KR101443478B1 - 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제 및 그의 제조 방법 - Google Patents

간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 면역 억제능을 유지한 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 무혈청 또는 저혈청 배양에 의해 제조하는 것이다. FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 배지에 있어서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법이다.

Description

간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제 및 그의 제조 방법{Cell Preparation Containing Mesenchymal Stem Cell, and Method for Producing Same}
본 발명은, 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제 및 그의 제조 방법에 관한 것이며, 또한 이 제조 방법에 사용되는 배지용 첨가제, 배양 배지 및 키트, 및 이들을 이용한 배양 방법에 관한 것이다.
간엽계 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는 골수, 지방, 활막, 치조골, 치근막 등의 성인의 조직으로부터 뿐만 아니라, 태반, 제대혈, 탯줄의 여러 가지 세포 등으로부터 단리할 수 있고, 또한 생체 외에서 배양하여 증폭할 수 있다. 또한 간엽계 줄기 세포는, 복수의 간엽계(골아 세포, 지방 세포, 연골 세포) 뿐만 아니라, 비간엽계(신경 전구 세포, 간 세포) 계보의 세포로 분화 가능한 다분화능을 가지므로, 재생 의료나 세포 치료의 세포원으로서의 이용이 기대되고 있다.
종래, 간엽계 줄기 세포의 배양에는, 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 배지가 이용되고 있다. 소의 혈청에는 로트 차이가 있을 뿐만 아니라, 이종 동물 유래의 혈청 단백질이 간엽계 줄기 세포에 혼입되어, 이식 시에 면역 응답을 야기해 버린다고 하는 문제가 있다. 만일, 인간 혈청을 이용하여 배양했다고 해도, 개체 차이에 의해 안정된 배양이 곤란하고, 또 도너의 육체적 부담이 큰 데다가, 고액이 되어 버린다.
따라서, 보다 안전하고 안정된 품질의 간엽계 줄기 세포를 공급하기 위해서는, 그 배양 과정에서, 이종 동물 유래의 단백질의 혼입이 적은 무혈청 배지를 이용하는 것이 좋다는 것이 알려져 있다. 즉 간엽계 줄기 세포를 무혈청으로 배양해 증식시키는 것이 바람직하다. 특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1에는, 간엽계 줄기 세포의 무혈청 배양이 기재되어 있다. 특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1에 기재된 바와 같이 간엽계 줄기 세포를 무혈청 배양함으로써, 5 내지 15% FBS 함유 배지에 있어서의 간엽계 줄기 세포의 배양보다 우수한 증식 촉진 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 이 배양에 의해 다분화능을 유지(항진)한 간엽계 줄기 세포를 얻을 수 있다.
또한, 간엽계 줄기 세포는, 자신의 면역원성이 낮을 뿐만 아니라, 여러가지 면역 이펙터 세포(T 세포, B 세포, NK 세포, 수상 세포)의 기능에 영향을 미친다는 것이 나타나 있다(비특허 문헌 2 내지 5). 따라서, 면역 반응이 관련되는 여러 가지의 질환의 치료에, 간엽계 줄기 세포를 응용하는 것이 기대되고 있다(비특허 문헌 6). 비특허 문헌 7에는, 마우스 임파구 혼합 반응(MLR)에 의한 T 세포의 증식을, 간엽계 줄기 세포가 억제한다는 것이 기재되어 있다.
국제 공개 WO2007/080919호 팜플렛(2007년 7월 19일 공개)
가토 유키오, 제5회 의료기기 포럼 예고집, 33-35, 2007 Keating, A., Cell Stem Cell, 2, 106-108, 2008 Corcione, A. et. al., Blood 107, 367-372, 2006 Ramasamy, R. et. al., Transplantation 83, 71-76, 2007 Aggarwal, S. et. al., Blood 105, 1815-1822, 2005 Le Blanc K. et. al., J Intern Med., 262, 509-525, 2007 Djouad, F. et. al., Blood 102, 3837-3844, 2003
재생 의료에 대해서는, 이식 시의 면역 학문적 거절 반응이 중요한 문제이며, 이것을 억제하기 위해서 면역 억제제가 사용되고 있다. 그러나, 면역 억제제의 부작용 등이 문제가 되고 있었다. 한편, 간엽계 줄기 세포는 면역 억제능을 갖기 때문에, 이것을 이용하면, 면역 억제제를 사용할 필요가 없다. 따라서, 이종 단백질, 합성 배지가 혼입의 위험성이 낮은 무혈청 또는 저혈청 배양에 의해, 면역 억제능을 갖는 간엽계 줄기 세포를 얻을 수 있으면 유리하다. 특히, FBS 함유 배지는, 소 혈청 알부민의 양 뿐만 아니라, 알레르기성을 갖는 다른 가용성 물질이 혼재하고 있는 것으로부터도 문제가 있어, 이것을 포함하지 않는 배양 배지의 사용이 불가결하다.
본 발명은, 상기 문제점을 감안하여 이루어진 것이며, 그의 목적은, 면역 억제능을 유지한 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를, 무혈청 또는 저혈청 배양에 의해 제조하기 위한 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해서, 간엽계 줄기 세포의 면역 억제능에 미치는 무혈청 배양의 영향에 대해 예의 검토한 결과, 특정한 첨가제를 포함한 무혈청 배지에서 배양한 간엽계 줄기 세포가 면역 억제능을 유지하고 있고, 나아가, 그 면역 억제 효과가 향상되고 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 무혈청 배지 A에 있어서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제는, 상술한 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 배지용 첨가제는, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제이며, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 배양 배지는, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배양 배지이며, 상기 배지용 첨가제를 함유하고 있는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 배양 방법은, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 배양 방법이며, 상기 배양 배지에서 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 키트는, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 키트이며, 상기 배지용 첨가제를 적어도 구비하고 있는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 무혈청 배지 A에 있어서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하고 있으므로, 무혈청 또는 저혈청 배양에 의해서, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하는 것이 가능하다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 뛰어난 점은, 이하에 나타내는 기재 내용에 의해서 충분히 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이점은, 첨부 도면을 참조하여 다음의 설명으로 명백해질 것이다.
도 1은, MSCGM 배지에 있어서 마우스 유래 활성화 T 세포와 hMSC를 공배양했을 때의, 항CD3 및 항CD28 자극 T 세포 증식 반응에 대한 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 무혈청 배지 A에 있어서 마우스 유래 활성화 T 세포와 hMSC를 공배양했을 때의, 항CD3 및 항CD28 자극 T 세포 증식 반응에 대한 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은, MSCGM 배지에 있어서 마우스 유래 활성화 T 세포와 hMSC를 공배양했을 때의, 마이토젠 자극 T 세포 증식 반응에 대한 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 무혈청 배지 A에 있어서 마우스 유래 활성화 T 세포와 hMSC를 공배양했을 때의, 마이토젠 자극 T 세포 증식 반응에 대한 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 마우스 림프액 혼합 반응 자극 T 세포 증식 반응에 대한 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프(배양 3일째의 결과)이다.
도 6은, 마우스 림프액 혼합 반응 자극 T 세포 증식 반응에 대한 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프(배양 4일째의 결과)이다.
도 7은, 배양 개시부터 8일째의 지방 조직 유래 hMSC의 증식 상태를 나타내는 도면이다.
도 8은, 초기의 활막 유래 hMSC에 대한 배지 1 및 배지 2의 증식 촉진 효과를 나타내는 도면이며, (a)는, 배양 개시부터 12일째의 활막 유래 hMSC의 세포 수를 나타내는 그래프이며, (b)는, 배양 개시부터 12일째의 활막 유래 hMSC의 증식 상태를 나타내는 도면이다.
도 9는, 배양 개시 0일째부터 68일째까지의 활막 유래 hMSC의 세포 수의 경시적인 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은, 배양 개시부터 5일째의 골수 유래 hMSC(세포 1)의 증식 상태를 나타내는 도면이다.
도 11은, 배양 개시부터 5일째의 골수 유래 hMSC(세포 2)의 증식 상태를 나타내는 도면이다.
도 12는, 배양 개시부터 5일째의 골수 유래 hMSC(세포 3)의 증식 상태를 나타내는 도면이다.
도 13은, 정상 인간 피부 섬유아세포 및 인간 연골 육종 세포주의 증식에 대한 배지 1의 효과를 나타내는 그래프이며, (a)는, 배양 개시부터 14일째의 정상 인간 피부 섬유아세포의 콜로니 수를 나타내는 그래프이며, (b)는, 배양 개시부터 14일째의 인간 연골 육종 세포주의 콜로니수를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시의 형태에 대해서 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 이것으로 한정되는 것이 아니고, 기술한 범위 내에서 여러 가지의 변형을 추가한 형태로 실시할 수 있는 것이다. 또한 본 명세서에 대해 특별히 명시되지 않는 한, 수치 범위를 나타내는 「A 내지 B」는, 「A 이상, B 이하」를 의미한다.
상술한 바와 같이, 특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1에는, 혈청을 포함하지 않는 배지(무혈청 배지)에 있어서 증식성을 잃지 않고 세포를 배양하기 위한 배지가 기재되어 있다. 이 배지는, 특정의 증식 인자군, 인지질 및 지방산의 복합물을 기초 배지에 첨가한 것이며, 이것을 이용함으로써, 무혈청 조건 하에서도 10% 혈청의 경우와 동등 이상의 세포 증식 촉진 효과를 유도하고 있다. 또한, 이 배지에 있어서는, 간엽계 줄기 세포를, 분화능을 유지하고, 또한 그 유지능을 높인 채로 무혈청 배양하는 것이 가능하다. 또한 이 배지에 있어서는, 골수 유래의 MSC, 지방 유래의 MSC, 활막 유래의 MSC의 무혈청 배양이 가능하다.
본 발명에 의하면, 이러한, 무혈청 조건하에 있어서 간엽계 줄기 세포를 대량으로 증식시키는 것이 가능한 배지의 향상된 효과로서 면역 억제능의 유지 또는 항진된 간엽계 줄기 세포의 배양을 실현하는 것이며, 재생 의료 용도에 특히 유용한, 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하는 것을 가능하게 한다.
