CN113584116A - 一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，所述方法包括：一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，所述间充质干细胞免疫调控功能参数包括淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF‑α的变化量，其中，所述方法包括：按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞；利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组；根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果。有效解决了现有技术中间充质干细胞免疫调控功能检测过程繁琐的问题，有利于提高检测效率。

Description

一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法
技术领域
本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、和脐带等多种组织中分离，在不同条件诱导下，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等多种功能细胞。间充质干细胞通过多向分化与旁分泌作用发挥组织再生与损伤保护作用。间充质干细胞易于外源基因的转染和表达，也是细胞治疗、组织器官缺损修复及进行基因治疗的理想载体细胞。
间充质干细胞还特有免疫调控功能，通过细胞直接接触与分泌转化生长因子β、吲哚胺2，3双加氧酶、肝细胞生长因子、前列腺素E2、一氧化氮等因子，对自然杀伤细胞、树突状细胞以及B、T淋巴细胞等多种免疫细胞的活化、增殖与分化进行调控，并能提高调节性T(T regulatory，Treg)细胞的比例，维持体内免疫环境的稳定。目前间充质干细胞的免疫调控特性已被应用于机型移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、1型糖尿病、类风湿性关节炎、细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)等免疫异常和炎症相关疾病的临床研究中。
为了检验间充质干细胞在免疫调控功能方面的生物有效性，现有技术中的检测方法需要对其生物有效性的多种标志物只能通过逐一制备样本，逐一检测；随着检测标志物数量的增多，逐一检测的方式不仅成本高，且操作繁琐，不利于技术的发展和进步。
可见，现有技术有待进一步改进。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请公开了一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，能够解决现有技术中间充质干细胞免疫调控功能检测过程繁琐的问题，有利于提高检测效率。
本发明的技术方案如下：
一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，所述间充质干细胞免疫调控功能参数包括淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF-α的变化量，其中，所述方法包括：按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞；利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组；根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果。
其中，所述按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞包括：制备淋巴细胞悬液，并检测所述淋巴细胞悬液的浓度；及将间充质干细胞置于容器中，并将其培养至完全贴壁。
其中，所述方法还包括：使用染色剂对所述淋巴细胞悬液进行染色处理，并检测染色处理后的所述淋巴细胞悬液的浓度。
其中，所述方法具体包括：向所述淋巴细胞悬液中加入CFSE染色剂，使得所述染色剂的终浓度在第一染色剂浓度范围内；对染色后的所述淋巴细胞悬液进行孵育及淋巴细胞完全培养基重选细胞操作，之后检测处理后的所述淋巴细胞悬液的浓度。
其中，所述利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组的方法包括：按照预设比例向容置有所述间充质干细胞的容器及空置容器中加入已知浓度的所述淋巴细胞悬液，得到所述共培养组和所述对照组；当加入的所述淋巴细胞悬液为染色后的所述细胞悬液时，得到第一共培养组和第一对照组；当加入的所述淋巴细胞悬液为未染色的所述细胞悬液时，得到第二共培养组和第二对照组。
其中，所述根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果的方法包括：从所述第一共培养组和所述第一对照组中收集培养后的淋巴细胞，并分离得到细胞沉淀和/或上清液；对所述细胞沉淀和/或所述上清液进行检测，得到淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量和/或淋巴细胞分泌TNF-α的变化量。
其中，所述方法具体包括：采用酶联免疫法对所述上清液中进行TNF-α浓度进行检测，得到淋巴细胞分泌TNF-α的变化量。
其中，所述方法具体包括：对所述细胞沉淀进行死活标记及Treg细胞特异性抗体标记；对标记后的所述细胞沉淀进行检测，得到淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞Treg细胞亚群的比例变化量。
其中，所述根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果的方法包括：对培养后的所述第二共培养组和所述第二对照组加入刺激剂，并使得所述刺激剂的浓度达到预设的刺激剂浓度范围；收集刺激处理后的淋巴细胞，并进行死活标记及Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞中至少一种的特异性标记；对所述特异性标记后的淋巴细胞进行检测，确定特定淋巴细胞Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞亚群中至少一种的比例变化量。
