CN117343898A - 一种无血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种无血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用。本发明提供了一种无血清培养基，所述培养基包括基础培养基和外源添加成分；所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基或F10培养基；所述外源添加成分包括左旋肉碱、亚油酸、胆固醇、维生素E、叶酸、地塞米松、黄体酮、硫辛酸、甲醇胺、TGFβ1、肌醇、牛血清白蛋白和HEPES。本发明所述无血清培养基显著降低了成本，为规模化生产细胞培养肉提供了可行的产品和方法。

Description

一种无血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种无血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用。
背景技术
随着经济社会发展，人类对肉类的需求越来越大，而传统肉类生产方式已经难以满足人类的需求，并且传统肉类生产方式需要消耗大量粮食、水资源，还会造成严重污染环境。细胞培养肉(Cultured meat)通过提取可高效增殖的动物干细胞或组织并放入培养皿中繁殖，进而分化成肌肉组织的原始纤维。细胞培养肉涉及到干细胞的分离与纯化、细胞的增殖与分化等过程，生产过程中仅需要培养基、一定的温度和湿度、二氧化碳等来提供营养和生长所需的环境，不会造成环境污染，不需要消耗传统肉类生产中所需要的饲料和水，并且占地面积小，节约了空间成本，是未来人造肉的主要研究发展方向。
在传统细胞培养中，需要添加一定量的胎牛血清提供细胞贴壁、增殖和维持生长所需的营养成分和生物因子，而胎牛血清存在着一定的缺点，主要表现在：(1)价格昂贵；(2)在血清中的物质成分不确定；(3)可能含有真菌、细菌、病毒、支原体等风险污染；(4)批间差异大，不同时间不同情况下所获得的血清不一致，对培养产品品质造成不稳定。
无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长增殖的合成培养基，例如专利文献CN 112210525 A公开了一种无血清培养基，所有外源添加成分均为化学合成或生物合成，由于是人工合成成分明确，产品批间稳定，细胞培养的重复性高，同时也减少了由于使用动物血清所带来的内外源病毒、细菌和支原体等微生物污染的风险，且工业化生产保证供应充足，也有利于生物制品的下游纯化。
虽然目前有商品化的无血清培养基，但是其价格也十分昂贵，不适合大规模产业化应用。因此，怎样在大规模培养过程中降低成本是亟需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用。本发明所述无血清培养基显著降低了成本，为之后规模化生产细胞培养肉提供了可行的产品和方法。
本发明提供了一种无血清培养基，所述培养基包括基础培养基和外源添加成分；所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基或F10培养基；所述外源添加成分包括左旋肉碱、亚油酸、胆固醇、维生素E、叶酸、地塞米松、黄体酮、硫辛酸、甲醇胺、TGFβ1、肌醇、牛血清白蛋白和HEPES。
优选的是，所述外源添加成分在所述无血清培养基中的质量浓度分别为：左旋肉碱0.1～30μg/mL、亚油酸0.05～15μg/mL、胆固醇0.1～33μg/mL、维生素E 2.5～750μg/mL、叶酸0.2～50μg/mL、地塞米松0.2～50ng/mL、黄体酮1～100ng/mL、硫辛酸3.5～700ng/mL、甲醇胺0.1～50μg/mL、TGFβ10.05～15ng/mL、肌醇0.5～200μg/mL、牛血清白蛋白0.1～20mg/mL和HEPES1～500mg/mL。
优选的是，所述外源添加成分在所述无血清培养基中的质量浓度分别为：左旋肉碱1.9μg/mL、亚油酸0.5μg/mL、胆固醇3.3μg/mL、维生素E 100μg/mL、叶酸5μg/mL、地塞米松2ng/mL、黄体酮16.82ng/mL、硫辛酸70ng/mL、甲醇胺0.2μg/mL、TGFβ11.5ng/mL、肌醇5μg/mL、牛血清白蛋白9mg/mL和HEPES4.766 mg/mL。
本发明还提供了上述技术方案所述无血清培养基在体外培养动物干细胞或动物肌肉细胞中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述无血清培养基在制备动物细胞培养肉中的应用。