(1) 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법
본 발명은, 무혈청 조건하에 있어서 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포 제제의 제조 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 무혈청 배지 A에 있어서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 증식 공정과, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 면역 억제능을 유지 또는 향상된 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하고 있다.
(증식 공정)
본 발명에 따른 제조 방법의 증식 공정에 대해서는, 간엽계 줄기 세포를, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 무혈청 배지 A에서 배양하여, 간엽계 줄기 세포를 증식시킨다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, 「무혈청 배지」란, 혈청을 포함하지 않는 배지인 것이 의도되고 「무혈청 배양」이란, 혈청을 이용하지 않는 배양이라는 것이 의도된다. 또한, 「저혈청 배양」이란, 일반적인 혈청 함유 배지(예를 들면, 10% FBS 함유 배지)보다, 함유하는 혈청량이 적은 배지를 이용한 배양, 및 일반적인 혈청 함유 배지를 이용한 배양보다, 혈청 함유 배지를 이용한 배양 기간이 짧은 배양인 것이 의도된다.
본 명세서 중에서, 「세포 제제」는, 재생 의료용 재료로서 재생 의료 등에 이용되는, 세포를 제제화한 치료약이며, 세포를 원래 상태인 채 기능을 변화시키지 않고 제제화한 것 뿐만 아니라, 특정의 조건하에서 배양 및 증식시킴으로써, 분화능, 면역 억제능 등의 기능을 향상시킨 세포를 제제화한 것도 포함한다.
또한, 본 명세서 중에서, 「간엽계 줄기 세포」는, 골수, 지방 세포, 활막 세포, 치조골, 치근막 등의 성인의 조직으로부터 뿐만 아니라, 태반, 제대혈, 태아의 여러 가지의 세포 등으로부터 단리되는 것도 포함하여, 인간 간엽계 줄기 세포인 것이 바람직하지만, 래트, 마우스 등의 비인간 동물 유래 간엽계 줄기 세포이어도 좋다.
증식 공정에서 이용하는 무혈청 배지 A를 구성하기 위한 기초 배지는, 당해 분야에 있어서 주지의 동물 세포용 배지이면 특히 한정되지 않고, 바람직한 기초 배지로서는, 예를 들면, Ham's F12 배지, DMEM 배지, RPMI-1640 배지, MCDB 배지 등을 들 수 있다. 이러한 기초 배지는, 단독으로 사용되어도, 복수를 혼합하여 사용되어도 좋다. 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지 A를 구성하기 위한 기초 배지는, MCDB와 DMEM을 1:1의 비율로 혼합한 배지가 바람직하다.
일 실시 형태에 있어서, 상기의 기초 배지에, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 첨가한 무혈청 배지 A를 증식 공정에 이용하면 좋다. 기초 배지에 대한 FGF의 함유량은, 최종 농도로 0.1 내지 100 ng/ml인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 3 ng/ml이다. 기초 배지에 대한 PDGF의 함유량은, 최종 농도로 0.5 내지 100 ng/ml인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10 ng/ml이다. 기초 배지에 대한 TGF-β의 함유량은, 최종 농도로 0.5 내지 100 ng/ml인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10 ng/ml이다.
기초 배지에 대한 HGF의 함유량은, 최종 농도로 0.1 내지 50 ng/ml인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5 ng/ml이다. 기초 배지에 대한 EGF의 함유량은, 최종 농도로 0.5 내지 200 ng/ml인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 20 ng/ml이다. 기초 배지에 대한 인지질의 총함유량은, 최종 농도로 0.1 내지 30 ㎍/ml인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10 ㎍/ml이다. 기초 배지에 대한 지방산의 총함유량은, 기초 배지의 1/1000 내지 1/10인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1/100이다.
이러한 무혈청 배지 A를 사용함으로써, 이종 단백질의 혼입을 방지하면서, 혈청 함유 배지와 동등 이상의 증식 촉진 효과가 얻어져 간엽계 줄기 세포를 목적으로 하는 대로 증식시킬 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법의 증식 공정에 있어서, 무혈청 배지 A가 함유하고 있는 인지질로서는, 예를 들면, 포스파티딘산, 리소포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤 등을 들 수 있고 이러한 인지질을 단독으로 함유하여도, 조합하여 함유하여도 좋다. 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지 A는, 포스파티딘산과 포스파티딜콜린을 조합하여 함유하고 있어도 좋고, 이러한 인지질은, 동물 유래이어도, 식물 유래이어도 좋다.
무혈청 배지 A가 함유하고 있는 지방산으로서는, 예를 들면, 리놀산, 올레인산, 리놀레인산, 아라키돈산, 미리스틴산, 팔미토레인산, 팔미틴산 및 스테아린산 등을 들 수 있고 본 실시 형태에 따른 배지용 첨가제는 이러한 지방산을 단독으로 함유하여도, 조합하여 함유하여도 좋다. 또한, 본 실시 형태에 따른 무혈청 배지 A는, 상기 지방산 이외에 추가로 콜레스테롤을 함유하고 있어도 좋다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, FGF는, 섬유아세포 증식 인자(FGF: fibroblast growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되어 FGF-2(bFGF)인 것이 바람직하지만, FGF-1 등 다른 FGF 패밀리로부터 선택되어도 좋다. 또한, 본 명세서 중에서 사용되는 경우, PDGF는, 혈소판 유래 증식 인자(PDGF: platelet derived growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되어 PDGF-BB 또는 PDGF-AB인 것이 바람직하다. 또한 본 명세서 중에서 사용되는 경우, TGF-β는, 트란스포밍 증식 인자-β(TGF-β: transforming growth factor-β) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되어 TGF-β3인 것이 바람직하지만, 다른 TGF-β패밀리로부터 선택되어도 좋다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, HGF는, 간세포 증식 인자(hepatocyte growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되고, EGF는, 표피 증식 인자(EGF: epidermal growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도된다.
또한, 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지 A는, 결합 조직 증식 인자(CTGF: connective tissue growth factor), 혈관 내피 증식 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor) 및 아스코르빈산 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 인자를 추가로 함유하고 있어도 좋다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, 아스코르빈산 화합물은, 아스코르빈산(비타민 C) 혹은 아스코르빈산 2 인산, 또는 이것들과 유사한 화합물이 의도된다.
또한, 무혈청 배지 A에 함유되어 있는 상술한 증식 인자는, 천연의 것이어도, 유전자 재조합에 의해 제조된 것이어도 좋다.
하나의 국면에 있어서, 무혈청 배지 A는, 지방질 산화 방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지 A에 함유되는 지방질 산화 방지제는, DL-α-토코페롤아세테이트(비타민 E)일 수 있다. 무혈청 배지 A는 또한, 계면 활성제를 추가로 함유하고 있어도 좋다. 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지 A에 함유되는 계면 활성제는 Pluronic F-68 또는 Tween 80일 수 있다.
무혈청 배지 A는, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 추가로 함유하고 있어도 좋다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 인슐린은, 인슐린양 증식 인자이어도 좋고, 천연의 세포 유래이어도, 유전자 재조합에 의해서 제조된 것이어도 좋다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 추가로 덱사메타존, 혹은 다른 글루코코르티코이드를 함유하고 있어도 좋다.
증식 공정에 있어서는, 상술한 무혈청 배지 A에, 인간 등의 동물 조직 또는 세포로부터 종래 공지된 방법에 의해 단리된 간엽계 줄기 세포를 파종하여, 목적으로 하는 수로 증식될 때까지 배양한다. 배양 조건으로서 배지 1 ml에 대해서 1 내지 2×104개의 간엽계 줄기 세포를 파종하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 배양 시간은 48 내지 96시간, 그리고 5% CO2 이하인 것이 바람직하다. 이와 같이 배양함으로써, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 효율적으로 대량으로 얻을 수 있다.
증식 공정에서는, 배양에 이용하는 배양 용기는, 간엽계 줄기 세포가 증식 할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 팔콘제 75 cm2 플라스크, 스미토모 베이크라이트제 75 cm2 플라스크 등을 매우 적합하게 이용할 수 있다. 단, 세포에 따라서는, 이용하는 배양 용기의 종류에 따라 세포의 증식이 영향을 받는 경우가 있다. 이 때문에, 간엽계 줄기 세포를 보다 효율적으로 증식시키기 위해서, 증식 공정에서 증식시키는 대상이 되는 간엽계 줄기 세포(이하, 「증식 대상 세포」라고도 한다) 마다, 증식에 적합한 배양 용기를 이용하여 증식 공정을 실시하는 것이 바람직하다.
증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로서는, 예를 들면, 최적인 배양 용기를 증식 대상 세포에 선택시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로 설명하면, 복수 종류의 배양 용기를 준비하여, 배양 용기의 종류가 다른 것 이외는 동일한 배양 조건으로 증식 대상 세포를 증식시키고, 배양 개시부터 2주일 후의 세포 수를 공지된 방법에 따라 계측하여, 세포 수가 많은 것으로부터 순서대로 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기라고 판단할 수 있다. 또한, 증식 대상 세포의 증식 속도가 빠른 경우는, 배양 개시부터 2주일이 경과하기 전이어도, 콘플루언트 상태의 80 내지 90%의 세포 수에 이르는 기간이 짧은 것부터 순서대로 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기라고 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법의 증식 공정에 있어서는, 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기가 이미 밝혀져 있는 경우는, 그 배양 용기를 이용하면 좋다. 이것에 대하여, 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기가 밝혀지지 않은 등의 경우에는, 본 발명에 따른 제조 방법은, 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기를 선택하기 위한 「배양 용기 선택 공정」(후술 한다)을 증식 공정 전에 추가로 포함하고 있어도 좋다.
또한 간엽계 줄기 세포의 증식에는, 세포가 배양 용기에 접착하는 것이 필수 조건이므로, 배양 용기에 대한 증식 대상 세포의 접착이 약한 경우는, 증식 공정에 있어서, 상기 무혈청 배지 A에, 세포 접착 분자를 추가로 함유시키는 것이 바람직하다. 상기 「세포 접착 분자」로서는, 예를 들면, 피브로넥틴, 콜라겐, 젤라틴 등을 들 수 있다. 이러한 세포 접착 분자는, 1종류를 단독으로 이용해도 좋고, 복수 종류를 조합하여 이용해도 좋다.
