JP2023542045A - 新規な幹細胞培養用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、酸化ストレスの抑制活性が増加し、幹細胞増殖能を最適化した脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）培養のための新規な幹細胞培養用培地組成物を提供する。

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本願は、２０２０年９月２３日付の大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１２２８４９号に対する優先権を主張し、該出願のあらゆる内容は、全体として本明細書に参照として含まれる。

本発明は、新規な幹細胞培養用組成物に係り、さらに詳細には、脂肪由来間葉系幹細胞培養のための新規な幹細胞培養用組成物に関する。
［背景技術］
本発明は、幹細胞培養用組成物に係り、より具体的には、脂肪由来間葉系幹細胞の培養用新規な培地組成物に関する。

幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、適切な信号による自己複製及び多様な組織に分化することができる能力を有した前駆細胞であって、発生段階から人体の臓器を形成し、成長後には、臓器及び組織の機能の復元に重要な役割を果たす。幹細胞は、発生初期胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）から得られる胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と発生過程済の成体または胎盤から得られる成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とがある。胚性幹細胞の利用は、生命体利用という点で多くの倫理的な問題を抱いており、実質的な使用に制限が伴う。一方、成体幹細胞は、生体内に移植された後、臓器特性に合わせて分化する特異性及び本来の細胞特性とは異なる種類の細胞に交差分化することができる柔軟性を有しており、多様な細胞に分化される多潜在性があることが明らかになり、成体幹細胞を通じた細胞治療の可能性が高まっている。成体幹細胞のうち、最も得やすく、豊富な量が得られる方法は、脂肪組織から由来する脂肪幹細胞を分離することであり、それを脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＡＳＣｓ）と称する。脂肪組織は、多量の組織採取が容易であって、幹細胞の収穫に良い条件を有しており、ＡＳＣｓは、培養時に、安定した成長と増殖とを示し、分化を誘導した時、多様な細胞への分化が可能であるということである。したがって、大量で脂肪由来間葉系幹細胞を収得することができる培養用組成物の開発に対する必要性が要求されている。これと関連して、大韓民国公開特許第２０２０－００２８８６５号は、多能性幹細胞由来間葉系幹細胞直接分化用培地、それを用いて間葉系幹細胞を製造する方法、及びそれによって製造された間葉系幹細胞について開示している。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
しかし、前記先行技術の場合、胚性幹細胞由来間葉系幹細胞直接分化用培地に関するものであって、ヒト脂肪由来幹細胞の増殖用としては不適である。
［課題を解決するための手段］
本発明は、前記問題点を含んで多様な問題点を解決するためのものであって、酸化ストレスの抑制活性が増加し、幹細胞増殖能を最適化した新規な幹細胞培養用培地組成物を提供することを目的とする。しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。
本発明の一観点によれば、１００～１５０μｇ／ｍｌ ＡＡ２Ｐ（ａｓｃｏｒｂｉｃ－ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び０．５～２μＭ ビタミンＥ（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ）；５～１５μｇ／ｍｌ トマト抽出物；５０～２００μｇ／ｍｌのニワウルシ葉抽出物；２００～４００ｎＭのバイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）；５００～７００ｎＭのルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）；４～６μＭのケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）；１０～３０μＭのアスコルビル－２，６－ジパルミテート（ａｓｃｏｒｂｙｌ－２，６－ｄｉｐａｌｍｉｔａｔｅ）；５～１５μＭのビタミンＤ３；１．５～３．５μＭ γ－グルタミルシステインエステル（γ－ｇｌｕｔａｍｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎ ｅｓｔｅｒ）；及び５～２０μＭ／ｍｌのプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）；を含む脂肪由来幹細胞培養用培地組成物が提供される。

本発明の他の一観点によれば、個体の体外に分離された脂肪由来幹細胞を前記脂肪由来幹細胞培養用培地で培養する段階を含む脂肪由来幹細胞の体外培養方法が提供される。
［発明の効果］
前記のようになされた本発明の新規な幹細胞培養用組成物は、幹細胞の酸化ストレス抵抗性及び細胞増殖が向上して、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）の幹細胞能を最適化するための培養用培地組成物として活用することができる。もちろん、このような効果によって、本発明の範囲が限定されるものではない。

