KR102428120B1

KR102428120B1 - 신규 줄기세포 배양용 조성물

Info

Publication number: KR102428120B1
Application number: KR1020200122849A
Authority: KR
Inventors: 임자옥; 구태우
Original assignee: 주식회사 티에스바이오
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2022-08-04
Also published as: WO2022065854A1; KR20220040084A; JP2023542045A

Abstract

본 발명은 산화 스트레스를 억제 활성이 증가되고 줄기세포 증식능을 최적화한 지방유래 중간엽 줄기세포(hAD-MSC) 배양을 위한 신규 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

Description

신규 줄기세포 배양용 조성물{A novel composition for stem cell culture}

본 발명은 신규 줄기세포 배양용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 지방유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 신규 줄기세포 배양용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 적절한 신호에 의한 자기 복제 및 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 전구세포로서 발생 단계에서부터 인체의 장기를 형성하고 성장 후에는 장기 및 조직의 기능을 복원하는 데 중요한 역할을 한다. 줄기세포는 발생 초기 배반포(blastocyst)에서 얻어지는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 발생과정이 끝난 성체 또는 태반에서 얻어지는 성체줄기세포(adult stem cell)가 있다. 배아줄기세포의 이용은 생명체 이용이라는 점에서 많은 윤리적인 문제를 안고 있어 실질적인 사용에 제한이 따른다. 반면, 성체줄기세포는 생체 내에 이식된 후 장기 특성에 맞게 분화하는 특이성 및 본래의 세포 특성과는 다른 종류의 세포로 교차 분화할 수 있는 유연성을 가지고 있고, 다양한 세포로 분화될 수 있는 다잠재성이 있음이 밝혀지면서 성체줄기 세포를 통한 세포 치료의 가능성을 높아지고 있다. 성체줄기세포 중 가장 얻기 쉽고 풍부한 양을 얻을 수 있는 방법은 지방조직에서 유래하는 지방줄기세포를 분리하는 것이며, 이를 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cell, ASCs)라고 한다. 지방조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, ASCs는 배양 시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 다양한 세포로의 분화가 가능하다는 것이다. 따라서 대량으로 지방 유래 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있는 배양용 조성물 개발에 대한 필요성이 요구되고 있다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2020-0028865호는 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 직접 분화용 배지, 그를 이용하여 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법, 및 그에 의해 제조된 중간엽 줄기세포에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 직접 분화용 배지에 관한 것으로 인간 지방 유래 줄기세포의 증식용으로는 부적합하다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 산화 스트레스를 억제 활성이 증가되고 줄기세포 증식능을 최적화한 신규 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 100 내지 150 ㎍/ml AA2P(ascorbic-acid-2-phosphate) 및 0.5 내지 2 μM Vitamin E, 5 내지 15 ㎍/ml 토마토추출물, 50 내지 200 ㎍/ml의 가죽나무잎추출물, 200 내지 400 nM의 바이칼레인(baicalein), 500 내지 700 nM의 루테올린(luteolin), 4 내지 6 μM의 퀘르세틴(quercetin), 10 내지 30 μM의 아스코빌-2,6-디팔메이트(ascorbyl-2,6-dipalmitate), 5 내지 15 μM의 비타민 D3, 1.5 내지 3.5 μM 감마-글루타밀 시스테인 에스터(γ-glutamyl cystein ester) 및 5 내지 20 μM/ml의 푸트레신(putrescine)을 포함하는, 지방유래 줄기세포 배양용 배지 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 개체의 체외로 분리된 지방유래 줄기세포를 상기 지방유래 줄기세포 배양용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 체외 배양방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 신규 줄기세포 배양용 조성물은 줄기세포의 산화스트레스 저항성 및 세포증식이 향상되어 인간 지방 유래 줄기세포(hAD-MSC)의 줄기세포능을 최적화 하기위한 배양용 배지 조성물로 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 Vitamin E 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 AA2P 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 토마토추출물 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 가죽나무잎추출물 