무혈청 배지 A에 대한 세포 접착 분자의 함유량은, 최종 농도로 1 내지 50 ㎍/ml인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5㎍/ml이다. 일 실시 형태에 있어서, 세포 접착 분자로서 피브로넥틴을 이용하는 경우는, 무혈청 배지 A에 대한 피브로넥틴의 최종 농도가 5㎍/ml가 되도록 첨가함으로써, 배양 용기에 대한 증식 대상 세포의 접착 효율을 향상시킬 수 있다.
또한, 증식 공정에서는, 간엽계 줄기 세포를 적어도 1회 계대하여도 좋다. 간엽계 줄기 세포는 발판 의존적으로 증식하므로, 간엽계 줄기 세포가 국소적으로 치우쳐 증식하고 있는 등의 경우에, 증식 공정 도중에 간엽계 줄기 세포를 계대함으로써 배양 조건을 개선할 수 있다.
간엽계 줄기 세포의 계대 방법으로서는 특별히 한정되지 않고, 종래 공지된 간엽계 줄기 세포의 계대 방법을 이용하여 계대할 수 있다. 계대 후의 간엽계 줄기 세포 상태가 양호하므로, 상기 증식 공정에서는, 계대를 실시하는 경우에 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제를 이용하여 상기 간엽계 줄기 세포를 박리하는 것이 바람직하다. 상기 「포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제」로서는, 예를 들면, ACCUTASE(Innovative Cell Technologies, Inc.)를 들 수 있다.
여기서, 상기 「포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제」로서 ACCUTASE를 이용하는 경우의 계대 방법의 일례를 설명한다. (i) 내지 (vi)의 순서에 따라 간엽계 줄기 세포를 박리하여, 계대한다. 또한 이하에 설명하는 계대 방법에서는, 배양 용기로서 T-25 플라스크(팔콘제)를 이용하였다고 가정한다.
(i) 세포층을 PBS(-) 5 mL를 이용하여 세정한다.
(ii) ACCUTASE를 2 mL 첨가한다.
(iii) 실온에서 2분 정도 정치하고, 세포의 박리를 확인한 후 원심관으로 세포 부유액을 옮긴다.
(iv) 배양 용기에 PBS(-)를 7 mL 첨가하여, 플라스크 저면을 린스한다.
(v) 상기(iii)의 원심관에 상기(iv)의 용액을 옮겨, 1500 rpm(200×g)로 5분간 원심한다.
(vi) 상청을 제거하고, 5,000개/cm2의 파종 농도에서, 무혈청 배지 A를 이용하여 파종한다.
또한 증식 공정에는, 인간 등의 동물 조직으로부터 채취하고 나서 계대 1회째(P1) 이후의 간엽계 줄기 세포를 제공하는 것이 바람직하다.
(스크리닝 공정)
본 발명에 따른 제조 방법의 스크리닝 공정(「 제1 스크리닝 공정」이라고도 한다. )에서는, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝한다. 상술한 무혈청 배지 A에서 증식한 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포는, 면역 억제능이 적어도 유지되어 있고, 또한 면역 억제능이 항진되어 있다. 따라서, 이러한 간엽계 줄기 세포를, 면역 억제능을 기준으로 하여 스크리닝함으로써, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 선별할 수 있다. 그리고, 선별한 간엽계 줄기 세포를 세포 제제로서 사용함으로써, 면역 억제제를 병용하지 않고, 면역 학문적 거절 반응을 억제한 간엽계 줄기 세포의 이식 치료가 실현된다.
상술한 무혈청 배지 A는 이종 단백질을 포함하지 않으며, 또한 당해 배지에서 배양한 간엽계 줄기 세포는 간세포로서의 기능을 유지하고 있다. 또한, 상술한 무혈청 배지 A에서 배양한 간엽계 줄기 세포는, 소 태아 혈청 함유 배지에서 배양한 간엽계 줄기 세포와 비교하여, 증식능이 높고, 또한 면역 억제 효과를 나타내는 활성도 높다. 따라서, 상술한 무혈청 배지 A에서 배양한 간엽계 줄기 세포를 이식 치료에 이용했을 경우, 그 특성을 유지하는 세포가 증가함과 함께, 개개의 세포의 활성도 높으므로, 상승 효과를 기대할 수 있다.
한편, 본 발명자들은, 상술한 무혈청 배지 A의 증식능의 효과로부터 염려되는 종양 형성성에 대해서, in vitro의 연한천 배양법과 in vivo의 고감도 면역 부전 마우스(NOG 마우스)에 의한 종양 형성성 시험법에 의해 각각 검토하였다. 구체적으로는, 3 로트의 활막 유래의 인간 간엽계 줄기 세포와 1 로트의 골수 유래의 인간 간엽계 줄기 세포를 상술한 무혈청 배지 A에서 배양하여, 배양 세포 1,000,000개를 연한천 배양용의 배지 및 NOG 마우스의 피하 10개소에 이식하였다. 그 결과, 연한천 배양에서는 Hela 세포 1,000개의 이식으로 종양 콜로니가 인정되는데 반해, 간엽계 줄기 세포의 3 로트는 모두 음성이었다. 한편, NOG 마우스에서는, 불과 1개의 HepG2 세포가 혼재하고 있어도 종양 결절이 검출되는 실험 조건하이더라도, 어떤 이식 조직에서도 종양 결절이 발견되지 않았다(데이터 표시하지 않음). 이것으로부터도, 본 발명에 의해 제조한 세포 제제가 이식 치료에 있어서의 유용성은 명확하다.
본 명세서 중에서, 「면역 억제능」이란, 이종 또는 동종의 세포 등을 타가 이식했을 때에 생기는 면역 거절 반응을 억제하는 능력이며, T 세포의 증식을 억제하는 등, 여러가지 면역 이펙터 세포의 기능에 영향을 미침으로써 이것들에 기인하는 면역 반응을 억제하는 능력을 의도하고 있다. 이것은 항염증능의 일부이다. 본 명세서 중에서, 「면역 억제능을 유지한」이란, 간엽계 줄기 세포가 본래 갖는 면역 억제능이 상기 증식 공정에 의해 잃지 않는 것을 의도하고 있고, 「면역 억제능을 향상한」이란, 상기 증식 공정 전후에 간엽계 줄기 세포가 갖는 면역 억제능이 향상되어 있는 것을 의도하고 있다.
스크리닝 공정에 대해서는, 상기 증식 공정 후의 무혈청 배지 A에 있어서, 증식한 간엽계 줄기 세포와 면역 세포를 공배양하고, 공배양 후의 배지 속의 면역 세포수를 평가함으로써, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝할 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 예를 들면, 면역 세포로서 T 세포를 이용했을 경우에는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, T 세포의 증가량 또는 사이토카인의 생산량을 평가하고, 면역 세포로서 B 세포 또는 활성화 NK 세포를 이용했을 경우에는, 이러한 세포의 증가량을 평가함으로써, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝할 수 있다. 또한, 면역 세포로서 수상 세포를 이용했을 경우에는, 그 분화, 성숙, 활성화 등을 평가함으로써, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크리닝에 이용하는 면역 세포는, T 세포, B 세포, 또는 활성화 NK 세포인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 T 세포 또는 B 세포이며, 가장 바람직하게는 T 세포이다.
(제2 스크리닝 공정)
본 발명에 따른 제조 방법은, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 제2 스크리닝 공정을 추가로 포함하고 있어도 좋다.
상술한 무혈청 배지 A에 있어서 증식한 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포는, 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포가 선택적으로 증가하고 있다. 따라서, 이러한 간엽계 줄기 세포를, 종양 형성성을 기준으로 하여 스크리닝함으로써, 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포를 선별할 수 있다. 그리고, 선별한 간엽계 줄기 세포를 세포 제제로서 사용함으로써, 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포의 이식 치료가 실현된다. 그러므로, 본 발명은, 무혈청 조건하에 있어 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법을 제공할 수도 있다.
간엽계 줄기 세포가 종양 형성성을 가지고 있는지 여부에 대해서는, 상기 「스크리닝 공정」에서 설명한 바와 같이, 종래 공지된 in vitro의 연한천 배양법, in vivo의 고감도 면역 부전 마우스(NOG 마우스)에 의한 종양 형성성 시험법 등에 의해 확인할 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 즉, 본 명세서 중에서, 「종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포」란, 상술한 종양 형성성의 유무를 확인하는 방법에 의해 종양 형성성을 갖지 않는 것이 확인된 간엽계 줄기 세포를 의도하고 있다.
또한 본 발명에 따른 제조 방법에서, 제2 스크리닝 공정을 추가로 포함하는 경우, 상기 제 1 스크리닝 공정과 해당 제 2 스크리닝 공정을 실시하는 순서는 특별히 제한되지 않는다. 즉 제2 스크리닝 공정 전에 제1 스크리닝 공정을 실시해도 좋고, 제2 스크리닝 공정 다음에 제1 스크리닝 공정을 실시해도 좋다.
(혈청 배양 공정)
본 발명에 따른 제조 방법은, 게다가 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포를, 스크리닝 공정 전에, 혈청 함유 배지에서 배양하는 혈청 배양 공정을 포함하고 있어도 좋다. 혈청 배양 공정에서는, 증식 공정에서 무혈청 배양한 간엽계 줄기 세포를, 혈청 함유 배지에서 배양한다. 혈청 배양 공정을 실시하는 경우, 혈청 배양 공정 후의 간엽계 줄기 세포를 스크리닝 공정에 사용한다.
혈청 배양 공정에서 사용하는 혈청 함유 배지로서는, 종래 공지된 혈청 함유 배지를 사용하는 것이 가능하고, 상술한 기초 배지에 10% FBS를 첨가한 10% FBS 함유 배지를 혈청 함유 배지로서 사용해도 좋다. 혈청 배양 공정에서는, 이러한 혈청 함유 배지에, 증식 공정에서 얻어진 간엽계 줄기 세포를 파종하여 배양한다. 배양 조건으로서 배지 1 ml에 대해서 간엽계 줄기 세포의 수가 1 내지 2×104개인 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 배양 시간은 48 내지 96시간, 그리고 5% CO2 이하인 것이 바람직하다. 이와 같이 배양함으로써, 보다 조기에 면역 억제능을 발휘하는 간엽계 줄기 세포를 효율적으로 대량으로 얻을 수 있다.