前記幹細胞培養用新規な組成物は、特定の実施形態を参照して記載されたが、当業者ならば、添付の請求項によって規定される本発明の技術的特徴及び範囲から外れず、前記実施形態に多様な変形及び変化が導入されうるということを理解できるであろう。
［図面の簡単な説明］
本発明の例示的な実施形態は、下記の添付図面と共に後述する詳細な説明からより詳しく説明される：
［図１Ａないし図１Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物スクリーニングにおいて、ビタミンＥの添加による結果を示すものであって、図１Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図１Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図１Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図１Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図１Ｅは、処理されたビタミンＥの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図２Ａないし図２Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、図２Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図２Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図２Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図２Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図２Ｅは、処理されたＡＡ２Ｐの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図３Ａないし図３Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、トマト抽出物処理による結果を示すものであって、図３Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図３Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図３Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図３Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図３Ｅは、処理されたトマト抽出物の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図４Ａないし図４Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）葉抽出物処理による結果を示すものであって、図４Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図４Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図４Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図４Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図４Ｅは、処理されたニワウルシ葉抽出物の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図５Ａないし図５Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、バイカレイン処理による結果を示すものであって、図５Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図５Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図５Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図５Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図５Ｅは、処理されたバイカレインの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図６Ａないし図６Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図６Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図６Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図６Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図６Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図６Ｅは、処理されたケルセチンの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図７Ａないし図７Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図７Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図７Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図７Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図７Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図７Ｅは、処理されたケルセチンの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図８Ａないし図８Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、アスコルビルパルミテート（ａｓｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）処理による結果を示すものであって、図８Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図８Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図８Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図８Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図８Ｅは、処理されたアスコルビルパルミテートの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図９Ａないし図９Ｅ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ビタミンＤ３処理による結果を示すものであって、図９Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図９Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図９Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフであり、図９Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムであり、図９Ｅは、処理されたアスコルビルビタミンＤ３の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図１０Ａないし図１０Ｃ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン及びルテオリンが用いられたもの）のスクリーニング方法において、抗酸化剤処理による結果を示すものであって、図１０Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図１０Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図１０Ｃは、処理された抗酸化剤濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図１１Ａないし図１１Ｃ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１１Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図１１Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図１１Ｃは、処理された多様な要素の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図１２Ａないし図１２Ｃ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図１２Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図１２Ｃは、処理された多様な要素の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図１２Ｄないし図１２Ｆ］本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン、ルテオリン、ＡＡ２Ｐ及びビタミンＥが用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ｄは、前記方法で実験工程を示す概要図であり、図１２Ｅは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真であり、図１２Ｆは、処理された多様な要素の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。

［図１３］ヒト臍帯血由来幹細胞との比較を通じたヒト脂肪由来幹細胞の特異的な抗酸化能の増進効果を確認したものであって、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）を分析した結果を示すグラフである。

［図１４］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、倍加時間を分析した結果を示すグラフである。

［図１５］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、累積群集倍加レベル（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）を分析した結果を示すグラフである。

［図１６］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、顕微鏡で観察した写真である。

［図１７］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、コロニー数を分析した結果を示すグラフである。

［図１８］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、コロニーを観察した結果を示す一連の写真である。

［図１９］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、ＧＳＨレベルを分析した結果を示すグラフである。

［図２０］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、ＧＳＨ異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を分析した結果を示すグラフである。

［図２１］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、酸化ストレス抵抗性を分析した結果を示すグラフである。

［図２２］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、Ｔ－細胞増殖抑制能を分析した結果を示すグラフである。

［図２３］本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、調節Ｔ－細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ）への分化能を分析した結果を示すグラフである。
［発明を実施するための形態］
＜用語の定義：＞
以下、本添付図面を参照して、本発明をより詳しく説明する。

