CN112708596A - 一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法 - Google Patents

一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养、检测领域，更具体地，本发明涉及一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其包括：(1)MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1；(2)MSC细胞去增殖处理：将步骤(1)最终得到的MSC细胞去增殖后继续培养；(3)淋巴细胞增殖抑制检测：将步骤(2)最终得到的MSC细胞与染色后的PBMC细胞进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。本申请中间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法操作简单，检测数据稳定，淋巴细胞增殖抑制率高。

Description

一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法
技术领域
本发明涉及细胞培养、检测领域，更具体地，本发明涉及一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法。
背景技术
间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一类重要的成体干细胞，具有多种组织修复能力，已广泛用于临床治疗研究。间充质干细胞最初是由骨髓基质中分离获得的非造血多能干细胞，现已证实间充质干细胞也存在于脂肪组织、脐带等多种组织内。研究表明间充质干细胞是一个重要应用是免疫调节领域。大量研究证实，间充质干细胞在体内可诱导免疫抑制，减少造血干细胞移植治疗过程中的GVHD及排斥反应，以及抗炎调节能力。间充质干细胞的免疫抑制能力在大量的动物试验和临床研究中得到证实。
然而，间充质干细胞在免疫调节领域的应用仍存在一些问题亟需解决。首先，由于细胞培养增殖、去增殖等方法存在差异，间充质干细胞的质量也存在很大差异，因此导致不同实验室的间充质干细胞其调节免疫效果差异较大。另外，目前的间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法存在数据波动大，不稳定等特点。
发明内容
针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其包括下面步骤：
(1)MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1；
(2)MSC细胞去增殖处理：将步骤(1)最终得到的MSC细胞去增殖后继续培养；
(3)淋巴细胞增殖抑制检测：将步骤(2)最终得到的MSC细胞与染色后的PBMC细胞进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
作为本发明的一种优选的技术方案，当n＝1时，所述完全培养基含有8-12wt％胎牛血清。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述完全培养基含有10wt％胎牛血清。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述完全培养基为Gibco 1640培养基。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤(1)中接种培养的条件为：4.8-5.2vol％CO2，温度为30-40℃，培养20-24h。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤(2)中MSC细胞去增殖的处理方式包括辐射去增殖、反复冻融、加入去增殖处理剂中一种或多种。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述去增殖处理剂为丝裂霉素C的完全培养基。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述丝裂霉素C的浓度为8-12μg/mL。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤(2)中去增殖处理的时间为1-3h。
本发明第二个方面提供了一种所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法在免疫调节中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本申请MSC细胞接种过程简单，一次离心去上清，使用本申请中Gibco1640培养基重悬后，无不溶性絮状物存在，同时得到的MSC细胞对淋巴细胞增殖的抑制率提高；
(2)本申请中在MSC细胞接种过程中，调整细胞浓度至2×105/mL后进行培养，其传代增殖较好；
(3)去增殖处理剂为8-12μg/ml丝裂霉素C的完全培养基，培养1-3h后，再次进行培养后，此时得到的MSC细胞的分泌因子较好，能够有限抑制淋巴细胞增殖，抑制率提高；
(4)本申请中间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法操作简单，检测数据稳定，淋巴细胞增殖抑制率高。
具体实施方式
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
本发明第一个方面提供了一种所述间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其包括下面步骤：
(1)MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1；
(2)MSC细胞去增殖处理：将步骤(1)最终得到的MSC细胞去增殖后继续培养；
(3)淋巴细胞增殖抑制检测：将步骤(2)最终得到的MSC细胞与染色后的PBMC细胞进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
MSC是指间充质干细胞，是干细胞的一种，能分化为间质组织。
间充质干细胞具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。间充质干细胞来源：间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高、纯净、数量多。
PBMC：外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。外周血单个核细胞主要的分离方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖－泛影葡胺)密度梯度离心法。
步骤(1)
在一种实施方式中，所述n＝1。
在一种实施方式中，所述完全培养基含有8-12wt％胎牛血清。
优选的，所述完全培养基含有10wt％胎牛血清。
优选的，所述完全培养基为Gibco 1640培养基。
在一种实施方式中，所述步骤(1)中接种培养的条件为：4.8-5.2vol％CO2，温度为30-40℃，培养20-24h。