优选的是，所述动物包括鱼；所述鱼包括大黄鱼。
优选的是，所述大黄鱼包括大黄鱼成鱼或大黄鱼幼鱼。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述无血清培养基制备大黄鱼细胞培养肉的方法，包括以下步骤：
将大黄鱼肌卫星细胞接种到上述技术方案所述的无血清培养基中进行培养。
优选的是，所述培养时，大黄鱼肌卫星细胞的接种量为1×104～1×106个/mL无血清培养基。
优选的是，所述培养的温度为25℃～27℃；所述培养的时间为24～72h。
本发明提供了一种无血清培养基。本发明所述无血清培养基能够显著降低成本，为之后规模化生产细胞培养肉提供了可行的产品和方法。试验结果表明，本发明所述无血清培养基用于大黄鱼肌卫星细胞培养时，可在生长周期内实现正常细胞生长量的85％以上，且获得的细胞形态基本正常且维持了细胞干性，满足细胞培养要求。相较于含血清培养基(DMEM/F12，100μL/mL FBS)，本发明提供的无血清培养基节约了培养成本，适合大规模产业化应用。即本发明提供的无血清培养基在基础培养基的基础上添加13种促进细胞生长的物质，替代胎牛血清，不仅节约了成本，相较于通用型肌卫星细胞培养基(DMEM高糖，添加100μL/mL FBS)，本发明提供的无血清培养基对细胞干细胞的维持和增殖能力与其效果基本相当，这说明本发明无血清培养基更适合细胞培养肉的工业化大规模生产。相较于现有的无血清培养基，本发明提供的无血清外源添加成分成本更低、外源添加成分更少且大多数都是简单易得常见的化合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的无血清培养基中外源添加成分的初步探究结果图；其中(A)为无血清培养基最优组第8组培养下细胞典型显微电镜图片；(B)为通用正常血清培养下细胞显微电镜图片；(C)为各无血清实验组培养下细胞24小时和48小时细胞活力比较结果图。
图2为本发明提供的无血清培养基中外源添加成分的优化结果图；其中(A)为无血清培养细胞24小时后各组别的细胞活力结果图；(B)为无血清培养细胞48小时后各组别的细胞活力结果图；(C)为无血清培养细胞72小时后各组别的细胞活力结果图。
图3为本发明提供的无血清培养基中外源添加成分的进一步优化结果图；其中(A)为第4组无血清培养基培养下细胞典型显微电镜图片；(B)为正常血清培养下细胞典型显微电镜图片；(C)为各无血清培养条件下细胞72小时的细胞活力。
图4为本发明提供的无血清培养基中不同浓度牛血清白蛋白对细胞增殖的影响结果图；
图5为本发明提供的无血清培养基对细胞干性的影响结果图；其中(A)为无血清培养基培养下细胞分化标志性蛋白结蛋白免疫荧光染色图片；(B)为正常血清培养基培养下细胞分化标志性蛋白结蛋白免疫荧光染色图片；(C)为无血清和有血清培养基培养下细胞融合指数比较结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种无血清培养基，所述培养基包括基础培养基和外源添加成分；所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基或F10培养基；所述外源添加成分包括左旋肉碱、亚油酸、胆固醇、维生素E、叶酸、地塞米松、黄体酮、硫辛酸、甲醇胺、TGFβ1、肌醇、牛血清白蛋白和HEPES。
在本发明中，所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基或F10培养基，优选为DMEM/F12培养基。相较于DMEM高糖培养基和F10培养基，DMEM/F12培养基与上述外源添加成分组合的培养基更利于大黄鱼肌卫星细胞的增殖。
本发明所述外源添加成分能够补充细胞贴壁、增殖和维持生长所需的营养成分和生物因子，达到的效果和正常有血清培养基基本一致。本发明对上述成分的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含左旋肉碱0.1～30μg/mL，更优选为1.9μg/mL。在本发明中，左旋肉碱可以促进脂肪酸氧化供能。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含亚油酸0.05～15μg/mL，更优选为0.5μg/mL。在本发明中，亚油酸是一种必需脂肪酸，能降低血液胆固醇，胆固醇必须与亚油酸结合后，才能在体内进行正常的运转和代谢。