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 Baicalein 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 Quercetin 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 Luteolin 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 Ascorbyl Palmitate 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양용 조성물 중 Vitamin D3 처리에 따른 스크리닝 방법에 관한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 GSH 분석 결과이고 (d)는 히스토그램이며 (e)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 10은 인간 제대혈 유래 줄기세포와의 비교를 통한 인간 지방 유래 줄기세포 특이적인 항산화능 증진효과 확인한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 11은 인간 제대혈 유래 줄기세포와의 비교를 통한 인간 지방 유래 줄기세포 특이적인 항산화능 증진효과 확인한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다.
도 12a는 인간 제대혈 유래 줄기세포와의 비교를 통한 인간 지방 유래 줄기세포 특이적인 항산화능 증진효과 확인한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다. *토마토 추출물, 가죽나무잎 추출물, AA2P 및 Vitamin D3를 사용하였다.
도 12b는 인간 제대혈 유래 줄기세포와의 비교를 통한 인간 지방 유래 줄기세포 특이적인 항산화능 증진효과 확인한 것으로 (a)는 실험 프로세스이고 (b)는 형광 현미경 사진이며 (c)는 산화 스트레스 저항력을 분석한 그래프이다. *Baicalein, Luteolin, Quercetin, AA2P 및 Vitamin E를 사용하였다.
도 13은 인간 제대혈 유래 줄기세포와의 비교를 통한 인간 지방 유래 줄기세포 특이적인 항산화능 증진효과 확인한 것으로 doubling time을 분석한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 doubling time 결과를 분석한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 cumulative population doubling level 결과를 분석한 그래프이다.
도 16은 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 17은 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 콜로니 수를 분석한 그래프이다.
도 18은 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 콜로니를 관찰한 사진이다.
도 19는 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 GSH 수준을 분석한 그래프이다.
도 20은 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 GSH Heterogeneity를 분석한 그래프이다.
도 21은 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 산화 스트레스 저항성을 분석한 그래프이다.
도 22는 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 T-cell proliferation의 억제능을 분석한 그래프이다.
도 23은 본 발명의 기초배지 3종(C1, C2, C3)을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포를 배양 후 Regulatory T-cell로의 분화능을 분석한 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"란 특정 세포로 분화할 수 있는 미분화된 생물학적 세포로서 미분화된 상태로 증식이 될 수 있는 세포를 의미한다. 이들 줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency)을 가지고 있는 것을 특징으로 하며, 개체를 형성할 수 있는 전능성(totipotency)을 가진 배아유래의 "배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)"와 성체로부터 유래한 "성체줄기세포(adult stem cells, ASC)"로 구분할 수 있다. 상기 "배아줄기세포"는 난자와 정자가 결합하여 수정란이 된 후, 하나의 세포로 시작한 수정란은 세포분열을 통해 여러 개의 세포로 이루어진 배반포가 되며, 상기 배반포의 안쪽에는 형성된 내세포괴로부터 유래한 세포들로서, 혈액, 뼈, 피부, 간 등 한 개체에 있는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 아울러, 상기 "성체줄기세포"는 발생 이후 죽은 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하기 위해 체세포 분열에 의해 증폭이 가능한 미분화된 세포를 의히하며, 여기에는 신경줄기세포, 조혈모 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 내피 줄기세포 등이 존재한다. 이들 성체줄기세포는 상기 배아 줄기세포보다는 분화능이 한정적이긴 하나, 기원과 다른 계통의 세포로 분화할 수도 있으며, 이를 교차분화(trasndifferentiation) 또는 가소성(plasticity)라고 한다. 성체 줄기세포는 분화가 안정적이어서 암세포 가능성이 없기 때문에, 이미 임상적 적용이 가능한 단계까지 왔으며, 배아줄기세포와는 다르게 수정란에 파괴가 없어서 윤리적으로도 문제가 되지 않는 반면, 얻을 수 있는 줄기세포수가 적고, 배양이 어렵다는 단점을 가지고 있다.

