制备的用于大黄鱼卫星细胞的无血清培养基包含基础培养基(DMEM/F12)和添加物，其中添加物包括基础添加物(维生素、非必需氨基酸、脂质、ITS、Hepes、谷丙二肽)和细胞补充因子(KnockOut、碱性成纤维生长因子、胎球蛋白、人血清白蛋白)的最优值外，其他浓度数值亦可应用于大黄鱼卫星细胞的增殖和传代，大黄鱼卫星细胞同样可以实现增殖和传代。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种无血清培养基，其特征在于：所述培养基包括基础培养基、基础添加物和细胞补充因子；其中，细胞补充因子包括体积比0.1％-20％的KnockOut、0.01-100ng/mL的碱性成纤维生长因子、0.01-1000μg/mL的胎球蛋白、0.01-100mg/mL的人血清白蛋白。

2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种或多种组合。

3.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础添加物包括体积比0.01-10％的维生素、0.01-10％的非必需氨基酸、0.01-10％的脂质、0.01-10％的ITS、0.01-10mg/mL的Hepes、0.01-1000μg/mL的谷丙二肽。

4.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基还包括青霉素-链霉素-两性霉素B溶液；基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的体积比为99：1。

5.如权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于：青霉素-链霉素-两性霉素B溶液中，青霉素的含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL以及两性霉素B的含量为25μg/mL。

6.权利要求1所述的无血清培养基在细胞培养肉中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：将大黄鱼卫星细胞接种于权利要求1所述的无血清培养基中，实现增殖并连续传代。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：将大黄鱼卫星细胞接种至无血清培养基中，每两天换液一次，接种后第三天对细胞进行形态学观察并用TrypLE酶消化，得到细胞悬液计数后重新接种至新鲜的培养基中。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：大黄鱼卫星细胞接种量为1×10⁴～2×10⁵个/mL无血清培养基。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：大黄鱼卫星细胞培养条件为28℃的潮湿无菌环境。