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含胆固醇0.1～33μg/mL，更优选为3.3μg/mL。在本发明中，胆固醇在体内参与细胞膜的组成，也是体内合成类固醇激素的重要原料，这些激素能够调节糖、脂肪和蛋白质三大物质以及水和电解质的代谢。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含维生素E 2.5～750μg/mL，更优选为100μg/mL。在本发明中，维生素E是人体必需的脂溶性维生素，是一种很强的抗氧化剂，可通过中断自由基的连锁反应保护细胞膜的稳定性，通过维持遗传物质的稳定和防止染色体结构变异，调节机体代谢活动有条不紊地进行。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含叶酸0.2～50μg/mL，更优选为5μg/mL。在本发明中，叶酸为一种B族维生素，作为体内生化反应中一碳单位转移酶系的辅酶，起着一碳单位传递体的作用，参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，进一步合成DNA和RNA，参与氨基酸代谢，在甘氨酸与丝氨酸、组氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸与蛋氨酸之间的相互转化过程中充当一碳单位的载体，参与血红蛋白及甲基化合物如肾上腺素、胆碱、肌酸等的合成，叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含地塞米松0.2～50ng/mL，更优选为2ng/mL。在本发明中，地塞米松是从肾上腺皮质中提取出的是对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含黄体酮1～100ng/mL，更优选为16.82ng/mL。在本发明中，黄体酮能促进细胞的增殖和迁移。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含硫辛酸3.5～700ng/mL，更优选为70ng/mL。在本发明中，硫辛酸可作为辅酶参与机体内的物质代谢中的酰基转移，能消除导致加速老化与致病的自由基。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含甲醇胺0.1～50μg/mL，更优选为0.2μg/mL。在本发明中，甲醇胺是二氧化碳气体吸收剂，非离子型表面活性剂、脂类物质，能保护细胞膜的完整性。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含TGFβ10.05～15ng/mL，更优选为1.5ng/mL。在本发明中，TGFβ-1属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含肌醇0.5～200μg/mL，更优选为5μg/mL。在本发明中，肌醇是动物、微生物的生长因子。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含牛血清白蛋白0.1～20mg/mL，更优选为5～9mg/mL，最优选为9mg/mL。在本发明中，牛血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等。
在本发明中，所述无血清培养基中优选含HEPES1～500mg/mL，更优选为4.766mg/mL。在本发明中，HEPES是一种重要的缓冲剂，可以维持溶液pH的稳定。
本发明还提供了上述技术方案所述无血清培养基在体外培养动物干细胞或动物肌肉细胞中的应用。在本发明中，所述动物干细胞优选包括动物肌肉干细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述无血清培养基在制备动物细胞培养肉中的应用。在本发明中，细胞培养肉优选采用动物肌肉干细胞进行接种和培养获得。