그리고, 혈청 함유 배지에서 배양한 간엽계 줄기 세포를 스크리닝 공정에 사용하여, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 선별한다.
이와 같이, 간엽계 줄기 세포를, 무혈청 배지 A에서 전 배양한 후, 혈청 함유 배지에서 본 배양함으로써, 전 배양 및 본 배양 모두 혈청 함유 배지에서 배양했을 경우와 동등 이상의 면역 억제 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 간엽계 줄기 세포의 면역 억제 효과를 보다 조기에 발휘시킬 수 있다. 또한, 혈청을 사용하는 것은 본 배양시 뿐이므로, 혈청의 함유량이 적어, 저혈청 배양을 실현할 수 있다.
(전 증식 공정)
본 발명에 따른 제조 방법은, 상기 증식 공정 전에, FGF, PDGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 무혈청 배지 B에서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 전 증식 공정을 추가로 하여도 좋다.
여기서, 상기 「무혈청 배지 B」는, HGF 및 TGF-β를 함유하고 있지 않은 점에서, 상기 「증식 공정」 항에서 설명한 무혈청 배지 A와는 다르다. HGF 및 TGF-β이외의 성분(FGF, PDGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산) 및 기초 배지에 대해서는, 상기 「증식 공정」 항에서 무혈청 배지 A에 관해서 설명한 바와 같으므로, 여기에서는 설명을 생략한다.
또한, 하나의 국면에서, 무혈청 배지 B는, 무혈청 배지 A와 마찬가지로, 지방질 산화 방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 무혈청 배지 B는, 계면 활성제를 더 함유하고 있어도 좋다. 또한, 무혈청 배지 B는, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 더 함유하고 있어도 좋다. 또한, 무혈청 배지 B는, 추가로 덱사메타존, 혹은 다른 글루코코르티코이드를 함유하고 있어도 좋다. 이러한 성분에 대해서도, 상기 「증식 공정」 항에서 무혈청 배지 A에 관해서 설명한 바와 같으므로, 여기에서는 설명을 생략한다.
또한, 무혈청 배지 B에 함유되어 있는 상기 성분의 함유량은, 상기 「증식 공정」 항에서 무혈청 배지 A에 관해서 설명한 함유량의 범위 내이면, 무혈청 배지 A에 함유되어 있는 각 성분의 함유량과 동일하여도 좋고, 상이하여도 좋다.
전 증식 공정에서는, 상술한 무혈청 배지 B에, 인간 등의 동물 조직으로부터 종래 공지된 방법에 의해 단리된 간엽계 줄기 세포를 파종하여, 목적으로 하는 수로 증식될 때까지 배양한다. 배양 조건으로서 배지 1 ml에 대해서 1 내지 500 mg의 조직편(MSC를 포함)을 분리하여, 간엽계 줄기 세포를 파종하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 배양 시간은 3 내지 14일간, 그리고 5% CO2 이하인 것이 바람직하다.
전 증식 공정에 사용되는 간엽계 줄기 세포에 특별히 제한은 없지만, 초기의 간엽계 줄기 세포, 즉, 인간 등의 동물 조직으로부터 채취하고 나서 한번도 계대 배양을 거치지 않은 세포인 것이 바람직하다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 증식 공정에 사용하기 전에 무혈청 배지 B에서 초기의 간엽계 줄기 세포를 미리 증식시킴으로써, 증식 공정에서 얻어지는 간엽계 줄기 세포의 수를 매우 현저하게 증폭시키는 것이 가능해진다.
일 실시 형태에 있어서, 전 증식 공정에서의 간엽계 줄기 세포의 배양 방법으로서는, 예를 들면, 2×105개/cm2의 파종 농도로 무혈청 배지 B에서 간엽계 줄기 세포를 파종하고, 그 후 1주일 정도는, 파종시 배양액량의 10%의 무혈청 배지 B를 2일 마다 추가하여 첨가하여, 세포 수가 콘플루언트 상태의 70 내지 80%가 될 때까지 세포를 증식시킨다. 이와 같이 무혈청 배지 B에서 미리 배양한 간엽계 줄기 세포를 증식 공정에 사용함으로써, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 효율적으로 대량으로 얻을 수 있다.
또한, 전 증식 공정에서 간엽계 줄기 세포를 보다 효율적으로 증식시키기 위해서, 전 증식 공정에서 증식시키는 대상이 되는 간엽계 줄기 세포(이하, 「전 증식 대상 세포」라고도 한다) 마다, 증식에 적합한 배양 용기를 이용하여 전 증식 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 전 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로서는, 상기 「증식 공정」 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
또한, 증식 공정과 마찬가지로, 전 증식 공정에서는, 배양 용기에 대한 전 증식 대상 세포의 접착이 약한 경우에, 상기 무혈청 배지 B에, 세포 접착 분자를 더 함유시켜도 좋다. 상기 세포 접착 분자에 대해서는, 상기 「증식 공정」 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
또한, 증식 공정과 마찬가지로, 전 증식 공정에서는, 간엽계 줄기 세포를 적어도 1회 계대하여도 좋다. 전 증식 공정 도중에 간엽계 줄기 세포를 계대함으로써 배양 조건을 개선할 수 있다. 또한 전 증식 공정은, 초대 배양(P0) 내지 계대 3번째(P3)까지의 기간에 실시하는 것이 바람직하다. 전 증식 공정 도중에 간엽계 줄기 세포를 계대하는 방법 및 전 증식 공정 후의 세포를 증식 공정에 사용할 때의 계대 방법에 대해서는, 상기 「증식 공정」 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
(배양 용기 선택 공정)
본 발명에 따른 제조 방법은, 상기 증식 공정의 전(또는 상기 전 증식 공정 전)에, 간엽계 줄기 세포의 증식에 적합한 배양 용기를 선택하는 배양 용기 선택 공정을 더 포함하고 있어도 좋다. 간엽계 줄기 세포의 증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로서는, 상기 「증식 공정」 항에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
(2) 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제
본 발명은, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제를 제공한다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하고 있다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제는, 종래 공지된 기초 배지에 첨가하여, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청 배지(무혈청 배지 A)로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 배지용 첨가제가 함유하고 있는 인지질로서는, 예를 들면, 포스파티딘산, 리소포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤 등을 들 수 있고, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 이러한 인지질을 단독으로 함유하여도, 조합하여 함유하여도 좋다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 포스파티딘산과 포스파티딜콜린을 조합하여 함유하고 있다. 또한, 이러한 인지질은, 동물 유래이어도, 식물 유래이어도 좋다.
본 실시 형태에 따른 배지용 첨가제가 함유하고 있는 지방산으로서는, 예를 들면, 리놀산, 올레인산, 리놀레인산, 아라키돈산, 미리스틴산, 팔미토레인산, 팔미틴산 및 스테아린산 등을 들 수 있고, 본 실시 형태에 따른 배지용 첨가제는 이러한 지방산을 단독으로 함유하여도, 조합하여 함유하여도 좋다. 또한, 본 실시 형태에 따른 배지용 첨가제는, 상기 지방산 이외에 추가로 콜레스테롤을 함유하고 있어도 좋다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, FGF는, 섬유아세포 증식 인자(FGF: fibroblast growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되어 FGF-2(bFGF)인 것이 바람직하지만, FGF-1 등 다른 FGF 패밀리로부터 선택되어도 좋다. 또한, 본 명세서 중에서 사용되는 경우, PDGF는, 혈소판 유래 증식 인자(PDGF: platelet derived growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되어 PDGF-BB 또는 PDGF-AB인 것이 바람직하다. 또한 본 명세서 중에서 사용되는 경우, TGF-β는, 트란스포밍 증식 인자-β(TGF-β: transforming growth factor-β) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되어 TGF-β3인 것이 바람직하지만, 다른 TGF-β패밀리로부터 선택되어도 좋다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, HGF는, 간세포 증식 인자(hepatocyte growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되고, EGF는, 표피 증식 인자(EGF:epidermal growth factor) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도된다.
또한, 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지 A는, 결합 조직 증식 인자(CTGF:connective tissue growth factor), 혈관 내피 증식 인자(VEGF:vascular endothelial growth factor) 및 아스코르빈산 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 인자를 더 함유하고 있어도 좋다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, 아스코르빈산 화합물은, 아스코르빈산(비타민 C) 혹은 아스코르빈산 2인산, 또는 이것들과 유사한 화합물이 의도된다.
또한, 본 발명에 따른 배지용 첨가제에 함유되어 있는 증식 인자는, 천연의 것이어도, 유전자 재조합에 의해서 제조된 것이어도 좋다.
하나의 국면에서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는, 지방질 산화 방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 일 실시 형태에 있어서, 본 실시 형태에 따른 배지용 첨가제에 함유되는 지방질 산화 방지제는, DL-α-토코페롤아세테이트(비타민 E)일 수 있다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 또한, 계면 활성제를 더 함유하고 있어도 좋다. 일 실시 형태에 있어서, 본 실시 형태에 따른 배지용 첨가제에 함유되는 계면 활성제는 Pluronic F-68 또는 Tween 80일 수 있다.
본 발명에 따른 배지용 첨가제는, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 더 함유하고 있어도 좋다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 인슐린은, 인슐린양 증식 인자이어도 좋고, 천연의 세포 유래이어도, 유전자 재조합에 의해서 제조된 것 이어도 좋다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제는 추가로 덱사메타존, 혹은 다른 글루코코르티코이드를 함유하고 있어도 좋다.
(3) 동물 세포를 무혈청 배양하기 위한 키트
본 발명은, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제를 제공한다. 본 발명에 따른 배지용 첨가제(배지용 첨가제 A)는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하고 있다. 또한, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는, 세포 접착 분자를 더 함유하고 있어도 좋다.
본 발명에 따른 배지용 첨가제 키트는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 동일 용기 내에 구비하고 있어도, 이러한 성분을 따로 따로 구비하고 있어도 좋다. 또한, 본 발명에 따른 배지용 첨가제 키트는, 세포 접착 분자를 더 함유하고 있어도 좋다.