＜用語の定義：＞
本明細書で使われる用語「幹細胞」とは、特定の細胞に分化することができる未分化された生物学的細胞であって、未分化された状態で増殖になる細胞を意味する。これらの幹細胞は、多様な細胞に分化することができる万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有していることを特徴とし、個体を形成する全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有した胚芽由来の「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」と成体から由来した「成体幹細胞（ＡＳＣ）」とに区分することができる。前記「胚性幹細胞」は、卵子と精子とが結合して受精卵になった後、１つの細胞で始めた受精卵は、細胞分裂を通じて複数個の細胞からなる胚盤胞になり、前記胚盤胞の内側には、形成された内細胞塊から由来した細胞であって、血液、骨、皮膚、肝など一個体にあるあらゆる組織の細胞に分化することができる能力を保有している。また、前記「成体幹細胞」は、発生以後、死んだ細胞を代替し、損傷した組織を再生するために、体細胞分裂によって増幅が可能な未分化された細胞を意味し、これには、神経幹細胞、造血母幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞などが存在する。これらの成体幹細胞は、前記胚性幹細胞よりは分化能が限定的であるが、起源と異なる系統の細胞に分化することもでき、それを交差分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）または可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）と称する。成体幹細胞は、分化が安定的なので、癌細胞可能性がないために、既に臨床的適用が可能な段階まで来て、胚性幹細胞とは異なって、受精卵に破壊がなくて、倫理的でも問題にならない一方、得れれる幹細胞数が少なく、培養が難しいという短所を有している。

＜発明の詳細な説明：＞
本発明の一観点によれば、１００～１５０μｇ／ｍｌ ＡＡ２Ｐ及び０．５～２μＭ ビタミンＥ；５～１５μｇ／ｍｌ トマト抽出物；５０～２００μｇ／ｍｌのニワウルシ葉抽出物；２００～４００ｎＭのバイカレイン；５００～７００ｎＭのルテオリン；４～６μＭのケルセチン；１０～３０μＭのアスコルビル－２，６－ジパルミテート；５～１５μＭのビタミンＤ３；１．５～３．５μＭ γ－グルタミルシステインエステル；及び５～２０μＭ／ｍｌのプトレシン；を含む脂肪由来幹細胞培養用培地組成物が提供される。
前記培地組成物において、１２０～１３０μｇ／ｍｌ ＡＡ２Ｐ及び０．８～１．５μＭ ビタミンＥ；１０～１２μｇ／ｍｌ トマト抽出物；７０～１５０μｇ／ｍｌのニワウルシ葉抽出物；２５０～３５０ｎＭのバイカレイン；５５０～６５０ｎＭのルテオリン；４．５～５．５μＭのケルセチン；１５～２５μＭのアスコルビル－２，６－ジパルミテート；７～１３μＭのビタミンＤ３；１．７～３．２μＭ γ－グルタミルシステインエステル；及び７～１５μＭ／ｍｌのプトレシン；を含みうる。

また、基本培地は、α－ＭＥＭであり、５～１５％ ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）及び０．５～２％ ＰＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）をさらに含みうる。

本発明の他の一観点によれば、個体の体外に分離された脂肪由来幹細胞を前記脂肪由来幹細胞培養用培地で培養する段階を含む脂肪由来幹細胞の体外培養方法が提供される。
本発明の培養用培地は、間葉系幹細胞の成長に影響を与える間葉系幹細胞成長因子をさらに含みうる。間葉系幹細胞の成長因子は、例えば、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）、ＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＰＯ（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などがある。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。

＜実施例１：基礎スクリーニング＞
本発明者らは、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）での抗酸化能を増進させる物質を発掘するためのスクリーニングを行った。具体的に、細胞は、ヒト脂肪由来幹細胞をウェルプレートに播種し（４ｘ１０^３ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、培地は、α－ＭＥＭに１０％ ＦＢＳ、１％ ＰＳを添加して２４時間培養した後、処理物質を多様な濃度別に希釈した培養培地に変えて２４時間処理した。次いで、抗酸化剤を処理して２時間培養し、Ｍｉｔｏ－ＦＴ染色及び終点測定（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を行った。処理物質は、ビタミンＥ、ＡＡ２Ｐ、トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、バイカレイン、ケルセチン、ルテオリン、アスコルビルパルミテート及びビタミンＤ３を使用した。