在本发明中，所述动物优选包括包括鱼；所述鱼优选包括大黄鱼。在本发明中，所述鱼优选可以是其它海洋鱼类或淡水鱼类。在本发明中，所述大黄鱼包括大黄鱼成鱼或大黄鱼幼鱼。在本发明中，制备动物细胞肉的过程中，本发明优选对大黄鱼的肌卫星细胞进行培养，即本发明无血清培养基优选作为培养大黄鱼肌卫星细胞的培养基。在本发明中，所述大黄鱼肌卫星细胞优选由大黄鱼轴上肌中分离获得。大黄鱼(Larimichthys crocea)是石首鱼科、黄鱼属鱼类。大黄鱼经济价值高，肉质鲜嫩，富含蛋白质，是鲜食佳品，但是由于过度捕捞，使其资源急速衰退。因此，开发大黄鱼的细胞培养技术生产细胞培养肉以满足人类需求是解决资源衰退的一种手段，但目前缺乏一种可以让大黄鱼肌卫星细胞快速增殖且低成本的培养基。本发明所述无血清培养基用于大黄鱼肌卫星细胞培养时，可在生长周期内实现正常细胞生长量的85％以上，且获得的细胞形态基本正常且维持了细胞干性，满足细胞培养要求。相较于含血清培养基，本发明提供的无血清培养基节约了培养成本，适合大规模产业化应用。相较于现有的无血清培养基，本发明提供的无血清外源添加成分成本更低、外源添加成分更少且大多数都是简单易得常见的化合物。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述无血清培养基制备大黄鱼细胞培养肉的方法，包括以下步骤：
将大黄鱼肌卫星细胞接种到上述技术方案所述的无血清培养基中进行培养。在本发明中，所述培养时，大黄鱼肌卫星细胞的接种量优选为1×104～1×106个/mL无血清培养基。在本发明中，所述培养的温度优选为25℃～27℃；所述培养的时间优选为24～72h。在本发明中，所述培养无需换液。本发明所述无血清培养基可以使大黄鱼肌卫星细胞快速增殖。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种无血清培养基及其在制备大黄鱼细胞培养肉中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
DMEM/F12培养基(PM150312)；FBS胎牛血清(086-150)；维生素E(59-02-9)；HEPES(7365-45-9)；亚油酸(60-33-3)；胆固醇(57-88-5)；左旋肉碱(541-15-1)；黄体酮(57-83-0)；硫辛酸(62-46-4)；叶酸( 59-30-3)；地塞米松(ST1258-50mg)；甲醇胺(141-43-5)；肌醇(87-89-8)；TGFβ1(BIO-000006)和牛血清白蛋白(BIO-000001)。
大黄鱼肌卫星细胞原代细胞为实验室采用常规方法制备所得，从大黄鱼幼鱼肌上轴部位分离得到肌肉组织，然后分别用0.1％IV型胶原酶溶液和0.1％胰蛋白酶溶液消化，消化后的组织分别用70μm和40μm细胞筛过滤，300g离心5min，用完全培养基重悬细胞沉淀，之后按1×106个细胞/mL的浓度接种在6孔板中，放置在培养条件为27℃、5％CO2的培养箱中培养。
实施例1
无血清培养基外源添加成分初步探究
将约3×104个肌卫星细胞接种在100μL的96孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养72h，以cck-8试剂盒测定细胞活力，评价无血清培养基外源添加成分。
确定基础培养基为DMEM/F12，牛血清白蛋白浓度为2mg/mL和HEPES浓度为4.766mg/mL。首先设置外源添加成分的不同成分的浓度，其中左旋肉碱：1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL；亚油酸：0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL；胆固醇：1.1μg/mL、2.2μg/mL、3.3μg/mL；维生素E：25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL；叶酸：2μg/mL、3.5μg/mL、7μg/mL；地塞米松：2ng/mL、3.5ng/mL、7ng/mL；黄体酮：3ng/mL、6ng/mL、9ng/mL；硫辛酸：35ng/mL、0ng/mL、70ng/mL；甲醇胺：1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL；TGFβ1：0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL；肌醇：5μg/mL、12.5μg/mL、20μg/mL，结果如图1所示。
使用统计分析软件SPSS将各个因子的不同浓度组合起来，具体实验设计见表1，结合细胞活力实验结果和显微电镜图片，确定起主要作用的因子进一步优化设计，见表2。
表1实验设计表
表2优化后外源添加成分