발명의 상세한 설명:

상기 배지 조성물에 있어서, 120 내지 130 ㎍/ml AA2P 및 0.8 내지 1.5 μM Vitamin E, 10 내지 12 ㎍/ml 토마토추출물, 70 내지 150 ㎍/ml의 가죽나무잎추출물, 250 내지 350 nM의 바이칼레인(baicalein), 550 내지 650 nM의 루테올린(luteolin), 4.5 내지 5.5 μM의 퀘르세틴(quercetin), 15 내지 25 μM의 아스코빌-2,6-디팔메이트(ascorbyl-2,6-dipalmitate), 7 내지 13 μM의 비타민 D3, 1.7 내지 3.2 μM 감마-글루타밀 시스테인 에스터(γ-glutamyl cystein ester) 및 7 내지 15 μM/ml의 푸트레신(putrescine)을 포함할 수 있다.

또한, 기본배지는 α-MEM이고 5 내지 15% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 0.5 내지 2% PS(Penicillin-Streptomycin)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 배지는 중간엽 줄기세포의 성장에 영향을 주는 중간엽 줄기세포 성장인자를 추가로 포함할 수 있다. 중간엽 줄기세포의 성장인자는 예를 들면, 인슐린(Insulin), 하이드로코르티존(Hydrocortisone), EGF(Epidermal Growth Factor), LIF(Leukemia Inhibitory Factor), GM-CSF(Granulocytemacrophage colony stimulating factor), EPO(Erythropoietin), FGF(Fibroblast Growth Factor), IGF(Insulin-like growth factor), PDGF(Platelet-derived growth factor), SCF(Stem cell factor), TGF(Transforming growth factor) 등이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 기초 스크리닝

본 발명자들은 인간 지방 유래 줄기세포(hAD-MSC)에서의 항산화능을 증진시키는 물질을 발굴하기 위한 스크리닝을 수행하였다. 구체적으로 세포는 인간 지방 유래 줄기세포를 웰 플레이트에 파종하였고(4x10³ cell/well) 배지는 α-MEM에 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1% PS(Penicillin-Streptomycin)를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 처리 물질을 다양한 농도별로 희석한 배양 배지로 바꿔주어 24시간동안 처리했다. 그 다음, 항산화제를 처리하여 2시간 동안 배양하였고, Mito-FT 염색 및 Endpoint measurement를 수행하였다. 처리 물질은 Vitamin E, AA2P, 토마토추출물, 가죽나무잎추출물, Baicalein, Quercetin, Luteolin, Ascorbyl Palmitate 및 Vitamin D3를 사용하였다.

실시예 2: 유세포분석

유세포분석법을 통한 MSC에서의 GSH 분포 측정은 인간 지방 유래 줄기세포(hAD-MSC)의 계대배양 4, 7, 15를 준비한 뒤 6-well 세포 배양 플레이트에 well당 70000 cells를 넣어준 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. 배지를 제거한 후 글루타치온 페록시다아제 4(glutathione peroxidase 4, GPX4) 억제제인 RSL3를 0.1/0.5/1 μM 농도로 넣고 37℃에서 1.5시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. RSL3가 포함된 배지를 제거한 후 5 μM Mito-FreSHtracer를 넣고 37℃에서 1.5시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. Mito-FreSHtracer가 포함된 배지를 제거한 후, 2 mL의 DPBS 로 세포를 2회 세척해주었다. 250μL 의 TrypLE Express를 넣고, 37℃에서 2분30초 동안 반응한 뒤, 2% FBS가 포함된 DPBS를 동량 넣어 세포를 플레이트에서 떼어주었다. 플레이트에서 떼어낸 세포를 FACS tube 로 옮겨 얼음에 보관한 뒤, Flow cytometry 장비를 이용해 형광 값을 측정하였다.