상기 세포 접착 분자에 대해서는, 본 명세서에서의 상기 「(1) 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법」 항의 「증식 공정」에서 설명한 바와 같으므로 여기에서는 설명을 생략한다.
본 발명에 따른 배지용 첨가제 키트는, 종래 공지된 기초 배지에 첨가하여, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청 배지(무혈청 배지 A)로서 사용할 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, 「조성물」은 각 주성분이 1물질 중에 함유되어 있는 형태이며, 「키트」는 각 주성분의 적어도 하나가 별도 물질 중에 함유되어 있는 형태인 것이 의도된다. 따라서, 본 발명에 따른 배지용 첨가제 키트에 구비되어 있는 증식 인자, 인지질 및 지방산은, 배지용 첨가제에 대해 상술한 것과 동일하다는 것이 용이하게 이해된다.
또한, 본 발명에 따른 키트는, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 키트이며, 본 발명에 따른 배지용 첨가제(배지용 첨가제 A)를 적어도 구비하고 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는, FGF, PDGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 배지용 첨가제 B를 더 구비하고 있어도 좋다. 또한 「무혈청 배지 B」에 대한 설명을 「배지용 첨가제 B」에 대한 설명으로서 바꿔 읽을 수 있다.
(4) 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배양 배지
본 발명은, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배양 배지를 제공한다. 본 발명에 따른 배양 배지는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하고 있다. 본 발명에 따른 배양 배지는, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청 배지(무혈청 배지 A)로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 배양 배지는, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하고 있으면 되고, 이러한 성분은 기초 배지에 동시에 첨가되어도 따로 따로 첨가되어도 좋다. 즉, 본 발명에 따른 배양 배지는, 상술한 배지용 첨가제에 함유되어 있는 성분 또는 배지용 첨가제 키트 중에 구비되어 있는 성분을 포함하고 있으면 좋다고 할 수 있다.
본 발명에 따른 배양 배지를 구성하기 위한 기초 배지는, 해당 분야에서 주지의 동물 세포용 배지이면 특별히 한정되지 않고, 바람직한 기초 배지로서는, 예를 들면, Ham's F12 배지, DMEM 배지, RPMI-1640 배지, MCDB 배지 등을 들 수 있다. 이러한 기초 배지는, 단독으로 사용되어도, 복수를 혼합하여 사용되어도 좋다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 배양 배지를 구성하기 위한 기초 배지는, MCDB와 DMEM을 1:1의 비율로 혼합한 배지가 바람직하다.
(5) 세포 제제를 제조하기 위한 배양 방법
본 발명은, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 배양 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 배양 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하고 있는 무혈청 배지(무혈청 배지 A) 중에서 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정(배양 공정 A)을 포함하고 있다. 본 발명에 따른 배양 방법은, 간엽계 줄기 세포를 배양할 때에, 상술한 무혈청의 배양 배지를 이용하면 좋다고 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 배양 방법은, 상기 배양 공정 A 전에, FGF, PDGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 무혈청 배지 B에서, 간엽계 줄기 세포를 배양하는 공정(배양 공정 B)을 더 포함하고 있어도 좋다.
또한 상기 「배양 공정 A」 및 상기 「배양 공정 B」는, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법에 있어서의 「증식 공정」 및 「전 증식 공정」에 각각 대응하고 있다. 이 때문에, 본 명세서에 있어서의 상기 「(1) 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법」 항의 「증식 공정」 및 「전 증식 공정」에 대한 설명을, 각각, 「배양 공정 A」 및 「배양 공정 B」에 대한 설명으로서 바꿔 읽을 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 배양 방법은, FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을, 기초 배지에 동시에 첨가하는 공정을 포함해도 좋다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 배양 방법은, FGF, PDGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을, 기초 배지에 동시에 첨가하는 공정을 포함해도 좋다. 상기 기초 배지는, 상술한 바와 같이 해당 분야에서 주지의 동물 세포용 배지이면 특별히 한정되지 않는다.
(6) 추가의 용도
상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 무혈청 또는 저혈청 배지이더라도 혈청 함유 배지에서 배양했을 경우와 동등 또는 그 이상의 속도로, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 것이 가능한 데다가, 증식시킨 간엽계 줄기 세포의 면역 억제능이 유지 또는 향상된다. 또한 본 발명에서 증식시킨 간엽계 줄기 세포는, 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포가 선택적으로 증가하고 있다. 또한 본 발명에 대해 증식시킨 간엽계 줄기 세포는, 분화능이 유지 또는 향상되어 있다(특허 문헌 1 참조). 따라서 이러한 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 환자에게 투여했을 경우, 간엽계 줄기 세포에 의한 우수한 이식 치료를 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 이식 치료의 큰 문제의 하나인 면역 거절 반응을 효과적으로 억제하여, 환자의 부담을 경감함과 동시에, 안정된 치료를 실현할 수 있다. 또한, 혈청을 이용하여 제조한 종래의 세포 제제와 비교하고, 혈청의 로트 차이를 고려할 필요가 없어, 이식 치료에서 안정된 치유율을 실현할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 제조한 세포 제제에 포함되는 간엽계 줄기 세포는, 간엽계 줄기 세포가 본래 갖는 면역 이펙터 세포에 영향을 미치는 기능을 유지하고 있다고 할 수 있으므로, 더욱 해당 간엽계 줄기 세포는 면역 조절 작용 및 면역 관용 작용을 가지며, 이러한 작용을 기대한 치료에도 본 발명에 의해 제조한 세포 제제를 적용하는 것을 기대할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 세포 제제에 의하면, 간엽계 줄기 세포의 항염증 작용에 의해, 이식 치료에 있어서의 항염증제로서의 기능도 기대할 수 있다. 또한, 본세포 제제에는, 항염증 작용에 의한 노화 억제 효과도 기대된다.
또한, 본 발명에 의해 제조한 세포 제제는, 간엽계 줄기 세포의 이식을 필요로 하는 부분에 투여(국소 투여)하는 국소 질환의 치료뿐만 아니라, 정맥내 등에 투여하여 전신에 운반시키는 전신 투여에 의해, 골수 이식 등에 의해 야기되는 급성 GVHD 등에 의한 강한 면역 거절 반응에 대한 치료를 보다 효과적으로 실시하여, 인간의 구명율을 현저하게 향상시키는 것이 기대된다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 세포 제제는, 무혈청 배양에 의해 제조한 것이므로, 유용한 성장 인자나 분화 인자가 혈청 단백질과 함께, 세라믹스 등의 이식 재료에 비특이적으로 흡착되지 않는다. 따라서, 본 발명에 의해 제조한 세포 제제의 이식에 의한 조직 재생 능력은 한층 높고, 그 결과, 치료 효과도 높다. 게다가 국소 투여와 전신 투여를 병합한 치료도 할 수 있는 것은 말할 필요도 없다.
또한, 본 발명에 의해 제조한 세포 제제에 포함되는 간엽계 줄기 세포는, 면역 억제능을 유지 또는 향상하고 있고, 이식 시의 면역 거절 반응을 억제하므로, 자기 이외의 조직 및 세포를 타인에게 이식하는(도너와 레시피언트가 다르다) 타가 이식에 의한 치료에 적용하는 것이 가능하다. 또한 인간 조직 또는 인간 세포를 이용한 알로 이식(동종 이식) 뿐만 아니라, 인간 이외의 동물 조직 또는 동물 세포를 이용한 제노 이식(이종 이식)에도 매우 적합하게 사용 가능하다고 할 수 있다.
또한 본 발명에 의해 제조한 세포 제제는, 종래의 혈청 함유 배지만을 이용하여 얻어진 간엽계 줄기 세포보다 조기에 면역 억제 효과를 발휘시키므로, 이식 시에 치료 효과를 조기에 발현시키는 것이 기대되어 치유율의 증가가 전망된다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포를, 상기 스크리닝 공정 전에, 혈청을 포함한 배지에서 배양하는 혈청 배양 공정을 더 포함하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, 상기 증식 공정 전에, FGF, PDGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 무혈청 배지 B에서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 전 증식 공정을 더 포함하고 있는 것이 바람직하다.
상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 제2 스크리닝 공정을 더 포함하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, 상기 증식 공정에 있어서, 상기 간엽계 줄기 세포의 증식에 적합한 배양 용기를 이용하여 해당 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, 상기 증식 공정에 있어서, 상기 무혈청 배지 A에, 세포 접착 분자를 더 함유시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, 상기 증식 공정에 있어서, 상기 간엽계 줄기 세포를 적어도 1회 계대하여도 좋다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, 상기 증식 공정에 있어서, 계대를 실시하는 경우에, 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 박리제를 이용하여 상기 간엽계 줄기 세포를 박리하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법은, 상기 증식 공정 전에, 간엽계 줄기 세포의 증식에 적합한 배양 용기를 선택하는 배양 용기 선택 공정을 더 포함하고 있어도 좋다.
또한 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법에 있어서, 상기 인지질이, 포스파티딘산, 리소포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 및 포스파티딜글리세롤로부터 되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고 있다.
또한, 본 발명에 따른 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법에 있어서, 상기 지방산이, 리놀산, 올레인산, 리놀레인산, 아라키돈산, 미리스틴산, 팔미토레인산, 팔미틴산, 및 스테아린산으로부터 되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고 있다.
또한, 본 발명에 따른 배지용 첨가제는, 세포 접착 분자를 더 함유하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명에 따른 키트는, FGF, PDGF, EGF, 적어도 하나의 인지질, 및 적어도 하나의 지방산을 함유하는 배지용 첨가제 B를 추가로 포함한다.
또한, 발명을 실시하기 위한 형태의 항에 있어서 구체적인 실시 형태 및 이하의 실시예는, 어디까지나, 본 발명의 기술 내용을 분명히 하는 것이며, 그러한 구체적인 예로만 한정하여 협의로 해석되어야 하는 것이 아니고, 당업자는, 본 발명의 정신 및 첨부된 특허 청구의 범위 내에서 변경하여 실시할 수 있다.
또한, 본 명세서 중에 기재된 학술 문헌 및 특허 문헌의 모두가, 본 명세서 중에서 참고로서 원용된다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
이하의 실험을 실시하였다.
