CN111154828A - 间充质干细胞免疫功能检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种间充质干细胞免疫功能检测方法，包括以下步骤：(1)将脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养，得到待测样本；(2)检测待测样本中淋巴细胞的增殖活性及淋巴细胞亚群的比例，该间充质干细胞免疫功能检测方法适用于非诊断目的。本发明实施例所提供的间充质干细胞免疫功能检测方法将间充质干细胞与人外周血单个核细胞进行共培养，得到待测样本，通过对待测样本中的淋巴细胞亚群的比例和淋巴细胞的增殖活性的检测来评价间充质干细胞的免疫调节能力。如果淋巴细胞亚群的比例、和淋巴细胞增殖的变化量越大，说明该间充质干细胞的免疫功能更强、质量更好。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞应用技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞免疫功能检测方法。
背景技术
间充质干细胞最初在上世纪70年代首先从骨髓中分离出来的一群细胞。后来人们经过研究发现，这种细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导培养条件下能分化成为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等，这些细胞经过体外长期培养和多次传代后依然能保持分化潜能。由于其能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞，故称之为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)。上世纪90年代人们又从人脐带组织中分离出间充质干细胞，经过研究发现脐带间充质干细胞符合国际细胞治疗协会(international societyfor cellular therapy，ISCT)对间充质干细胞的定义。脐带间充质干细胞能够贴壁生长，高表达CD73、CD105、CD90等阳性细胞表面标志物，几乎不表达CD34、CD45、HLA-Dr等阴性细胞表面标志物。
随着研究的深入，人们发现间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还具有一定的疾病治疗潜能。目前在许多动物实验中已经发现，将间充质干细胞移植到疾病小鼠模型后，疾病症状能得到明显改善，其中包括糖尿病、支气管肺发育不良、早发性卵巢功能不全等疾病。除动物实验外，在一些临床治疗中也发现间充质干细胞对糖尿病、系统性红斑狼疮等一些免疫系统疾病也具有一定的疗效。机理研究发现间充质干细胞其不仅具有多向分化的潜能，更重要的是它具有其它干细胞不具有的免疫抑制和免疫调节能力。然而，对于间充质干细胞而言，还未发现有一种能够高效检测其免疫功能的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种高效检测间充质干细胞免疫功能的检测方法。
第一方面，本发明的一个实施例提供了一种间充质干细胞免疫功能检测方法，包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞与人外周血单个核细胞共培养，得到待测样本；
(2)检测待测样本中淋巴细胞的增殖活性及淋巴细胞亚群的比例；
间充质干细胞免疫功能检测方法适用于非诊断目的。
其中，淋巴细胞亚群是将淋巴细胞根据其免疫效应的不同分为不同的淋巴细胞亚群，包括诸如但不仅限于辅助性T淋巴细胞(Th)、细胞毒性T淋巴细胞(Tc/CTL)、调节性T淋巴细胞(Treg)、抑制性T淋巴细胞(Ts)、迟发型超敏反应性T淋巴细胞(TDTH)。间充质干细胞可以是包括但不限于脐带、脂肪、胎盘、骨髓等来源的间充质干细胞。
本发明实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法至少具有如下有益效果：
本发明实施例提供了一种间充质干细胞免疫功能检测方法，将间充质干细胞与外周血单个核细胞进行共培养，得到待测样本，通过对待测样本中的淋巴细胞亚群的比例和淋巴细胞的增殖活性的检测来评价间充质干细胞的免疫调节能力。如果淋巴细胞亚群的比例和淋巴细胞增殖的变化量越大，说明该间充质干细胞的免疫功能更强、质量更好。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，淋巴细胞亚群选自Treg细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞。采用上述不同的淋巴细胞亚群作为检测间充质干细胞的免疫功能的标准从而实现对其免疫功能更准确的判断。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，淋巴细胞亚群选自Treg细胞、Th17细胞。采用上述两种的淋巴细胞亚群作为检测间充质干细胞的免疫功能的标准从而达到快速准确判断的目的。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，Treg细胞的表型为CD4+CD25+FOXP3+。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，Th17细胞的表型为CD3+CD4+IL-17A+。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，采用CCK8(CellCounting Kit-8)检测淋巴细胞的增殖活性。CCK8是一种基于WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)而广泛应用于细胞增殖的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中而不需要预配各种成分。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原成橙黄色。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。而对于同样的细胞颜色的深浅和细胞数目呈线性关系，因此，能够用来快速检测细胞增殖活性。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，外周血单个核细胞在共培养前使用细胞激活因子刺激。通过细胞激活因子的预处理，有效刺激PBMCs的增殖，方便后续的检测过程的进行。细胞激活因子可以是诸如PHA(植物血凝素)、PMA(佛伯酯)。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，细胞激活因子为PHA。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，PHA的浓度为1～4μg/mL。采用上述浓度的PHA可以促进PMBC实现较高效率的增殖。过高或过低都不利于其实现刺激增殖的目的。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法，间充质干细胞在所述共培养前经抑制剂处理。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法的淋巴细胞增殖活性检测结果。