실시예 3: 형광 이미징

형광 이미징을 이용한 GSH 분포 측정은 인간 지방 유래 줄기세포(hAD-MSC)의계대배양 4, 7, 15를 준비한 뒤 96-well 세포 배양 플레이트에 well당 7000 cells/100㎕를 넣어준 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. 배지를 제거한 후 글루타치온 페록시다아제 4(glutathione peroxidase 4, GPX4) 억제제인 RSL3를 0.1/0.5/1μM 농도로 100㎕를 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 α-MEM에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 1X 페니실린-스트렙토마이신이 포함되었다. RSL3가 포함된 배지를 제거한 후 15 μM Mito-FreSHtracer를 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이 때 사용되는 배지는 10mM HEPES를 포함한 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)가 사용되었다. 측정 전 배지 상의 Mito-FreSHtracer를 제거해 주기 위해 10 mM HEPES를 포함한 HBSS로 배지를 교환해준 후 공초점 이미지 장비인 operetta를 이용해 형광이미지를 측정하였다.

실시예 4: 히스토그램 분석

각 세포 내의 F510 (Mito-FreSHtracer가 SH기와 결합했을 때의 형광 값)과 F580 (Mito-FreSHtracer가 SH와 결합하지 않은 상태로 자체 형광 값)의 형광 값을 측정한 뒤 F510값을 F580값으로 나눈 값을 세포 내 GSH 평균 값을 의미하는 F510/F580 ratio 값으로 구하였다. prism 5 프로그램을 사용해 각 세포가 갖는 F510/ F580 ratio값을 X축으로 F510/F580 ratio값에 해당되는 세포의 %양을 Y축으로 히스토그램으로 나타내었다. Flow cytometry를 분석하는 Flowjo 소프트웨어를 이용하여 모든 샘플에서 Alexa 430/PE(F510/F580) 파라미터를 분석하였고, F510/F580의 분포를 나타내는 히스토그램이 두 개의 peak로 나뉘는 지점을 기준으로 GSH High(오른쪽 피크), Low cell(왼쪽 피크)을 나누어 해당하는 세포의 비율을 %로 나타내었다

그 결과, Vitamin E는 2.5 μM, AA2P는 250 μg/ml, 토마토추출물은 10 μg/ml, 가죽나무잎추출물은 200 μg/ml, Baicalein은 0.625 μM, Quercetin은 10 μM, Luteolin은 1.25 μM, Ascorbyl Palmitate은 50 μM, Vitamin D3는 25 μM부터 세포독성을 갖는 것으로 나타났다(도 1 내지 9).

실시예 5: 다른 줄기세포와 비교

본 발명자들은 인간 제대 유래 줄기세포(hUC-MSC) 및 인간 제대혈 유래 줄기세포(hUCB-MSC)와의 비교를 통해 인간 지방 유래 줄기세포 특이적인 항산화능 증진효과를 확인하였다. 실험방법은 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 일 실시예에 따라 발굴한 항산화능 증진 물질은 인간 지방 유래 줄기세포에 특이적인 것임을 확인하였다(도 10 내지 13)

실시예 6: 배지의 제조

본 발명자들은 상기 실시한 스크리닝 방법에 따라 선발한 항산화능 증진 물질을 이용하여 배지를 제조하였다. 먼저, α-MEM에 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1% PS (Penicillin-Streptomycin)를 첨가한 배지에 AA2P(ascorbic-acid-2-phosphate) 120 ㎍/ml 및 Vitamin E 1 μM를 첨가하여 기초배지 C1을 제조하였다. 또한, 상기 배지에 토마토추출물 10 ㎍/ml, 가죽나무잎추출물 100 ㎍/ml, Baicalein 300 nM, Luteolin 600 nM 및 Quercetin 5 μM를 첨가하여 기초배지 C2를 제조하였다. 아울러, 상기 배지에 C1, C2에 포함된 모든 물질을 첨가하고 Ascorbyl 2,6-dipalmitate 20 μM, Vitamin D3 10 μM, γ-glutamyl cystein ester 2.5 μM, Putrescine 10 μM/ml을 추가하여 C3 배지를 제조하였다.