＜実施例２：柔細胞分析＞
柔細胞分析法を通じたＭＳＣでのＧＳＨ分布測定のために、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）の継代培養物（４、７、及び１５継代）を準備した後、６－ｗｅｌｌ細胞培養プレートにｗｅｌｌ当たり７０，０００ ｃｅｌｌｓを分注した後、３７℃で２４時間培養した。この際、使われる培地は、α－ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた。培地を除去した後、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ４、ＧＰＸ４）抑制剤であるＲＳＬ３を０．１／０．５／１μＭの濃度で入れ、３７℃で１．５時間培養した。この際、使われる培地は、α－ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた。ＲＳＬ３が含まれた培地を除去した後、５μＭ Ｍｉｔｏ－ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを入れ、３７℃で１．５時間培養した。この際、使われる培地は、α－ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた。Ｍｉｔｏ－ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒが含まれた培地を除去した後、２ｍＬのＤＰＢＳで細胞を２回洗浄した。２５０μＬのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを入れ、３７℃で２分３０秒間反応した後、２％ ＦＢＳが含まれたＤＰＢＳを同量入れて細胞をプレートから取り外した。プレートから取り外した細胞をＦＡＣＳ ｔｕｂｅに移して氷に保管した後、柔細胞分析装備（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｅｖｉｃｅ）を用いて蛍光値を測定した。

＜実施例３：蛍光イメージング＞
蛍光イメージングを利用したＧＳＨ分布測定のために、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）の継代培養物（４、７、及び１５継代）を準備した後、９６－ｗｅｌｌ細胞培養プレートにｗｅｌｌ当たり７０００ ｃｅｌｌｓ／１００μｌを入れた後、３７℃で２４時間培養した。この際、使われる培地は、α－ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた。培地を除去した後、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）抑制剤であるＲＳＬ３を０．１／０．５／１μＭの濃度で１００μｌを入れ、３７℃で２時間培養した。この際、使われる培地は、α－ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた。ＲＳＬ３が含まれた培地を除去した後、１５μＭ Ｍｉｔｏ－ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを１００μｌずつ入れ、３７℃で１時間培養した。この際、使われる培地は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が使われた。測定前、培地上のＭｉｔｏ－ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを除去するために、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳに培地を交換した後、共焦点イメージ装備であるＯｐｅｒｅｔｔａを用いて蛍光イメージを測定した。

＜実施例４：ヒストグラム分析＞
各細胞内のＦ５１０（Ｍｉｔｏ－ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒがＳＨ基と結合した時の蛍光値）とＦ５８０（Ｍｉｔｏ－ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒがＳＨと結合していない状態で自体蛍光値）との蛍光値を測定した後、Ｆ５１０値をＦ５８０値で割った値を細胞内ＧＳＨ平均値を意味するＦ５１０／Ｆ５８０ ｒａｔｉｏ値で求めた。ｐｒｉｓｍ ５プログラムを使用して、各細胞が有するＦ５１０／Ｆ５８０ ｒａｔｉｏ値をＸ軸に、Ｆ５１０／Ｆ５８０ ｒａｔｉｏ値に該当する細胞の％量をＹ軸にヒストグラムで示した。Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを分析するＦｌｏｗｊｏソフトウェアを用いてあらゆるサンプルでＡｌｅｘａ ４３０／ＰＥ（Ｆ５１０／Ｆ５８０）パラメータを分析し、Ｆ５１０／Ｆ５８０の分布を示すヒストグラムが２つのｐｅａｋに分けられる地点を基準にＧＳＨ Ｈｉｇｈ（右側ピーク）、Ｌｏｗ ｃｅｌｌ（左側ピーク）を分けて該当する細胞の比率を％に示した。

