CN115896008A - 一种低血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用，也适用于其他海洋鱼类或淡水鱼类，属于生物工程技术领域。所述低血清培养基包括基础培养基、占比30～80μL/mL的胎牛血清和外源添加成分，所述外源添加成分包括人血清白蛋白、抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子多肽、人全转铁蛋白、溶血磷脂酸和人重组IGF‑1。本发明提供的低血清培养基在DMEM/F12培养基的基础上，添加了六种促进细胞生长的物质，降低了肌卫星细胞对胎牛血清的依赖，有效减少胎牛血清的用量，节约了培养成本；相较于通用型培养基(DMEM高糖，添加10％FBS)，本发明提供的低血清培养基对细胞干细胞的维持和增殖能力与其效果相当。

Description

一种低血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体提供一种大黄鱼肌卫星细胞培养用低血清培养基及在细胞培养肉中的应用。

背景技术

随着经济社会发展，人类对肉类的需求越来越大，而传统肉类生产方式已经难以满足人类的需求，并且传统肉类生产方式需要消耗大量粮食、水资源，还会造成严重污染环境。细胞培养肉(Cultured meat)通过提取可高效增殖的动物干细胞或组织并放入培养皿中繁殖，进而分化成肌肉组织的原始纤维。细胞培养肉涉及到干细胞的分离与纯化、细胞的增殖与分化等过程，生产过程中仅需要培养基、一定的温度和湿度、二氧化碳等来提供营养和生长所需的环境，不会造成环境污染，不需要消耗传统肉类生产中所需要的饲料和水，并且占地面积小，节约了空间成本，是未来人造肉的主要研究发展方向。

在传统细胞培养中，需要添加一定量的胎牛血清提供细胞贴壁、增殖和维持生长所需的营养成分和生物因子，而胎牛血清存在着一定的缺点，主要表现在：(1)价格昂贵；(2)在血清中的物质成分不确定；(3)可能含有真菌、细菌、病毒、支原体等风险污染；(4)批间差异大，不同时间不同情况下所获得的血清不一致，对培养产品品质造成不稳定。

无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长增殖的合成培养基，例如专利文献CN 112210525 A公开了一种无血清培养基，所有外源添加成分均为化学合成或生物合成，由于是人工合成成分明确，产品批间稳定，细胞培养的重复性高，同时也减少了由于使用动物血清所带来的内外源病毒、细菌和支原体等微生物污染的风险，且工业化生产保证供应充足，也有利于生物制品的下游纯化。

虽然目前有商品化的无血清培养基，但是其价格也十分昂贵，不适合大规模产业化应用。因此，怎样在大规模培养过程中降低成本是亟需要解决的问题。

大黄鱼(Larimichthys crocea)是石首鱼科、黄鱼属鱼类。大黄鱼经济价值高，肉质鲜嫩，富含蛋白质，是鲜食佳品，但是由于过度捕捞，使其资源急速衰退。因此，开发大黄鱼的细胞培养技术生产细胞培养肉以满足人类需求是解决资源衰退的一种手段，而提供一种可以让大黄鱼肌卫星细胞快速增殖且低成本的培养基是本领域技术人员需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以让大黄鱼肌卫星细胞快速增殖且显著降低成本的低血清培养基，为之后规模化生产和细胞培养肉的应用提供可行的办法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种低血清培养基，所述培养基包括基础培养基、占比30～80μL/mL的胎牛血清和外源添加成分，所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基或F10培养基，所述外源添加成分包括人血清白蛋白、抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子多肽、人全转铁蛋白、溶血磷脂酸和人重组IGF-1，各成分在所述培养基中的浓度分别为0.1～8mg/mL、14.09～35.23μg/mL、1～10ng/mL、4～12μg/mL、0.23～0.69μg/mL、5～15ng/mL。

上述外源添加成分中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等；抗坏血酸在细胞氧化还原代谢中起调节作用，可以减少细胞死亡；碱性成纤维细胞生长因子多肽是成纤维细胞生长因子家族的一员，FGF家族成员结合肝素，具有广泛的有丝分裂和血管生成活性；转铁蛋白是一种存在于血清中的主要铁结合和细胞传递分子，无血清细胞培养系统需要一种铁的传递形式，转铁蛋白是铁的优选传递形式，人全转铁蛋白是一种高亲和性的转铁蛋白，可与多种细胞类型一起使用；溶血磷脂酸对细胞的生长、增殖、分化及细胞内信息传递产生多种影响，在维持机体正常的生理功能、参与各种病理过程的发生发展均有着重要的作用；人重组IGF-1在结构上与胰岛素原同源，在细胞增殖中发挥关键作用。