(1.세포 배양)
인간 골수 유래 간엽계 줄기 세포(골수 유래 hMSC)는, Lonza Walkersville, Inc. (이하, Lonza사)로부터 구입하여, Mesenchymal Stem Cell Basal Medium(MSCBM)(Lonza사)에 Mesenchymal Cell Growth Supplement(MCGS)(Lonza사)를 첨가한 혈청 함유 배지(MSCGM 배지), 또는 표 1에 나타내는 무혈청의 배지 1에서 배양하였다.
Figure 112014070482730-pct00015
마우스 비장 세포(splenocyte)로서 일본 찰즈 리버 가부시키가이샤에서 구입한 BALB/c(H-2 d)의 비장을 으깨 용혈시킨 후, 1% FBS/Advanced PRM1(GIBCO사)에 현탁한 것을 실험에 이용하였다.
(2.비장 세포의 활성화)
<2-1:마이토젠에 의한 자극>
96 웰 플레이트의 각 웰에, 마우스 비장 세포(1×105)를 파종하여, 2.5 ng/ml Phorbol 12-myristate 13-acetate(이하, PMA라고 한다), 125 ng/ml ionomycin로 자극하였다.
<2-2:anti-CD3/anti-CD28에 의한 자극>
96 웰 플레이트의 각 웰에 마우스 비장 세포(1×105)를 파종하여, 2.5㎍/ml anti-CD3, 0.5㎍/ml anti-CD28로 자극하였다.
(3.활성화 비장 세포와 골수 유래 hMSC와의 공배양)
골수 유래 hMSC의 사전 처리로서 96 웰 플레이트의 각 웰에, 골수 유래 hMSC 1×104를 파종하여, 붙은 것을 확인하고 나서(수시간 내지 하룻밤 배양), 감마 셀 40 이그잭터를 이용, 감마선 조사를 실시하여 세포 분열을 저해하였다. 그리고, 상술한 바와 같이 활성화한 마우스 비장 세포를 파종하여, 골수 유래 hMSC와 공배양하였다.
(4.세포 증식 측정)
공배양 개시부터 3일째 및 4일째에, 각 웰에 [3 H]-Thymidine을 첨가하여 다시 8시간 배양하였다. 배양 세포를 유리 필터에 흡착시킨 후, 액체 신틸레이션 카운터로 Thymidine의 수확을 측정하여, 세포 증식을 측정하였다.
(5.결과)
골수 유래 hMSC와 마우스 유래 활성화 T 세포와의 공배양을, 10% FBS 함유의 MSCGM 배지 또는 무혈청 배지 A인 배지 1(STK2(등록상표))에서 배양한 결과를, 도 1 내지 4에 나타낸다. 도 1 내지 4에서, 값은 평균±표준 편차로 나타냈다. 동일한 결과가, 3회 이상의 독립된 실험 결과로부터 얻어졌다. # 4 및 #5는, 각각 독립된 골수 유래 hMSC의 결과를 나타내고 있다.
도 1은, MSCGM 배지에서 마우스 유래 활성화 T 세포와 골수 유래 hMSC를 공배양했을 때의, 항CD3 및 항CD28 자극 T 세포 증식 반응에 대한 골수 유래 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이며, 도 2는, 배지 1에서 마우스 유래 활성화 T 세포와 골수 유래 hMSC를 공배양했을 때의, 항CD3 및 항CD28 자극 T 세포 증식 반응에 대한 골수 유래 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은, MSCGM 배지에서 마우스 유래 활성화 T 세포와 골수 유래 hMSC를 공배양했을 때의, PMA 및 이오노마이신 자극(마이토젠 자극) T 세포 증식 반응에 대한 골수 유래 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이며, 도 4는, 배지 1에 대해 마우스 유래 활성화 T 세포와 골수 유래 hMSC를 공배양했을 때의, PMA 및 이오노마이신 자극(마이토젠 자극) T 세포 증식 반응에 대한 골수 유래 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 1 내지 4에 나타내는 바와 같이, 배지 1에서 배양한 골수 유래 hMSC는, 혈청을 함유하는 MSCGM 배지에서 배양한 골수 유래 hMSC와 마찬가지로, 마이토젠 자극에 의해 활성화한 T 세포 및 항CD3/항CD28 자극에 의해 활성화한 T 세포의 증식을 억제하였다. 즉, 무혈청의 배지 1을 이용하여 배양한 골수 유래 hMSC가, 면역 억제 작용을 유지하고 있다는 것이 나타났다.
[실시예 2]
마우스 임파구 혼합 반응(MLR)에 의한 T 세포 증식에 대한 골수 유래 hMSC의 면역 억제 효과를 조사하였다. 실험 방법, 및 사용한 세포 및 배지는, 실시예 1과 동일하다. 골수 유래 hMSC의 사전 처리로서 96 웰 플레이트의 각 웰에 2×104의 골수 유래 hMSC를 파종하여, 실시예 1과 동일하게 행하였다. 또한, 마우스 비장 세포의 활성화를, 96 웰 플레이트의 각 웰에서, 마우스 비장 세포(2×105)와 마우스 골수 유래 수상 세포(BMDC)(3.3×104)를 공배양함으로써 행하였다(MLR 자극).
또한, BMDC는, 일본 찰즈 리버 가부시키가이샤에서 구입한 C3H(H-2k)로부터 골수 세포를 회수하여 용혈시킨 후, GM-CSF를 넣은 1% FBS/Advanced PRMI(GIBCO사)로 하루 걸러서 배지를 교환하고, 배양 6일째에 100 ng/ml LPS로 자극을 주어 하룻밤 배양한 후 세정하고, 감마 셀 40 이그잭터를 이용하여 감마선 조사를 실시하여, 세포 분열 저해된 것을 실험에 이용하였다.
골수 유래 hMSC를 MSCGM 배지 및 배지 1에서 각각 전 배양한 후, 전 배양 후의 각각의 골수 유래 hMSC와, 상기와 같이 활성화한 마우스 비장 세포를, MSCGM 배지에서 공배양하였다. 결과를 도 5 및 6에 나타낸다. 도 5 및 6은, MLR에 의한 T 세포 증식에 대한 골수 유래 hMSC의 면역 억제 효과를 나타내는 그래프이다. 값은 평균±표준 편차로 나타냈다. 동일한 결과가, 3회 이상의 독립된 실험 결과로부터 얻어졌다. 도 5는, 배양 3일째의 결과를 나타내고, 도 6은, 배양 4일째의 결과를 나타내고 있다. 도면 중, M은 MSCGM 배지에서 전 배양한 후에 혈청 함유 배지에서 배양했을 경우의 결과를 나타내고 있고, S는 배지 1에서 전 배양한 후에 혈청 함유 배지에서 배양한 결과를 나타내고 있다.
도 5 및 6에 나타내는 바와 같이, 배지 1에서 전 배양한 골수 유래 hMSC는, MSCGM 배지에서 전 배양한 골수 유래 hMSC와 마찬가지로, 활성화 T 세포 증식 억제 효과를 유지하고 있었다. 또한, MSCGM 배지에서 전 배양한 골수 유래 hMSC는, 공배양 개시부터 4일째에 면역 억제 효과를 나타낸 것에 반하여, 배지 1에서 전 배양한 골수 유래 hMSC는, 공배양 개시부터 3일째에 이미 면역 억제 효과를 나타냈다. 즉, 배지 1에서 전 배양한 골수 유래 hMSC가, 보다 조기에 면역 억제 효과를 나타냈다. 또한 데이터를 나타내지 않지만, 마이토젠 자극 T 세포 증식 및 항CD3/항CD28 자극 T 세포 증식에 대해서도, 배지 1에서 전 배양한 골수 유래 hMSC는, 동일한 결과를 나타냈다.
실시예 1 및 2의 결과에 나타내는 바와 같이, 배지 1에서 배양한 골수 유래 hMSC는, 활성화 T 세포의 세포 증식 억제 효과를 유지하고 있을 뿐만 아니라, MSCGM 배지(혈청 함유 배지)에서 배양한 골수 유래 hMSC보다 조기에 활성화 T 세포의 세포 증식 억제 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, MSCGM 배지에서 전 배양한 골수 유래 hMSC와 활성화 마우스 비장 세포를 공배양했을 경우, 골수 유래 hMSC가 면역 억제 효과를 나타내기 전의 T 세포의 증식이, 컨트롤 배지(골수 유래 hMSC를 포함하지 않는 활성화 마우스 비장 세포의 배양 배지)에 있어서의 T 세포의 증식보다 활발해지는 시기가 있었다.
이와 같이, 배지 1에서 골수 유래 hMSC를 배양하면, 단기간에 필요한 수의 세포를 증식시키는데 유리할 뿐만 아니라, 면역 억제 효과도 유지되고 있는 것이 나타났다. 이것으로부터, 배지 1은, 특히 임상 응용을 목표로 한 골수 유래 hMSC의 배양에 유효하다고 할 수 있다.
[실시예 3]
이하의 실험을 실시하였다.
(1.세포 배양)
인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포(지방 조직 유래 hMSC)는, 이하의 (i) 내지 (vii)의 순서로 분리하여, 배양하였다.
(i) 인간으로부터 지방 조직을 채취하여, 무혈청 DMEM 배지를 이용해 지방 조직을 2 내지 3회 세정하였다.
(ii) 세정 후의 지방 조직을, 가위를 이용하여 가늘게 절단하였다(1 mm3).
(iii) 0.1 내지 0.2% 콜라게나아제(GIBCO 17100-017) 용액을 이용하고, 스터러 바로 교반하면서 지방 조직을 처리하였다(37℃, 30 내지 60분 ).
(iv) 100 mm의 필터를 이용하여 콜라게나아제 처리 후의 지방 조직을 여과한 후, 100×g, 10분간 원심 분리를 실시하여, 지방 조직 유래 hMSC를 분리하였다.
(v) Red lysis buffer(sigma R7757)를 이용하고, 스터러 바로 교반하면서 원심 분리 후의 세포를 처리하였다(5 내지 10분).
(vi) Red lysis buffer 처리 후의 세포를, 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 2 내지 3회 세정하였다.