その結果、ビタミンＥは、２５μＭ、ＡＡ２Ｐは、２５０μｇ／ｍｌ、トマト抽出物は、１０μｇ／ｍｌ、ニワウルシ葉抽出物は、２００μｇ／ｍｌ、バイカレインは、０．６２５μＭ、ケルセチンは、１０μＭ、ルテオリンは、１．２５μＭ、アスコルビルパルミテートは、５０μＭ、ビタミンＤ３は、２５μＭから細胞毒性を有すると表われた（図１Ａないし図９Ｅ）。

＜実施例５：他の幹細胞と比較＞
本発明者らは、ヒト臍帯由来幹細胞（ｈＵＣ－ＭＳＣ）及びヒト臍帯血由来幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）との比較を通じてヒト脂肪由来幹細胞の特異的な抗酸化能の増進効果を確認した。実験方法は、前記実施例１と同じ条件で行った。

その結果、本発明の一実施例によって発掘した抗酸化能増進物質は、ヒト脂肪由来幹細胞に特異的であるということを確認した（図１０Ａないし図１３）。

＜実施例６：培地の製造＞
本発明者らは、前記実施したスクリーニング方法によって選抜した抗酸化能増進物質を用いて培地を製造した。まず、α－ＭＥＭに１０％ ＦＢＳ、１％ ＰＳを添加した培地にＡＡ２Ｐ １２０μｇ／ｍｌ及びビタミンＥ １μＭを添加して基礎培地Ｃ１を製造した。また、前記培地にトマト抽出物１０μｇ／ｍｌ、ニワウルシ葉抽出物１００μｇ／ｍｌ、バイカレイン３００ｎＭ、ルテオリン６００ｎＭ及びケルセチン５μＭを添加して基礎培地Ｃ２を製造した。また、前記培地にＣ１、Ｃ２に含まれたあらゆる物質を添加し、アスコルビル－２，６－ジパルミテート２０μＭ、ビタミンＤ３ １０μＭ、γ－グルタミルシステインエステル２．５μＭ、プトレシン１０μＭ／ｍｌを追加してＣ３培地を製造した。

＜実施例７：細胞解凍及び培養＞
冷蔵保管した凍結バイアルを恒温水槽（Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）に１分間据え置きした後、５０ｍＬ ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅに４ｍＬの培養液と解凍されたバイアルの溶液と混合した。その後、４℃、１，７００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）が見えるかを肉眼で確認し、上澄み液を除去した。培養液５ｍＬを添加して細胞を解いた後、細胞数測定用サンプルを採取後、細胞数測定のために培養容器に培養液と細胞とを混合して入れた（Ｔ－７５ ｆｌａｓｋ １個基準、５．０ｘ１０^６ ｃｅｌｌｓ／１２ｍＬ）。前記培養容器を３７℃、５％ ＣＯ_２培養器に据え置き、培養日から２日目に培養液交替を行い、培養容器面積の８０％以上占めるまで培養した（培養日から３日目）。

＜実施例８：細胞収集及び継代培養＞
培養容器に入っている培養液を除去し、ＤＰＢＳ ５ｍＬを添加して培養容器の底面を洗浄後、除去した。その後、細胞処理液１．５～２ｍＬを添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２培養器で３分間据え置きした後、顕微鏡で単一細胞になったかを確認した。引き続き、培養液５ｍＬを入れ、細胞収獲後、５０ｍＬ ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅに移した後、総体積が１０ｍＬになるように培養容器に培養液を入れ、もう一回回収した。４℃、１，７００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、ペレットが見えるかを肉眼で確認し、上澄み液を除去した。その後、ＤＰＢＳまたは培養液１０ｍＬを添加して細胞を解いた後、細胞数測定用サンプルを採取後、細胞数測定を行い、培養容器に培養液と細胞とを混合して入れた（Ｔ－７５ ｆｌａｓｋ基準、５．０ｘ１０^６ ｃｅｌｌｓ／１２ｍＬ）。前記培養容器を３７℃、５％ ＣＯ_２培養器に据え置き、培養日から２日目に培養液交替を行い、培養容器面積の８０％以上占めるまで培養した（培養日から３日目）。