실시예 7: 세포해동 및 배양

냉장 보관한 동결바이알을 항온수조(Water bath)에 1분간 거치 후 50 ml conical tube에 4 ml의 배양액과 해동된 바이알의 용액과 혼합하였다. 그 후 4℃, 1,700rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였고 펠렛(pellet)이 보이는지 육안으로 확인을 하고, 상등액을 제거하였다. 배양액 5 ml을 첨가하여 세포를 풀어준 뒤 세포수 측정용 샘플을 채취 후 세포수 측정을 위해 배양용기에 배양액과 세포를 혼합하여 넣어주었다(T-75 flask 1개 기준, 5.0x10⁶ cells/12 ml). 상기 배양용기를 37℃, 5% CO₂ 배양기에 거치하였고 배양일로부터 2일차에 배양액 교체를 하였으며 배양용기 면적의 80%이상 차지할 때까지 배양하였다(배양일로부터 3일차).

실시예 8: 세포수집 및 계대 배양

배양용기에 들어있는 배양액을 제거하였고 DPBS 5 ml을 첨가하여 배양용기 바닥을 세척 후 제거하였다. 그 후, 세포처리액 1.5~2 ml을 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3분간 거치한 다음 현미경으로 단일세포로 되었는지 확인을 하였다. 이어서 배양액 5 ml을 넣고, 세포 수확 후 50 ml conical tube에 옮긴 다음 총 부피가 10 ml이 되도록 배양용기에 배양액을 넣고 한번 더 회수하였다. 4℃, 1,700rpm 조건으로 5분간 원심분리하였고 펠렛이 보이는지 육안으로 확인을 하고, 상등액을 제거하였다. 그 후, DPBS 또는 배양액 10 ml을 첨가하여 세포를 풀어준 뒤 세포수 측정용 샘플을 채취 후 세포수 측정을 하였고 배양용기에 배양액과 세포를 혼합하여 넣어주었다(T-75 flask 기준, 5.0x10⁶ cells/12 ml). 상기 배양용기를 37℃, 5% CO₂ 배양기에 거치하였고 배양일로부터 2일차에 배양액 교체를 하였으며 배양용기 면적의 80%이상 차지할 때까지 배양하였다(배양일로부터 3일차).

실시예 9: 세포수 및 생존율 측정

세포수측정용 샘플을 20 ㎕ 피펫(pipette)을 사용하여 채취 후 Trypan blue 20 ㎕에 1:1로 희석하였고 혈구계(Hemocytometer)에 넣고, 현미경으로 확인하여 세포수를 측정하였다. 세포수는 하기 수식 1로 생존율은 하기 수식 2로 계산하였다.

(수식 1)

세포수 x 희석배수 x 1/4 x 총 부피(용량).

(수식 2)

살아있는 세포수/(살아있는 세포수 + 죽은 세포수) X 100.

실시예 10: 항산화 테스트

10-1: CPDL(Cell Population Doubling Time)

본 발명자들은 본 발명의 항산화제 첨가 기초배지 3종(C1, C2, C3), 기초배지 및 상용화 비교배지를 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포(BA200220-1, BA200220-2, BA200220-3)의 CPDL을 분석하였다. 구체적으로 상기 3종의 p1 cell stock을 해동하여 5종의 배지에서 각각 4 passage 계대는 5E+5/75T 플라스크(flask)로 파종(seeding)하여 이틀마다 배양 배지를 교체하였다. 결과 분석은 세 가지 세포에 대한 각각의 결과 없이 평균을 내어, 배지간의 비교 값으로 표시하였다. 상기 5종 배지의 doubling time을 비교한 결과, 기초배지와 C2배지에 비해 C1, C3배지, 비교배지가 낮게 나타났다(도 14). CPDL값도 마찬가지로 비교배지, C1과 C3배지, 기초배지와 C1배지에서 배양한 세포 순서대로 높은 수치를 나타내었다(도 15 및 16).

10-2: CFU(Colony-forming unit)

본 발명자들은 상기 실시예 4-1의 세포를 이용하여 10, 20 cells/cm², 두 조건으로 8일간 배양한 후 콜로니 수를 비교 분석하였다. 그 결과, 기초배지와 C2 배지와 비교하여 C1, C3, 비교배지에서 배양한 세포들이 더 많은 수의 콜로니를 형성하였고 C1, C3 배지의 콜로니 보다 비교배지의 콜로니의 크기가 상대적으로 크게 형성되었음을 확인하였다(도 17 및 18).