(vii) 세정 후의 세포를 배양용 플레이트(BECTON, DICKINSON (Falcon) 353047)에 파종하여, 표 1에 나타낸 무혈청의 배지 1, 또는 10% FBS를 함유하는 MEM 배지(sigma D6046)(「10% FBS-MEM」라고 한다.)를 이용하여 배양하였다.
(2.세포 증식 측정)
배양 개시부터 8일째에, 세포의 증식 상태를 광학 현미경을 이용하여 육안으로 관찰하였다.
(3.결과)
결과를 도 7에 나타낸다. 도 7은 배양 개시부터 8일째의 지방 조직 유래 hMSC의 증식 상태를 나타내는 도면이다. 도 7에서는 지방 조직 유래 hMSC를 40배로 확대하여 관찰하였다. 도 7에 나타내는 바와 같이, 배지 1에서 배양한 지방 조직 유래 hMSC는, 10% FBS-MEM으로 배양한 지방 조직 유래 hMSC와 비교하여, 현저하게(2 내지 3배) 세포 수가 증가하고 있다는 것이 나타났다.
[실시예 4]
이하의 실험을 실시하였다.
(1.세포 배양)
인간 활막 유래 간엽계 줄기 세포(활막 유래 hMSC)는, 이하의 (i) 내지 (iii)의 순서로 분리하였다.
(i) 인간으로부터 활막을 채취하였다.
(ii) 얻어진 활막 세포를 PBS로 세정 후, 조직을 0.4% 콜라게나아제 용액 10 ml 중에 더하여 혼화하고, 37℃에서 1 내지 4시간 반응시켰다.
(iii) 필터링 후, 원심 분리하였다.
원심 분리에 의해 얻어진 초기의 활막 유래 hMSC를, 이하의 배지를 이용하여 배양하였다. 또한 무혈청 배지 B인 배지 2는, 표 1에 나타낸 배지 1로부터 HGF 및 TGF-β를 제거한 배지이다.
· 10% FBS 함유 DMEM(10% FBS-DMEM)(sigma D6046, FBS; Hyclone,PS(+))
· 배지 1
· 배지 2
배양은, 37℃로 유지한 탄산 가스 인큐베이터 내(95% air and 5% CO2)에서 실시하였다.
(2.세포 증식 측정)
배양 개시부터 12일째(계대 0번째)에, 세포의 증식 상태를 광학 현미경을 이용하여 육안으로 관찰하였다. 또한, 세포의 수를 콜터 카운터에 의해서 측정하였다.
(3.결과)
결과를 도 8에 나타낸다. 도 8은, 초기의 활막 유래 hMSC에 대한 배지 1 및 배지 2의 증식 촉진 효과를 나타내는 도면이며, (a)는, 배양 개시부터 12일째의 활막 유래 hMSC의 세포수를 나타내는 그래프이며, (b)는, 배양 개시부터 12일째의 활막 유래 hMSC의 증식 상태를 나타내는 도면이다. 도 8의 (b)에서는, 활막 유래 hMSC를 10배로 확대하여 관찰하였다.
도 8의 (a)의 그래프에 나타낸 바와 같이, 초기의 활막 유래 hMSC에 대해서는, 배지 2의 증식 촉진 효과가 현저하게(배지 1을 이용했을 경우의 8배, 10% FBS 함유 DMEM을 이용했을 경우의 40배 이상) 높다는 것이 확인되었다.
[실시예 5]
이하의 실험을 실시하였다.
(1.세포 배양)
인간 활막 유래 간엽계 줄기 세포(활막 유래 hMSC)는, 실시예 4의 「1.세포 배양」 항에 나타낸 (i) 내지 (iii)의 순서에 의해서 분리하였다.
원심 분리에 의해서 얻어진 초기의 활막 유래 hMSC를, 배지 2를 이용하여 11일간 배양하고, 그 후, 이하의 배지를 이용하여 배양하였다.
· 10% FBS 함유 DMEM(10% FBS-DMEM)(sigma D6046, FBS; Hyclone,PS(+))
· 배지 1
· 배지 2
배양은, 37℃로 유지한 탄산 가스 인큐베이터 내(95% air and 5% CO2)에서 실시하였다.
(2.세포 증식 측정)
세포의 수를 콜터 카운터에 의해서 측정하였다.
(3.결과)
결과를 도 9에 나타낸다. 도 9는, 배양 개시 0일째부터 68일째까지의 활막 유래 hMSC의 세포 수의 경시적인 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9의 그래프에 나타낸 바와 같이, 초기의 활막 유래 hMSC에 대해서는, 배지 2를 이용하여 배양하고, 그 후, 배지 1을 이용하여 활막 유래 hMSC를 배양함으로써, 활막 유래 hMSC를 효율적으로 증폭시킬 수 있다는 것이 확인되었다(배양 개시부터 48일째에, 배양 개시부터 11일째부터 10% FBS-DMEM을 이용했을 경우의 10만배, 배양 개시 0일째부터 68일째까지 배지 2를 이용했을 경우의 1만배).
[실시예 6]
이하의 실험을 실시하였다.
(1.세포 배양)
인간 활막 유래 간엽계 줄기 세포(활막 유래 hMSC)는, 실시예 4의 「1.세포 배양」 항에 나타낸 (i) 내지 (iii)의 순서에 의해서 분리하였다.
활막 유래 hMSC를 분리·증식 하기 위해서, 원심 분리에 의해서 얻어진 활막 유래 hMSC를 플라스크로 옮기고, 초대 배양(P0)으로부터 계대 3번째(P3)까지는 배지 2를 이용하고 계대 1회째(P1) 내지 계대 4번째(P4)의 사이에서는 표 1에 나타낸 배지 1을 이용하여 배양하였다. 배양은, 37℃로 유지한 탄산 가스 인큐베이터 내(95% air and 5% CO2)에서 배양하였다.
배양 중의 배지의 교환은 주에 2회 행하였다. 세포의 계대는, 7 내지 21일간격으로 행하였다. 활막 유래 hMSC는, 배지 1 ml에 대해서 1 내지 2×104개의 간엽계 줄기 세포를 파종하여, 37℃, 5% CO2 배양 조건하에서 증식시켰다.
(2.결과)
1 g의 활막 조직으로부터 배지 2와 배지 1을 조합하여 배양함으로써, 3 내지 4주만에 1000 인분(변형성 관절증의 최대 이식 세포 수: 1.5×109개)의 증식을 취득할 수 있었다.
[실시예 7]
이하의 실험을 실시하였다.
(플라스크)
이하의 플라스크를 이용하였다.
· 플라스크 1:팔콘제 75 cm2 플라스크
· 플라스크 2:스미토모 베이크라이트제 75 cm2 플라스크
(배양액)
이하의 배양액을 이용하였다.
· 10% FBS 함유 DMEM(10% FBS-DMEM)(sigma D6046, FBS; Hyclone,PS(+))
· 배지 1
· 배지 1+피브로넥틴(최종 농도 5㎍/mL)
(세포)
이하의 골수 유래 간엽계 줄기 세포(골수 유래 hMCS)를 이용하였다.
· 세포 1(P2): 1×106개, 세포를 깨워 배양 12일째에 계대한 것.
· 세포 2(P3): 1×106개, 세포를 깨워 배양 30일째에 계대한 것. 증식 스피드가 늦다.
· 세포 3(P1): 1×106개, 세포를 깨워 배양 12일째에 계대한 것.
(배양 방법)
5,000개/cm2의 파종 밀도로, 이하의 조건으로 각각의 골수 유래 hMCS(세포 1 내지 세포 3)를 배양하였다. 또한 배양액 3을 이용하는 경우는, 파종 시에만 피브로넥틴을 첨가하였다.
· 조건 A: 플라스크 1+10% FBS-DMEM(포지티브 컨트롤)
· 조건 B: 플라스크 1+배지 1
· 조건 C: 플라스크 1+배지 1+피브로넥틴
· 조건 D: 플라스크 2+10% FBS-DMEM(네가티브 컨트롤)
· 조건 E: 플라스크 2+배지 1
· 조건 F: 플라스크 2+배지 1+피브로넥틴
(2.세포 증식 측정)
<세포 1>
계대 3번째가 된 시점에서 플라스크에 세포를 파종하여, 배양을 개시하였다. 배양 개시부터 5일째에, 세포의 증식 상태를 광학 현미경을 이용하여 육안으로 관찰하였다.
<세포 2>
계대 4번째가 된 시점에서 플라스크에 세포를 파종하여, 배양을 개시하였다. 배양 개시부터 5일째에, 세포의 증식 상태를 광학 현미경을 이용하여 육안으로 관찰하였다.
<세포 3>
계대 2번째가 된 시점에서 플라스크에 세포를 파종하여, 배양을 개시하였다. 배양 개시부터 5일째에, 세포의 증식 상태를 광학 현미경을 이용하여 육안으로 관찰하였다.
(3.결과)
<세포 1>
결과를 도 10에 나타낸다. 도 10은, 배양 개시부터 5일째의 골수 유래 hMSC(세포 1)의 증식 상태를 나타내는 도면이다. 도 10에서는, 골수 유래 hMSC를 40배로 확대하여 관찰하였다.
도 10에 나타내는 바와 같이, 조건 A 및 조건 D에서는, 사세포가 인정되지만, 3할 전후의 접착된 세포도 인정되었다. 또한, 조건 B 및 조건 E에서는, 국소적으로 세포가 증식하고 있었다. 조건 A 및 조건 D로 배양한 세포란, 세포의 접착 상태가 분명하게 달라, 2할 전후의 세포의 접착이 인정되었다. 또한 조건 C 및 조건 F에서는, 조건 B 및 조건 E와 마찬가지로, 국소적으로 세포가 증식하고 있었다. 조건 F에서는, 플라스크 마다 세포의 불균일이 인정되지만, 조건 B 및 조건 E와 마찬가지로, 2할 전후의 세포의 접착이 인정되었다.
<세포 2>
결과를 도 11에 나타낸다. 도 11은, 배양 개시부터 5일째의 골수 유래 hMSC(세포 2)의 증식 상태를 나타내는 도면이다. 도 11에서는, 골수 유래 hMSC를 40배로 확대하여 관찰하였다.