在27℃培养48小时后，第8组无血清培养基培养下的细胞形态正常(图1中的A)，细胞量为7×105个/mL，细胞生长量约为对照组2培养基(DMEM/F12，添加100μl/mL FBS)的70％左右，对照组2(DMEM/F12，添加100μl/mL FBS)收获细胞量10×105个/mL(图1中的B)。与对照组1相比，通过增加外源添加成分，本发明无血清培养基能够促进细胞增殖。
将细胞活力实验结果(图1中的C)用统计分析软件SPSS进行统计分析，确定起主要作用的因子分别为甲醇胺、黄体酮、维生素E和左旋肉碱，故选择这4种因子作为主要的无血清培养基外源添加成分，后续在此基础上进一步优化。
实施例2
无血清培养基外源添加成分优化
实施例1中确定的4个主要因子的不同浓度使用统计分析软件组合起来，将约3×104个肌卫星细胞接种在100μL的96孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养72h，通过显微电镜观察细胞形态和用cck-8试剂盒检测细胞活力，评价无血清培养基基础培养基对肌卫星细胞增殖的影响。
基础培养基为DMEM/F12，确定浓度的外源添加成分分别是亚油酸0.5μg/mL、胆固醇3.3μg/mL、叶酸5μg/mL、地塞米松2ng/mL、硫辛酸70ng/mL、TGFβ11.5ng/mL和肌醇5μg/mL，其余4种主要因子具体实验设计见表3。
结果如图2所示，将培养48小时的细胞活力实验结果使用统计分析软件SPSS进行统计分析，得到最优组合为甲醇胺0.2μg/mL、黄体酮16.82ng/mL、左旋肉碱1.9μg/mL和维生素E 100μg/mL；将培养72小时的细胞活力实验结果进行统计分析，得到最优组合为甲醇胺0.2μg/mL、黄体酮17.90ng/mL、左旋肉碱1.9μg/mL和维生素E 90.16μg/mL。
表3优化后实验设计表
实施例3
无血清培养基外源添加成分确定
根据实施例2中得出的结论对无血清培养基外源添加成分进行确定，将约3×104个肌卫星细胞接种在100μL的96孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养72h，通过显微电镜观察细胞形态和用cck-8试剂盒检测细胞活力，评价无血清培养基基础培养基对肌卫星细胞增殖的影响。
基础培养基为DMEM/F12，第1组确定浓度的外源添加成分分别是亚油酸0.5μg/mL、胆固醇3.3μg/mL、叶酸5μg/mL、地塞米松2ng/mL、硫辛酸70ng/mL、TGFβ11.5ng/mL和肌醇5μg/mL、甲醇胺0.2μg/mL、黄体酮16.82ng/mL、左旋肉碱1.9μg/mL和维生素E 100μg/mL；第2组确定浓度的外源添加成分分别是亚油酸0.5μg/mL、胆固醇3.3μg/mL、叶酸5μg/mL、地塞米松2ng/mL、硫辛酸70ng/mL、TGFβ11.5ng/mL和肌醇5μg/mL、甲醇胺0.2μg/mL、黄体酮17.90ng/mL、左旋肉碱1.9μg/mL和维生素E 90.16μg/mL。
在此基础上，考虑到细胞对营养的需求，在此设计基础上也探究了不同浓度牛血清白蛋白对细胞增殖的影响，具体实验设计见表4。
结果如图3所示，在27℃无菌培养72h，第4组无血清培养基配方细胞形态正常，收获细胞量为7.8×105个/mL，细胞生长量约为对照组2(DMEM/F12，添加100μL/mLFBS)的87％左右，对照组2收获细胞量9.0×105个/mL。并且，根据图3也可知，随着牛血清白蛋白浓度的升高，细胞的增殖效果越好。
表4进一步优化后实验设计表
实施例4
进一步探究不同浓度牛血清白蛋白对细胞增殖影响
在上述实施例探究得到的无血清外源添加成分的基础上，进一步探究不同浓度牛血清白蛋白对细胞增殖的影响。将约3×104个肌卫星细胞接种在100μL的96孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养72h，通过显微电镜观察细胞形态和用cck-8试剂盒检测细胞活力，评价无血清培养基基础培养基对肌卫星细胞增殖的影响。具体实验设计见表5。
结果如图4所示，在27℃无菌培养72h，采用第3组无血清培养基配方细胞形态正常，收获细胞量为6.3×105个/mL，细胞生长量约为对照组(DMEM/F12，添加100μL/mL FBS)的95％左右，对照组2收获细胞量6.6×105个/mL。表明采用上述无血清培养基配方可在所需生长周期内实现正常细胞生长量。
表5不同浓度牛血清白蛋白对细胞增殖的影响实验设计表
实施例5
无血清培养基对细胞干性的影响