本发明研究表明，所述低血清培养基用于大黄鱼肌卫星细胞培养时，可在生长周期内实现正常细胞生长量，且获得的细胞形态正常，满足细胞培养要求。相较于通用培养基(DMEM高糖，100μL/mL FBS)，本发明提供的低血清培养基降低了血清用量，节约培养成本，适合大规模产业化应用。

本发明中，上述培养基中各组分均为市售产品。

作为优选，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。研究表明，相较于DMEM高糖培养基和F10培养基，DMEM/F12培养基与上述外源添加成分组合的培养基更利于大黄鱼肌卫星细胞的增殖。

作为优选，所述胎牛血清占比为50μL/mL。减少胎牛血清的添加量，可降低细胞培养成本，本发明通过添加外源添加成分以补充细胞贴壁、增殖和维持生长所需的营养成分和生物因子。

作为优选，所述外源添加成分中各成分在所述培养基中的浓度分别0.1mg/mL、35.23μg/mL、10ng/mL、4μg/mL、0.46μg/mL、15ng/mL。

本发明还提供了所述的低血清培养基在体外培养动物干细胞或动物肌肉细胞中的应用。

进一步的，所述动物可以为大黄鱼或其他海洋鱼类，也可以为淡水鱼类。从大黄鱼的成鱼或幼鱼中分离干细胞用于细胞培养，更进一步的，所述低血清培养基作为培养大黄鱼肌卫星细胞的培养基。具体的，所述大黄鱼肌卫星细胞由大黄鱼轴上肌中分离获得。

优选的，培养时细胞的接种量为10³～10⁵个/mL低血清培养基。

优选的，所述培养条件为在25℃～30℃培养20～100h。

本发明还提供了所述的低血清培养基在制备细胞培养肉中的应用。所述应用包括：将肌肉干细胞接种于所述的低血清培养基中进行培养。

具体的，本发明提供了一种制备大黄鱼细胞培养肉的方法，所述方法包括：将大黄鱼肌卫星细胞接种到所述的低血清培养基中进行培养。

优选的，培养时细胞的接种量为1×10⁴～2×10⁴个/mL低血清培养基。

优选的，培养条件为在25℃～27℃培养24～72h，每4h左右换一次液。所述低血清培养基可以使大黄鱼肌卫星细胞快速增殖。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明提供的低血清培养基在DMEM/F12培养基的基础上，添加了六种促进细胞生长的物质，降低了肌卫星细胞对胎牛血清的依赖，可有效降低胎牛血清的用量，节约了成本。

(2)相较于通用型肌卫星细胞培养基(DMEM高糖，添加100μL/mL FBS)，本发明提供的低血清培养基对细胞干细胞的维持和增殖能力与其效果相当。

附图说明

图1为无血清培养基中基础外源添加成分培养大黄鱼肌卫星细胞三天后的细胞活力情况，其中(A)为在不同浓度人血清白蛋白(HSA)条件下培养，另外两种添加成分浓度固定，分别为35.23μg/mL抗坏血酸和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子多肽；(B)为在不同浓度抗坏血酸条件下培养，另外两种添加成分浓度固定，分别为0.1mg/mL人血清白蛋白和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子多肽；(C)为在不同浓度碱性成纤维细胞生长因子多肽条件下培养，另外两种添加成分浓度固定，分别为35.23μg/mL抗坏血酸和0.1mg/mL人血清白蛋白。

图2为无血清培养基采用不同基础培养基培养P19代大黄鱼肌卫星细胞的情况，其中(A)为采用DMEM/F12培养基；(B)为采用DMEM高糖培养基；(C)为采用F10培养基。

图3为低血清培养基中各外源添加成分不同浓度培养大黄鱼肌卫星细胞两天后的细胞活力(所有组别均含有相同的基础外源添加成分)。

图4为低血清培养基中将各外源添加成分的最佳浓度组合起来后采用排除筛选法培养大黄鱼肌卫星细胞两天后的细胞活力(所有组别均含有相同的基础外源添加成分)。

图5为低血清培养基中添加溶血磷脂酸+人全转铁蛋白+IGF-1(-胰岛素)和胰岛素+溶血磷脂酸+IGF-1(-人全转铁蛋白)培养大黄鱼肌卫星细胞一天后的细胞活力比较(所有组别均含有相同的基础外源添加成分)。

图6为采用通用培养基和本发明低血清培养基培养P13代大黄鱼肌卫星细胞形态比较图，其中(A)为采用通用培养基(DMEM高糖，100μL/mL FBS)，(B)为本发明低血清培养基。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