10-3: FreSHtracer assay

본 발명자들은 인간 지방 유래 줄기세포를 웰 플레이트에 파종하였다(6x10³ cell/well). 24시간 동안 배양한 후 항산화제를 처리하여 2시간 동안 배양하였고, Mito-FT 염색 및 Endpoint measurement를 수행하였다.

GSH 수준 분석 결과 mitochondrial GSH의 양을 나타내는 GM값은 유의성 있는 차이를 나타내지 않았고 세포 간 GSH의 양이 분산된 정도를 나타내는 GSH Heterogeneity 분석 결과 상기 5종의 배지에서 배양한 세 종류의 세포 모두 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다(도 19 및 20).

10-4: 산화스트레스 저항성

산화스트레스에 대한 저항성 분석 결과, 비교배지, C3, C1 배지 순서대로 배양한 세포가 전반적으로 높게 나타났다(도 21).

10-5: 항-염증 분석

본 발명자들은 분열 정도를 알게 해주는 CFSE 형광물질로 표지한 인간 말초 혈액 단핵세포(hPBMC)를 U-bottom 웰 플레이트에 파종하고(1x10⁵ cell/well), T-cell의 활성화를 촉진하는 PHA로 5일간 stimulation시킨다. 그 다음, 유세포 분석기를 이용하여 활성도를 비교분석하였다.

T-cell proliferation의 억제능 확인 결과 5종 배지에서 배양한 모든 세포들이 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다. 또한 CD4+ T-cell 중에서 Regulatory T-cell로의 분화를 높이는 능력을 분석한 결과 5종 배지에서 배양한 모든 세포들이 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다(도 22 및 23).

상기 실시예 분석 결과를 정리하면, 기초배지, 기초배지에 항산화제를 첨가한 C1, C2, C3 배지, 상용화 비교배지를 포함하는 5종의 항산화 테스트 분석 결과 CPDL, CFU에서 C1과 C3배지가 비교배지와 비슷한 분열속도인 doubling level 및 colony 형성능을 나타내었다. 산화스트레스에 대한 저항성은 C3 배지가 비교배지와 유사하게 저항성이 높게 관찰되었고 Mitochondrial GSH와 항-염증 활성은 상기 5종의 모든 배지에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.

결론적으로, 기초 스크리닝 과정을 통해 항산화 증진 물질을 선발하고 이를 기반으로 제조한 본 발명의 신규 줄기세포 배양용 조성물을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포(hAD-MSC)를 배양한 결과 상용화 배지와 유사한 세포증식 및 산화 스트레스 저항성을 나타내었으므로 줄기세포능을 최적화 하기위한 배양용 조성물로 활용가능하다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

120 내지 130 ㎍/ml AA2P(ascorbic-acid-2-phosphate) 및 0.8 내지 1.5 μM Vitamin E, 10 내지 12 ㎍/ml 토마토추출물, 70 내지 150 ㎍/ml의 가죽나무잎추출물, 250 내지 350 nM의 바이칼레인(baicalein), 550 내지 650 nM의 루테올린(luteolin), 4.5 내지 5.5 μM의 퀘르세틴(quercetin), 15 내지 25 μM의 아스코빌-2,6-디팔메이트(ascorbyl-2,6-dipalmitate), 7 내지 13 μM의 비타민 D3, 1.7 내지 3.2 μM 감마-글루타밀 시스테인 에스터(γ-glutamyl cystein ester) 및 7 내지 15 μM/ml의 푸트레신(putrescine)을 포함하는, 지방유래 줄기세포 배양용 배지 조성물.

삭제

제1항에 있어서,
기본배지는 α-MEM이고 5 내지 15% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 0.5 내지 2% PS(Penicillin-Streptomycin)를 추가로 포함하는, 조성물.

개체의 체외로 분리된 지방유래 줄기세포를 제1항 및 제3항 중 어느 한 항의 지방유래 줄기세포 배양용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 체외 배양방법.