＜実施例９：細胞数及び生存率測定＞
細胞数測定用サンプルを２０μｌのピペット（ｐｉｐｅｔｔｅ）を使用して採取後、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ２０μｌに１：１で希釈し、血球計（Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に入れ、顕微鏡で確認して細胞数を測定した。細胞数は、下記数式１で、生存率は、下記数式２で計算した。

（数式１）
細胞数ｘ希釈倍数ｘ１／４ｘ総体積（容量）。

（数式２）
生きている細胞数／（生きている細胞数＋死んだ細胞数）ｘ１００。

＜実施例１０：抗酸化テスト＞
〔１０－１：ＣＰＤＬ（Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）
本発明者らは、本発明の抗酸化剤添加基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）、基礎培地及び商用化比較培地を用いてヒト脂肪由来幹細胞（ＢＡ２００２２０－１、ＢＡ２００２２０－２、ＢＡ２００２２０－３）のＣＰＤＬを分析した。具体的に、前記３種のｐ１ ｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋを解凍して５種の培地でそれぞれ４ｐａｓｓａｇｅ継代は５Ｅ＋５／７５Ｔフラスコ（ｆｌａｓｋ）で播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して２日ごとに培養培地を交換した。結果分析は、３種の細胞に対するそれぞれの結果なしに平均を出して、培地間の比較値で表示した。前記５種の培地の倍加時間を比較した結果、基礎培地とＣ２培地とに比べてＣ１、Ｃ３培地、比較培地が低く表われた（図１４）。ＣＰＤＬ値も、同様に比較培地、Ｃ１とＣ３培地、基礎培地とＣ１培地とで培養した細胞の順次に高い数値を示した（図１５及び図１６）。

〔１０－２：ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）〕
本発明者らは、前記実施例４－１の細胞を用いて１０、２０ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、２つの条件で８日間培養した後、コロニー数を比較分析した。その結果、基礎培地とＣ２培地と比較して、Ｃ１、Ｃ３、比較培地で培養した細胞がさらに多数のコロニーを形成し、Ｃ１、Ｃ３培地のコロニーよりも比較培地のコロニーのサイズが相対的に大きく形成されたということを確認した（図１７及び図１８）。

〔１０－３：ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ ａｓｓａｙ〕
本発明者らは、ヒト脂肪由来幹細胞をウェルプレートに播種した（６ｘ１０^３ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）。２４時間培養した後、抗酸化剤を処理して２時間培養し、Ｍｉｔｏ－ＦＴ染色及び終点測定を行った。

ＧＳＨレベル分析結果、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）ＧＳＨの量を示すＧＭ値は、有意性のある差を示せず、細胞間ＧＳＨの量が分散された程度を示すＧＳＨ異質性分析結果、前記５種の培地で培養した３種の細胞いずれも有意性のある差を示していない（図１９及び図２０）。

〔１０－４：酸化ストレス抵抗性〕
本発明者らは、ヒト脂肪由来幹細胞をウェルプレートに播種した（６ｘ１０^３ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）。酸化的ストレス誘導剤として１Ｓ，３Ｒ－ＲＳＬ３｛（１Ｓ，３Ｒ）－Ｍｅｔｈｙｌ ２－（２－ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ）－２，３，４，９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－［４－（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｏ［３，４－ｂ］ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ，Ｔｏｒｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ｝が処理された。２４時間培養以後、細胞に抗酸化剤を処理し、２時間さらに培養し、Ｍｉｔｏ－ＦＴ染色及び終点測定を行った。
酸化ストレスに対する抵抗性分析結果、比較培地、Ｃ３、Ｃ１培地の順次に培養した細胞が全般的に高く表われた（図２１）。

〔１０－５：抗炎症分析〕
本発明者らは、細胞分裂程度を指示するＣＦＳＥ蛍光物質で標識したヒト末梢血液単核細胞（ｈＰＢＭＣ）をＵ字底（Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ）ウェルプレートに播種し（１ｘ１０^５ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、Ｔ－細胞の活性化を促進するＰＨＡで５日間刺激した。次いで、柔細胞分析器を用いて活性度を比較分析した。