DMEM高糖培养基(

BL304A)；DMEM/F12培养基(

PM150312)；F10培养基(

PM151113)；FBS胎牛血清(

086-150)；人血清白蛋白(

BS921)；抗坏血酸(阿拉丁

50-81-7)；碱性成纤维细胞生长因子多肽(

bs-0217P)；重组人胰岛素(

11061-68-0)；溶血磷脂酸(九鼎化学

325465-93-8)；人全转铁蛋白(

11096-37-0)；重组人IGF-1(

P00048)。

大黄鱼肌卫星细胞原代细胞为实验室采用常规方法制备所得，从大黄鱼幼鱼肌上轴部位分离得到肌肉组织，然后分别用0.1％IV型胶原酶溶液和0.1％胰蛋白酶溶液消化，消化后的组织分别用70μm和40μm细胞筛过滤，300g离心5分钟，用完全培养基重悬细胞沉淀，之后按1×10⁶个细胞/mL的浓度接种在6孔板中，放置在培养条件为27℃、5％CO₂的培养箱中培养。

实施例一：低血清培养基基础外源添加成分探究

将约2×10⁴个肌卫星细胞接种在100μL的96孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养72h，以cck-8试剂盒测定细胞活力，评价无血清培养基基础外源添加成分。

基础培养基为DMEM高糖，首先设置外源添加成分的不同成分的浓度，其中人血清白蛋白：0.1mg/mL、1mg/mL、8mg/mL；抗坏血酸：14.09μg/mL、21.14μg/mL、35.23μg/mL；碱性成纤维细胞生长因子多肽：1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL，结果如图1所示。

确定各成分的最佳浓度，然后将各成分的最佳浓度组合起来，选择出无血清培养基基础外源添加成分，见表1。

表1基础外源添加成分

在27℃培养下，96孔板每个孔洞最终的无血清培养基基础外源添加成分收获的细胞形态正常，细胞量为2.2×10⁵个/mL，细胞生长量约为对照组培养基(F10，添加100μl/mLFBS)的1/3左右。对照组培养基(F10，添加100μl/mL FBS)收获细胞量7.4×10⁵个/mL(前期探索了不同基础培养基对大黄鱼肌卫星细胞增殖的影响，结果显示F10效果最好，故此处选择了F10为对照组培养基)。

故选择0.1mg/mL人血清白蛋白、35.23μg/mL抗坏血酸和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子多肽作为无血清培养基基础外源添加成分。

实施例二：低血清培养基基础培养基选择

将约2×10⁴个肌卫星细胞接种在100μL的96孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养24h，通过显微电镜观察细胞形态和细胞生长量，评价无血清培养基基础培养基对肌卫星细胞增殖的影响。

基础培养基分别为DMEM高糖、DMEM/F12和F10，外源基础添加成分一致，均为0.1mg/mL人血清白蛋白、35.23μg/mL抗坏血酸和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子多肽。

结果如图2所示，在27℃下无菌培养24h后，通过显微电镜观察，DMEM/F12相较于基础培养基DMEM高糖和F10，细胞形态和细胞生长量均是最好的。

通过比较无血清培养基的基础培养基对肌卫星细胞增殖的影响，DMEM/F12效果最好。故选择DMEM/F12为无血清培养基的基础培养基。

实施例三：低血清培养基制备

将约2×10⁴个肌卫星细胞接种在100μL的96孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养48h，以cck-8试剂盒测定细胞活力，评价低血清培养基。

基础培养基为DMEM/F12，添加50μL/mL胎牛血清，首先设置外源添加成分的不同成分的浓度，其中重组人胰岛素：5.81μg/mL、8.72μg/mL、11.62μg/mL；溶血磷脂酸：0.23μg/mL、0.46μg/mL、0.69μg/mL；人全转铁蛋白：4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL；重组人IGF-1：5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL，结果如图3所示，然而单因子成分下培养的细胞形态多呈现椭圆形，细胞死亡率较高。