在上述实施例得到的最终无血清培养基配方的基础上，本发明还探究了得到的无血清培养基对细胞干性的影响。将约1×106个大黄鱼肌卫星细胞接种在500μL的48孔板的每个孔洞中，在27℃下无菌培养24h后，更换为分化培养基，分化5天后，进行结蛋白免疫荧光染色，最后通过融合指数来计算细胞的分化能力。
结果如图5所示，无血清培养基的融合指数约为9.6％，而有血清培养基的融合指数约为10.6％，无血清培养基和有血清培养基对细胞干性的维持效果一致，表明本发明得到的无血清培养基配方是可行的。
本发明提供的无血清培养基也适用于其他海洋鱼类或淡水鱼类。
实施例6
无血清培养基在人造肉中的应用
本实施例通过在基础培养基DMEM/F12的基础上加上牛血清白蛋白、亚油酸、胆固醇、叶酸、地塞米松、硫辛酸、TGFβ1、肌醇、甲醇胺、黄体酮、左旋肉碱、维生素E和HEPES等外源添加成分，形成一种无血清培养基。该培养基可以使大黄鱼肌卫星细胞正常增殖。细胞在27℃下培养72h，与含血清培养基(DMEM/F12，100μL/mL FBS)效果一致，细胞形态正常并维持了细胞干性，为人造肉制备提供足够的细胞。
成本计算，以500mL完全培养基为例，通用型培养基(DMEM/F12，100μL/mL FBS)需要约313元，而本发明的无血清培养基需要约210元，并且相较于现有的无血清培养基，本发明提供的无血清外源添加成分成本更低、外源添加成分更少且大多数都是简单易得常见的化合物。因此，利用上述无血清培养基可以降低培养成本，可以低成本的大规模培养大黄鱼肌卫星细胞，有利于产业转化。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种无血清培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和外源添加成分；所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基或F10培养基；所述外源添加成分包括左旋肉碱、亚油酸、胆固醇、维生素E、叶酸、地塞米松、黄体酮、硫辛酸、甲醇胺、TGFβ1、肌醇、牛血清白蛋白和HEPES。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述外源添加成分在所述无血清培养基中的质量浓度分别为：左旋肉碱0.1～30μg/mL、亚油酸0.05～15μg/mL、胆固醇0.1～33μg/mL、维生素E 2.5～750μg/mL、叶酸0.2～50μg/mL、地塞米松0.2～50ng/mL、黄体酮1～100ng/mL、硫辛酸3.5～700ng/mL、甲醇胺0.1～50μg/mL、TGFβ10.05～15ng/mL、肌醇0.5～200μg/mL、牛血清白蛋白0.1～20mg/mL和HEPES1～500mg/mL。
3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述外源添加成分在所述无血清培养基中的质量浓度分别为：左旋肉碱1.9μg/mL、亚油酸0.5μg/mL、胆固醇3.3μg/mL、维生素E 100μg/mL、叶酸5μg/mL、地塞米松2ng/mL、黄体酮16.82ng/mL、硫辛酸70ng/mL、甲醇胺0.2μg/mL、TGFβ11.5ng/mL、肌醇5μg/mL、牛血清白蛋白9mg/mL和HEPES4.766 mg/mL。
4.权利要求1～3任一项所述无血清培养基在体外培养动物干细胞或动物肌肉细胞中的应用。
5.权利要求1～3任一项所述无血清培养基在制备动物细胞培养肉中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述动物包括鱼；所述鱼包括大黄鱼。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述大黄鱼包括大黄鱼成鱼或大黄鱼幼鱼。
8.一种基于权利要求1～3任一项所述无血清培养基制备大黄鱼细胞培养肉的方法，包括以下步骤：
将大黄鱼肌卫星细胞接种到权利要求1～3任一项所述的无血清培养基中进行培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养时，大黄鱼肌卫星细胞的接种量为1×104～1×106个/mL无血清培养基。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为25℃～27℃；所述培养的时间为24～72h。
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