Ｔ－細胞増殖抑制能に対する確認結果、５種の培地で培養したあらゆる細胞が有意性のある差を示していない。また、ＣＤ４^＋ Ｔ－細胞中で調節Ｔ－細胞への分化を増加させる能力を分析した結果、５種の培地で培養したあらゆる細胞が有意性のある差を示していない（図２２及び図２３）。

前記実施例の分析結果をまとめれば、基礎培地、基礎培地に抗酸化剤を添加したＣ１、Ｃ２、Ｃ３培地、商用化比較培地を含む５種の抗酸化テスト分析結果、ＣＰＤＬ、ＣＦＵでＣ１とＣ３培地が比較培地と類似している倍加レベル及びコロニー形成能を示した。酸化ストレスに対する抵抗性は、Ｃ３培地が比較培地と類似に抵抗性が高く観察され、ミトコンドリアＧＳＨ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＧＳＨ）と抗炎症活性は、前記５種のあらゆる培地で有意差はなかった。

結論的に、基礎スクリーニング過程を通じて抗酸化増進物質を選抜し、それを基盤で製造した本発明の新規な幹細胞培養用組成物を用いてヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）を培養した結果、商用化培地と類似した細胞増殖及び酸化ストレス抵抗性を示したので、幹細胞能を最適化するための培養用組成物として活用可能である。

本発明は、前述した実施例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されねばならない。

本発明の例示的な実施形態は、下記の添付図面と共に後述する詳細な説明からより詳しく説明される：
本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物スクリーニングにおいて、ビタミンＥの添加による結果を示すものであって、図１Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物スクリーニングにおいて、ビタミンＥの添加による結果を示すものであって、図１Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物スクリーニングにおいて、ビタミンＥの添加による結果を示すものであって、図１Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物スクリーニングにおいて、ビタミンＥの添加による結果を示すものであって、図１Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物スクリーニングにおいて、ビタミンＥの添加による結果を示すものであって、図１Ｅは、処理されたビタミンＥの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、図２Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、図２Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、図２Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、図２Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、図２Ｅは、処理されたＡＡ２Ｐの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、トマト抽出物処理による結果を示すものであって、図３Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、トマト抽出物処理による結果を示すものであって、図３Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、トマト抽出物処理による結果を示すものであって、図３Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、トマト抽出物処理による結果を示すものであって、図３Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、トマト抽出物処理による結果を示すものであって、図３Ｅは、処理されたトマト抽出物の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）葉抽出物処理による結果を示すものであって、図４Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）葉抽出物処理による結果を示すものであって、図４Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）葉抽出物処理による結果を示すものであって、図４Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）葉抽出物処理による結果を示すものであって、図４Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）葉抽出物処理による結果を示すものであって、図４Ｅは、処理されたニワウルシ葉抽出物の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、バイカレイン処理による結果を示すものであって、図５Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、バイカレイン処理による結果を示すものであって、図５Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、バイカレイン処理による結果を示すものであって、図５Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、バイカレイン処理による結果を示すものであって、図５Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、バイカレイン処理による結果を示すものであって、図５Ｅは、処理されたバイカレインの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図６Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図６Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図６Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図６Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図６Ｅは、処理されたケルセチンの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図７Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図７Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図７Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図７Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ケルセチン処理による結果を示すものであって、図７Ｅは、処理されたケルセチンの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、アスコルビルパルミテート（ａｓｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）処理による結果を示すものであって、図８Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、アスコルビルパルミテート（ａｓｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）処理による結果を示すものであって、図８Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、アスコルビルパルミテート（ａｓｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）処理による結果を示すものであって、図８Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、アスコルビルパルミテート（ａｓｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）処理による結果を示すものであって、図８Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、アスコルビルパルミテート（ａｓｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）処理による結果を示すものであって、図８Ｅは、処理されたアスコルビルパルミテートの濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ビタミンＤ３処理による結果を示すものであって、図９Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ビタミンＤ３処理による結果を示すものであって、図９Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ビタミンＤ３処理による結果を示すものであって、図９Ｃは、ＧＳＨ分析結果を示す一連のグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ビタミンＤ３処理による結果を示すものであって、図９Ｄは、前記実験結果を示すヒストグラムである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物のスクリーニング方法において、ビタミンＤ３処理による結果を示すものであって、図９Ｅは、処理されたアスコルビルビタミンＤ３の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン及びルテオリンが用いられたもの）のスクリーニング方法において、抗酸化剤処理による結果を示すものであって、図１０Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン及びルテオリンが用いられたもの）のスクリーニング方法において、抗酸化剤処理による結果を示すものであって、図１０Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン及びルテオリンが用いられたもの）のスクリーニング方法において、抗酸化剤処理による結果を示すものであって、図１０Ｃは、処理された抗酸化剤濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１１Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１１Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１１Ｃは、処理された多様な要素の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ａは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ｂは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（トマト抽出物、ニワウルシ葉抽出物、ＡＡ２Ｐ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ及びビタミンＤ３が用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ｃは、処理された多様な要素の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン、ルテオリン、ＡＡ２Ｐ及びビタミンＥが用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ｄは、前記方法で実験工程を示す概要図である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン、ルテオリン、ＡＡ２Ｐ及びビタミンＥが用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ｅは、前記実験結果を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。 本発明の脂肪細胞由来間葉系幹細胞の培養用組成物（バイカレイン、ケルセチン、ルテオリン、ＡＡ２Ｐ及びビタミンＥが用いられたもの）のスクリーニング方法において、多様な要素の添加による結果を示すものであって、図１２Ｆは、処理された多様な要素の濃度による酸化ストレスに対する抵抗力を示すグラフである。 ヒト臍帯血由来幹細胞との比較を通じたヒト脂肪由来幹細胞の特異的な抗酸化能の増進効果を確認したものであって、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）を分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、倍加時間を分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、累積群集倍加レベル（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）を分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、顕微鏡で観察した写真である。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、コロニー数を分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、コロニーを観察した結果を示す一連の写真である。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、ＧＳＨレベルを分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、ＧＳＨ異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、酸化ストレス抵抗性を分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、Ｔ－細胞増殖抑制能を分析した結果を示すグラフである。 本発明の基礎培地３種（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を用いてヒト脂肪由来幹細胞を培養後、調節Ｔ－細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ）への分化能を分析した結果を示すグラフである。