도 11에 나타내는 바와 같이, 조건 A 및 조건 D에서는, 세포 2는, 순조롭게 증식하여, 콘플루언트 상태의 약 7할 정도로 증식하였다. 세포 상태는 양호하였다. 또한, 조건 B에서는, 세포 2는, 콘플루언트 상태의 7 내지 8할 정도로 증식하고, 조건 E에서는, 콘플루언트 상태의 9할 정도로 증식하여, 거의 콘플루언트 상태가 되어 있었다. 조건 B 및 조건 E에서는, 조건 A 및 조건 D와 비교하여, 세포가 위축되어 구멍과 같은 공간이 생겨 있었다. 또한 조건 C 및 조건 F에서는, 모두, 세포 2는, 콘플루언트 상태의 8할 정도로 증식하였다. 세포의 접착 상태는, 조건 B 및 조건 E와 같은 상태였지만, 세포의 수는 약간 적었다.
<세포 3>
결과를 도 12에 나타낸다. 도 12는 배양 개시부터 5일째의 골수 유래 hMSC(세포 3)의 증식 상태를 나타내는 도면이다. 도 12에서는, 골수 유래 hMSC를 40배로 확대하여 관찰하였다.
도 12에 나타내는 바와 같이, 조건 A 및 조건 D에서는, 세포 3은, 콘플루언트 상태의 8 내지 9할 정도로 증식하여, 약간 콘플루언트 상태가 되어 있었다. 또한, 조건 B 및 조건 E에서는, 조건 B에 대해 세포의 박리가 일부 인정되었지만, 그 이외는, 콘플루언트 상태의 8 내지 9할 정도로 증식하였다. 또한 조건 C 및 조건 F에서는, 조건 B 및 조건 E와 비교하여, 세포의 박리가 인정되지 않고, 콘플루언트 상태의 9할 정도로 증식하고 있었다.
이상의 결과로부터, 조건 B 및 조건 E에서는, 세포 1 내지 3의 어느 세포주를 이용했을 경우이어도, 조건 E가, 세포 증식능이 높다는 것이 확인되었다. 즉, 세포 1 내지 3의 증식에는, 플라스크 1보다 플라스크 2가 적합하다는 것이 확인되었다.
또한, 조건 C 및 조건 F와 같이, 세포 접착 분자로서의 피브로넥틴을 첨가함으로써 세포의 접착율이 향상된다는 것이 확인되었다.
[실시예 8]
이하의 실험을 실시하였다.
(1.연한천 콜로니법)
96 웰 플레이트를 이용하고, 각 웰에 연한천 배지(DMEM-10% FCS-0.6% 한천)을 첨가하여 겔화한 후에 세포를 현탁 연한천 배지(DMEM-10% FCS-0.4% 한천)를 첨가했다. 세포는, 인간 연골 육종 세포주(OUMS-27, JCRB 세포 뱅크로부터 구입), 정상 인간 피부 섬유아세포(NHDF, 론더사로부터 구입)를 이용하고, 웰당의 세포 파종 수는 0 내지 10000개로 하였다. 인간 연골 육종 세포주는, 간엽계의 세포가 암화된 것이다. 연한천 배지 상에 첨가하는 배양액의 혈청 함유량이 10%, 20%인 군을 제작하였다. 또한, 본 실험에서 배양액에 혈청을 첨가한 것은, 세포가 보다 활발하게 증식한다고 생각되는 조건으로 하기 위해서이다.
배양 개시부터 2주일 후에, 콜로니를 p-iodonitrotetrazolium Violet(Sigma product.)에 의해 염색하고, 현미경 하에서 각 웰 내에 형성된 콜로니 수를 세었다. 콜로니의 직경이 25㎛ 이상의 것이 형성된 콜로니를 세었다.
(배양액)
이하의 배양액을 이용하였다.
· 4.5 g/L글루코오스 함유 DMEM(DMEM 4.5 g/L glucose)
· 배지 1(표 1을 참조)
또한, 4.5 g/L글루코오스 함유 DMEM에서, 글루코오스는, 콜로니 형성·증식 촉진을 목적으로 하여 첨가하고 있다. OUMS-27은, 저농도의 글루코오스 배지(1 g/ml)에서는 콜로니 형성이 나쁘다고 생각하여 고농도 글루코오스 함유 배지(시판품)를 선택하여, 배양에 사용하였다.
(2.결과)
도 13은, 정상 인간 피부 섬유아세포 및 인간 연골 육종 세포주의 증식에 대한 배지 1의 효과를 나타내는 그래프이며, (a)는, 배양 개시부터 14일째의 정상 인간 피부 섬유아세포의 콜로니수를 나타내는 그래프이며, (b)는, 배양 개시부터 14일째의 인간 연골 육종 세포주의 콜로니수를 나타내는 그래프이다. 또한, 도 13에서는 크기가 25㎛ 이상의 콜로니의 수를 나타낸다.
도 13의 (a)의 그래프에 나타낸 것처럼, 정상 인간 피부 섬유아세포에서는, 배지 1을 이용하여 정상 인간 피부 섬유아세포를 배양했을 경우에, 4.5 g/L글루코오스 함유 DMEM을 이용하여 배양했을 경우와 비교하여 형성되는 콜로니의 수가 현저하게 증가하였다. 한편, 도 13의 (b)의 그래프에 나타낸 것처럼, 인간 연골 육종 세포주에서는, 배지 1을 이용하여 정상 인간 피부 섬유아세포를 배양했을 경우에, 4.5 g/L 글루코오스 함유 DMEM을 이용하여 배양했을 경우와 비교하여 형성되는 콜로니의 수가 현저하게 감소하였다.
이 결과로부터, 배양액으로서 배지 1을 이용하여 세포를 배양했을 경우, 정상 인간 피부 섬유아세포에 있는 간세포, 즉 종양 형성성을 갖지 않은 세포는, 증식이 촉진되고, 한편, 인간 연골 육종 세포주와 같은 종양 형성성을 가지고 있는 세포는, 증식이 억제된다는 것이 밝혀졌다. 즉, 배양액으로서 배지 1을 이용하여 세포를 배양함으로써, 종양 형성성을 가지고 있는 세포의 증식을 선택적으로 억제하면서, 종양 형성성을 갖지 않은 정상적인 세포를 선택적으로 효율적으로 증식시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다.
또한, 이 결과로부터, 배양액이 다른 것 이외에는 동일한 조건으로 연한천 콜로니법을 실시했을 경우에, 배양액으로서 4.5 g/L 글루코오스 함유 DMEM을 이용하는 것이, 배양액으로서 배지 1을 이용했을 경우보다 형성되는 콜로니의 수가 유의하게 많은 경우에, 그 세포는 종양 형성성을 가지고 있는 세포라고 판단하여, 배양액으로서 4.5 g/L 글루코오스 함유 DMEM을 이용하는 것이, 배양액으로서 배지 1을 이용했을 경우보다 형성되는 콜로니의 수가 유의하게 적은 경우에, 그 세포는 종양 형성성을 갖지 않은 세포라고 판단할 수 있다는 것이 시사되었다.
본 발명은 상술한 각 실시 형태로 한정되는 것이 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지의 변경이 가능하고, 다른 실시 형태로 각각 개시된 기술적 수단을 적당히 조합하여 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명을 이용하면, 간엽계 줄기 세포를 이용한 것보다 안전하고 이용 가치가 높은 이식 치료 재료를 제공할 수 있으므로, 간엽계 줄기 세포를 이용한 이식 치료 등의 재생 의료에 매우 적합하게 이용 가능하다.

Claims (18)

  1. FGF(fibroblast growth factor),
    PDGF(platelet derived growth factor),
    TGF-β(transforming growth factor-β),
    HGF(hepatocyte growth factor),
    EGF(epidermal growth factor),
    적어도 하나의 인지질, 및
    적어도 하나의 지방산을
    함유하는 무혈청 배지 A에 있어서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 증식 공정과
    상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포와 면역 세포를 공배양함으로써, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 스크리닝 공정을 포함하고,
    상기 증식 공정 전에,
    FGF(fibroblast growth factor),
    PDGF(platelet derived growth factor),
    EGF(epidermal growth factor),
    적어도 하나의 인지질, 및
    적어도 하나의 지방산을
    함유하는 무혈청 배지 B에서, 간엽계 줄기 세포를 증식시키는 전 증식 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포를, 상기 스크리닝 공정 전에, 혈청을 포함한 배지에서 배양하는 혈청 배양 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포의 종양 형성성의 유무를 in vitro의 연한천 배양법, 또는 in vivo의 고감도 면역 부전 마우스에 의한 종양 형성성 시험법을 통해 확인함으로써, 상기 증식 공정 후의 간엽계 줄기 세포로부터, 종양 형성성을 갖지 않은 간엽계 줄기 세포를 스크리닝하는 제2 스크리닝 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 증식 공정에서는, 상기 무혈청 배지 A에, 피브로넥틴, 콜라겐, 또는 젤라틴을 더 함유시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 증식 공정에서는, 상기 간엽계 줄기 세포를 적어도 1회 계대하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인지질이, 포스파티딘산, 리소포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 및 포스파티딜글리세롤로부터 되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 지방산이, 리놀산, 올레인산, 리놀레인산, 아라키돈산, 미리스틴산, 팔미토레인산, 팔미틴산, 및 스테아린산으로부터 되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 삭제
  10. FGF(fibroblast growth factor),
    PDGF(platelet derived growth factor),
    TGF-β(transforming growth factor-β),
    HGF(hepatocyte growth factor),
    EGF(epidermal growth factor),
    적어도 하나의 인지질, 및
    적어도 하나의 지방산을
    함유하는 것을 특징으로 하는 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 무혈청의 배지용 첨가제 A를 적어도 구비하고 있고,
    FGF(fibroblast growth factor),
    PDGF(platelet derived growth factor),
    EGF(epidermal growth factor),
    적어도 하나의 인지질, 및
    적어도 하나의 지방산을
    함유하는 배지용 첨가제 B를 더 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제를 제조하기 위한 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배지용 첨가제 A는 피브로넥틴, 콜라겐, 또는 젤라틴을 더 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
KR1020127026184A 2010-03-10 2011-03-10 간엽계 줄기 세포를 포함한 세포 제제 및 그의 제조 방법 KR101443478B1 (ko)

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