优选的，所述步骤(1)中接种培养的条件为：5vol％CO2，温度为37℃，培养22h。
本申请人在实验中意外的发现，在MSC细胞接种过程中，加入完全培养基重悬时，会出现不溶性絮状物产生，吹打后絮状物仍存在，此外，本申请人意外的发现，对细胞悬液进行多次离心去上清后，在加入完全培养基重悬时，不溶性絮状物减少，然而该方法一方面操作繁琐，增加时间成本，另一方面其少量的不溶性絮状物对于淋巴细胞增殖抑制存在很大的影响。本申请人经过一系列的研究和思考后发现，当完全培养基为Gibco 1640培养基时，对MSC细胞悬液进行一次离心去上清后，不仅不会产生不溶性絮状物，同时对于淋巴细胞增殖的抑制率显著提高，本申请人认为可能的原因是Gibco 1640培养基含有10％的胎牛血清，可以有效防止MSC细胞悬液中冻存液DMSO对MSC细胞的影响，同时Gibco1640培养基不含有蛋白质、脂类或生长因子，不会因为离心不完全导致的蛋白质对MSC细胞重悬的影响，此外，其含有的合适的营养物质，使得MSC细胞具有很好的生物活性，传代迅速，20-24h增殖效果明显。
在一种实施方式中，所述步骤(1)MSC细胞接种包括：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入完全培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养22h。
本申请中调整细胞浓度至2×105/mL后进行培养，其传代增殖较好。
步骤(2)
在一种实施方式中，所述步骤(2)中MSC细胞去增殖的处理方式包括辐射去增殖、反复冻融、加入去增殖处理剂中一种或多种。
优选的，所述去增殖处理剂为丝裂霉素C的完全培养基；进一步优选的，所述丝裂霉素C的浓度为8-12μg/mL；更优选的，所述丝裂霉素C的浓度为10μg/mL。
在一种实施方式中，所述步骤(2)中去增殖处理的时间为1-3h。
优选的，所述步骤(2)中去增殖处理的时间为2h。
本申请人意外的发现，当去增殖处理剂为8-12μg/ml丝裂霉素C的完全培养基时，培养1-3h后，再次进行培养后，此时得到的MSC细胞的分泌因子较好，能够有效抑制淋巴细胞增殖。
在一种实施方式中，所述步骤(2)包括：吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含10μg/mL丝裂霉素C的完全培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育2h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL完全培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中。
步骤(3)
本发明对PBMC染色的操作不作特别限制，本领域技术人员可作常规选择。
在一种实施方式中，PBMC染色使用2μmol/L CFSE染色液染色5min。
本发明对PBMC染色之前还可以包括冻存PBMC细胞复苏过程，其具体操作不作特别限制，本领域技术人员可作常规选择。
所述MSC细胞与染色后的PBMC进行共培养的方法不作特别限定，本领域技术人员可作常规选择。
在一种实施方式中，所述MSC细胞和PBMC细胞的个数比为1：5。
在一种实施方式中，步骤(2)最终得到的MSC细胞和染色后的PBMC细胞在终浓度为1μg/mL anti-CD3与1μg/mL anti-CD28的完全培养基中进行共培养。
本发明所述完全培养基不作特别说明时，均为Gibco 1640培养基。
本发明第二个方面提供了一种所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法在免疫调节中的应用。
实施例
在下文中，通过实施例对本发明进行更详细地描述，但应理解，这些实施例仅仅是示例的而非限制性的。如果没有其它说明，下面实施例所用原料都是市售的。
实施例1
本发明的实施例1提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，具体如下：
(1)MSC细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养20h；
(2)MSC细胞去增殖处理：吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含8μg/mL丝裂霉素C的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育3h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中；
(3)淋巴细胞增殖抑制检测：将步骤(2)最终得到的MSC细胞与使用2μmol/L CFSE染色液染色5min的PBMC细胞以个数为1：5的比例在终浓度为1μg/mL anti-CD3与1μg/mLanti-CD28的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例2
本发明的实施例2提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，具体如下：
(1)MSC细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养24h；
(2)MSC细胞去增殖处理：吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含12μg/mL丝裂霉素C的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育1h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中；
(3)淋巴细胞增殖抑制检测：将步骤(2)最终得到的MSC细胞与使用2μmol/L CFSE染色液染色5min的PBMC细胞以个数为1：5的比例在终浓度为1μg/mL anti-CD3与1μg/mLanti-CD28的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例3
本发明的实施例3提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，具体如下：
(1)MSC细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至2×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养22h；
(2)MSC细胞去增殖处理：吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含10μg/mL丝裂霉素C的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育2h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中；
(3)淋巴细胞增殖抑制检测：将步骤(2)最终得到的MSC细胞与使用2μmol/L CFSE染色液染色5min的PBMC细胞以个数为1：5的比例在终浓度为1μg/mL anti-CD3与1μg/mLanti-CD28的含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例4