Claims (4)

1. 基礎培地と、
   １００～１５０μｇ／ｍｌ ＡＡ２Ｐ及び０．５～２μＭ ビタミンＥと、
   ５～１５μｇ／ｍｌ トマト抽出物と、
   ５０～２００μｇ／ｍｌのニワウルシ葉抽出物と、
   ２００～４００ｎＭのバイカレインと、
   ５００～７００ｎＭのルテオリンと、
   ４～６μＭのケルセチンと、
   １０～３０μＭのアスコルビル－２，６－ジパルミテートと、
   ５～１５μＭのビタミンＤ３と、
   １．５～３．５μＭ γ－グルタミルシステインエステルと、
   ５～２０μＭ／ｍｌのプトレシンと、
   を含む、脂肪由来幹細胞培養用培地組成物。
2. ２０～１３０μｇ／ｍｌ ＡＡ２Ｐ及び０．８～１．５μＭ ビタミンＥと、
   １０～１２μｇ／ｍｌ トマト抽出物と、
   ７０～１５０μｇ／ｍｌのニワウルシ葉抽出物と、
   ２５０～３５０ｎＭのバイカレインと、
   ５５０～６５０ｎＭのルテオリンと、
   ４．５～５．５μＭのケルセチンと、
   １５～２５μＭのアスコルビル－２，６－ジパルミテートと、
   ７～１３μＭのビタミンＤ３と、
   １．７～３．２μＭ γ－グルタミルシステインエステルと、
   ７～１５μＭ／ｍｌのプトレシンと、
   を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記基本培地は、α－ＭＥＭであり、５～１５％ ＦＢＳ及び０．５～２％ ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
4. 個体の体外に分離された脂肪由来幹細胞を請求項１から請求項３のうち何れか一項に記載の脂肪由来幹細胞培養用培地で培養する段階を含む、脂肪由来幹細胞の体外培養方法。