确定各成分的最佳浓度，然后将各成分的最佳浓度组合起来，采用排除筛选法(表2)，具体方法为：第一轮实验中分别将重组人胰岛素+溶血磷脂酸+人全转铁蛋白+重组人IGF-1、溶血磷脂酸+人全转铁蛋白+重组IGF-1(-重组人胰岛素)、胰岛素+人全转铁蛋白+重组人IGF-1(-溶血磷脂酸)、重组人胰岛素+溶血磷脂酸+重组人IGF-1(-人全转铁蛋白)和重组人胰岛素+溶血磷脂酸+人全转铁蛋白(-重组人IGF-1)添加到低血清基础培养基中，结果如图4所示，培养基中未添加重组人胰岛素和未添加人全转铁蛋白对细胞的增殖效果最好，为了进一步证实未添加重组人胰岛素和未添加人全转铁蛋白对细胞的增殖效果哪个更好，进行了第二轮实验分别将溶血磷脂酸+人全转铁蛋白+IGF-1(-胰岛素)和胰岛素+溶血磷脂酸+IGF-1(-人全转铁蛋白)添加到低血清基础培养基中，结果如图5所示，培养基中未添加重组人胰岛素相较于未添加人全转铁蛋白对细胞的增殖效果更好，最终选择出外源添加成分为溶血磷脂酸、人全转铁蛋白和重组人IGF-1。多因子组合条件下培养的细胞形态呈现长梭形，形态正常，死亡率较低。

表2采用排除筛选法确认外源添加成分

低血清培养基包括基础培养基DMEM/F12、50μL/mL胎牛血清和外源添加成分(表3)，其中外源添加成分包括无血清培养基探究中选择的基础外源添加成分和后续探究的3种细胞因子：人全转铁蛋白、溶血磷脂酸和重组人IGF-1。

表3添加成分

成分	浓度
		人全转铁蛋白	4μg/mL
溶血磷脂酸	0.46μg/mL
		重组人IGF-1	15ng/mL
碱性成纤维细胞生长因子多肽	10ng/mL
		抗坏血酸	35.23μg/mL
人血清白蛋白	0.1μg/mL

结果如图6所示，在27℃无菌培养24h，采用上述低血清培养基配方细胞形态正常，收获细胞量为4.8×10⁵个/mL，对照组通用型培养基(DMEM高糖，添加100μL/mL FBS)收获细胞量5.0×10⁵个/mL。表明采用上述低血清培养基配方可在所需生长周期内实现正常细胞生长量。

实施例四：低血清培养基在人造肉中的应用

本实施例通过在基础培养基DMEM/F12的基础上加上少量胎牛血清以及人血清白蛋白、抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子多肽、人全转铁蛋白、溶血磷脂酸、重组人IGF-1等外源添加成分，形成一种低血清培养基。该培养基可以使大黄鱼肌卫星细胞快速增殖。4h左右换一次液，细胞在27℃下培养48h，与通用培养基(DMEM高糖，100μL/mL FBS)效果一致，细胞形态正常，为人造肉制备提供足够的细胞。

成本计算，以500mL完全培养基为例，通用型培养基(DMEM高糖，100μL/mL FBS)需要约305元，而本发明的低血清培养基需要约240元，因此，利用上述低血清培养基可以降低培养成本，可以低成本的大规模培养大黄鱼肌卫星细胞，有利于产业转化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但其并非用以限定本发明，本发明提供的低血清培养基也适用于其他海洋鱼类或淡水鱼类，其他的任何的不背离本发明的精神和原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化均应作为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种低血清培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基、占比30～80μL/mL的胎牛血清和外源添加成分，所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基或F10培养基，所述外源添加成分包括人血清白蛋白、抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子多肽、人全转铁蛋白、溶血磷脂酸和人重组IGF-1，各成分在所述培养基中的浓度分别为0.1～8mg/mL、14.09～35.23μg/mL、1～10ng/mL、4～12μg/mL、0.23～0.69μg/mL、5～15ng/mL。

2.如权利要求1所述的低血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述胎牛血清占比为50μL/mL，所述外源添加成分中各成分在所述培养基中浓度分别0.1mg/mL、35.23μg/mL、10ng/mL、4μg/mL、0.46μg/mL、15ng/mL。

3.如权利要求1或2所述的低血清培养基在体外培养动物干细胞或动物肌肉细胞中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述动物为大黄鱼的成鱼或幼鱼。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，培养时细胞的接种量为10³～10⁵个/mL低血清培养基。

6.如权利要求3或5所述的应用，其特征在于，所述培养条件为在25℃～30℃培养20～100h。

7.如权利要求1或2所述的低血清培养基在制备细胞培养肉中的应用。

8.一种制备大黄鱼细胞培养肉的方法，其特征在于，所述方法包括：将大黄鱼肌卫星细胞接种到权利要求1或2所述的低血清培养基中进行培养。

9.如权利要求8所述的制备大黄鱼细胞培养肉的方法，其特征在于，培养时细胞的接种量为1×10⁴～2×10⁴个/mL低血清培养基。

10.如权利要求8所述的制备大黄鱼细胞培养肉的方法，其特征在于，所述培养条件为25℃～27℃培养24～72h。

Images