图2是本发明的一个实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法的淋巴细胞Tregs细胞群检测结果。
图3是本发明的一个实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法的淋巴细胞Th17细胞群检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
淋巴细胞增殖活性检测
1.人脐带MSCs分离和培养
采集产后足月胎儿的脐带组织，并对脐带组织进行处理，通过贴壁培养法或者酶消化培养法得到脐带MSCs。
2.人脐带MSCs处理
①MSCs细胞在T75细胞瓶里融合度达90％时，弃旧培养基，加入含10μg/mL丝裂霉素C的干细胞培养基，放回培养箱作用2小时。然后弃去丝裂霉素C培养基，生理盐水洗涤细胞4次，充分洗掉丝裂霉素C。
②然后加入含0.125％胰酶消化干细胞1min，最后加入含有10％胎牛血清(FBS)的完全培养基终止消化，并用移液管反复吹打使之成为单细胞悬液。
③将干细胞悬液收集到15mL离心管内，210g离心5min，弃上清。最后加新的培养基到干细胞，取少量计数。
3.人外周血单个核细胞(PBMCs)的分离提取
采用肝素钠抗凝管采集血液，通过密度梯度离心法分离得到PBMCs。
4.PBMCs处理
培养2小时后收集悬浮细胞后，410g，6min离心，重悬细胞，计数同时分离到的PBMCs根据实验设计组分别加入1×105个/孔，每孔分别用2μg/mL PHA和50nm的2-巯基乙醇刺激淋巴细胞。
5.检测脐带MSCs抑制PBMCs生长的抑制效率
根据细胞密度，将丝裂霉素C处理过的MSCs铺于96孔板，每孔固定的PBMCs细胞数为1×105个/孔，MSCs：PBMCs细胞数比例(0：1)、(1：10)、(1：50)对MSCs细胞进行铺板，并将孔板放置在CO2培养箱。
MSCs和PBMCs共孵育3天后，分别加入20μL Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂孵育2h，最后取上清，用波长450nm检测OD值，计算淋巴细胞增殖活性(增殖率)。
结果如图1所示。图1是本发明的一个实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法的淋巴细胞增殖活性检测结果。从图1中可以看出，PBMCs的扩增随着MSCs的增加而受到抑制，且P2和P5代MSCs结果具有同样的规律。
实施例2
淋巴细胞亚群检测
步骤1～3如实施例1。
4.根据细胞密度，将丝裂霉素C处理过的干细胞铺于24孔板，每孔固定的PBMCs细胞数为2×106个/孔，MSCs：PBMCs细胞数比例(0：1)、(1：10)、(1：50)对MSC细胞进行铺板，并将孔板放置在CO2培养箱。
5.1Treg细胞群检测
应用流式细胞仪上机检测CD4+CD25+FOXP3+细胞群即为Tregs细胞。
结果如图2所示。图2是本发明的一个实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法的淋巴细胞Tregs细胞群检测结果。从图2中可以看出，人脐带MSCs对CD4+CD25+FOXP3+细胞群的抑制作用随着浓度的增加而增强，P2代和P5代MSCs结果呈现同样规律。
5.2Th17细胞群检测
检测前6小时，在设置检测IL17的实验组里分别加入ionomycin激活剂(终浓度为1μg/mL)和Brefeldin-A阻断剂(终浓度为10μg/mL)。刺激6小时后，收细胞。应用流式细胞仪上机检测CD3+CD4+IL-17A+细胞群即为Th17细胞群。
结果如图3所示。图3是本发明的一个实施例的间充质干细胞免疫功能检测方法的淋巴细胞Th17细胞群检测结果。从图3中可以看出，人脐带MSCs对CD3+CD4+IL-17A+细胞群的抑制作用随着浓度的增加而增强，而且P2代和P5代MSCs结果呈现同样规律。
通过上述实施例中的实验结果可以看出，采用脐带间充质干细胞与淋巴细胞共培养的方法来检测干细胞对淋巴细胞亚群的影响、对淋巴细胞增殖的抑制等都可以作为脐带间充质干细胞免疫调节能力的一种衡量，从而比较不同来源或具有其它不同特征的脐带间充质干细胞的差别，从而有效对不同的脐带间充质干细胞的免疫功能进行检测。当然，本发明所要求保护的并不仅限于对脐带间充质干细胞的免疫功能检测，对于其它类型的间充质干细胞，诸如脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等的免疫功能的检测同样适用以上方法。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (9)
1.一种间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养，得到待测样本；
(2)检测所述待测样本中淋巴细胞的增殖活性及淋巴细胞亚群的比例；
所述间充质干细胞免疫功能检测方法适用于非诊断目的。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，所述淋巴细胞亚群选自Treg细胞、Th17细胞。
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，所述Treg细胞的表型为CD4+CD25+FOXP3+。
4.根据权利要求2所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，所述Th17细胞的表型为CD3+CD4+IL-17A+。
5.根据权利要求1至4任一项所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，采用CCK8检测所述淋巴细胞的增殖活性。
6.根据权利要求1至4任一项所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞在所述共培养前使用细胞激活因子刺激。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，所述细胞激活因子为PHA。
8.根据权利要求7所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，所述PHA的浓度为1～4μg/mL。
9.根据权利要求1至4任一项所述的间充质干细胞免疫功能检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞在所述共培养前经抑制剂处理。
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