本发明的实施例4提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(1)中含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基替换为DMEM/F12培养基。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例5
本发明的实施例5提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(1)中再次重复离心5min去上清操作2次，含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基替换为DMEM/F12培养基。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例6
本发明的实施例6提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(2)中置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育4h。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例7
本发明的实施例7提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(2)中置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育0.5h。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例8
本发明的实施例8提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(2)为：吸弃步骤(1)中各孔培养基，每孔加入500μl含10μg/mL丝裂霉素C的DMSO后，置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，孵育2h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1mLPBS洗涤，共洗涤2次。洗涤结束后，于培养孔中加入1mL含有10wt％胎牛血清的Gibco1640培养基，并将细胞培养板放入二氧化碳培养箱(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)中。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
实施例9
本发明的实施例9提供了一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述步骤(1)为：(1)MSC细胞接种：取400g细胞悬液，离心5min，去上清，加入含有10wt％胎牛血清的Gibco 1640培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整细胞浓度至1×105/mL；将调整后的细胞悬液接种于3块24孔培养板中，每块接种4个孔，每孔500μL，共接种12孔。将接种后的细胞板置于二氧化碳培养箱中(CO2浓度设置为：5.0vol％，温度设置为：37.0℃)，培养22h。
所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法应用于免疫调节中。
性能评估
1.重悬效果：分别记录实施例1-9重悬后细胞液是否出现不溶性絮状物。
2.抑制率测试：设置阳性组：含终浓度1μg/mL anti-CD3与1μg/mL anti-CD28的单独培养的PBMC细胞；设3个平行，每个平行2孔。实施例1-9步骤(3)共培养5天后，离心，使用生理盐水重悬进行流式检测，流式结果使用FLOWJO软件的增殖平台进行分析，可分别得到各实施例的DI值(体系内所有细胞分裂的次数除以体系内总细胞数)，作为衡量各组增殖能力的指标。抑制率＝(阳性组DI-共培养组DI)/阳性组DI。每个实施例间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法步骤分别设置三组平行实验，每个平行2孔。计算结果取平均值。
表1
Figure BDA0002910954330000091
表1为实施例3对淋巴细胞增殖抑制率的测试结果，表1中显示本申请方法检测数据稳定，同时抑制率数值高。
表2
Figure BDA0002910954330000092
Figure BDA0002910954330000101
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，其包括下面步骤：
(1)MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1；
(2)MSC细胞去增殖处理：将步骤(1)最终得到的MSC细胞去增殖后继续培养；
(3)淋巴细胞增殖抑制检测：将步骤(2)最终得到的MSC细胞与染色后的PBMC细胞进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。
2.根据权利要求1所述间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，当n＝1时，所述完全培养基含有8-12wt％胎牛血清。
3.根据权利要求2所述间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，所述完全培养基含有10wt％胎牛血清。
4.根据权利要求3所述间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，所述完全培养基为Gibco 1640培养基。
5.根据权利要求1-4任一项所述间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中接种培养的条件为：4.8-5.2vol％CO2，温度为30-40℃，培养20-24h。
6.根据权利要求5所述间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中MSC细胞去增殖的处理方式包括辐射去增殖、反复冻融、加入去增殖处理剂中一种或多种。
7.根据权利要求6所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，所述去增殖处理剂为丝裂霉素C的完全培养基。
8.根据权利要求7所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，所述丝裂霉素C的浓度为8-12μg/mL。
9.根据权利要求8所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中去增殖处理的时间为1-3h。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法在免疫调节中的应用。
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