其中，所述方法包括：所述刺激剂包括佛波酯、离子霉素或莫能霉素中的至少一种；所述所述佛波酯的添加终浓度为5-250ng/ml、所述离子霉素添加终浓度为0.1-5μg/ml、所述莫能霉素添加终浓度为0.5-5μg/ml。
区别于现有技术的，本申请通过合理安排实验方案，根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果。在多参数检测的过程中，能够有效降低检测次数，同时降低检测成本，提高检测效率。
附图说明
图1是本发明一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法第一实施方式的流程示意图；
图1A为本发明实施例3中间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Th1细胞)比例的影响结果图；
图1B为本发明实施例3中间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Th2细胞)比例的影响结果图；
图1C为本发明实施例3中间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Th17细胞)比例的影响结果图；
图2A为本发明实施例4中间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响结果图；
图2B为本发明实施例4中间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Treg细胞)比例的影响结果图；
图3为本发明实施例5中间充质干细胞对淋巴细胞TNF-α分泌的影响结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
请参考图1，本申请公开了一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，所述间充质干细胞免疫调控功能参数包括淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF-α的变化量，所述的检测方法为间充质干细胞与淋巴细胞共培养后进行检测，其中，所述方法包括：
S100、按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞。
S200、利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组。
S300、根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果。
本申请通过合理安排实验方案，根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果。在多参数检测的过程中，能够有效降低检测次数，同时降低检测成本，提高检测效率。
具体的，在所述步骤S100中，所述按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞包括：制备淋巴细胞悬液，并检测所述淋巴细胞悬液的浓度；及将间充质干细胞置于容器中，并将其培养至完全贴壁。其中，所述淋巴细胞包括PBMC或T淋巴细胞。
制备所述淋巴细胞的过程包括：
1)取10-20ml健康人抗凝全血，小心将血液加入预先装有等体积淋巴细胞分离液的50ml离心管内，500-1100g，离心20-30min；2)离心后，此时离心管中由上至下分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；3)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一离心管中，向离心管内加入40ml生理盐水，混匀细胞，离心力250g，离心10min；4)弃上清，向离心管内加入40ml生理盐水，混匀细胞，离心力250g，离心10min；5)弃上清，使用淋巴细胞完全培养基3-5ml重悬细胞，得到淋巴细胞悬液；6)取部分细胞悬液进行血细胞计数，根据计数所得的淋巴细胞浓度调整细胞悬液体积用于后续实验。
进一步的，制备所述淋巴细胞的过程还可以包括：使用染色剂对所述淋巴细胞悬液进行染色处理，并检测染色处理后的所述淋巴细胞悬液的浓度。其中，所述方法具体包括：向所述淋巴细胞悬液中加入CFSE染色剂，使得所述染色剂的终浓度在第一染色剂浓度范围内；对染色后的所述淋巴细胞悬液进行孵育及淋巴细胞完全培养基重选细胞操作，之后检测处理后的所述淋巴细胞悬液的浓度。进一步的，采用CFSE对淋巴细胞进行标记，检测淋巴细胞的增殖分裂状况。CFDA SE是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够通透细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，CFSE可以偶发性地(spontaneously)并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基发生结合反应，并标记这些蛋白。CFSE可以被490nm激光激发发射520nm(绿色)光。CFSE标记细胞的荧光非常均匀和稳定，细胞分裂增殖过程中，CFSE荧光标记可平均分配至两个子代细胞中，每分裂一次子代细胞的荧光会减弱一半，这样通过流式细胞仪检测就可以检测出没有分裂的细胞，分裂一次的细胞(1/2的荧光强度)，分离两次的细胞(1/4的荧光强度)，分裂三次的细胞(1/8的荧光强度)以及类似的其它分裂次数的细胞。通过检测细胞的不同分裂代次与其比例，可以得到细胞的分裂速度。
具体的，取上述分离完成且未接种完的淋巴细胞悬液，调整细胞悬液浓度至5E6-5E7/ml，取5-10mM的CFSE染料，按照终浓度为5μM将CFSE加入细胞悬液中，37℃避光孵育10min标记细胞；孵育完成后加入5倍的淋巴细胞完全培养基，置于4℃冰箱避光孵育5min，然后清洗细胞两次，离心力250g，离心10min，使用淋巴细胞完全培养基重选细胞，并计数，根据计数结果调整细胞浓度。
制备间充质干细胞的方法包括：
1)取新鲜收集的间充质干细胞，按照一定比例接种至12孔板内，加入间充质干细胞完全培养基至1ml/孔，每个孔板接种1-3孔，共接种2个12孔板；2)接种后置于37℃、5％CO2培养箱内培养一定时间至间充质干细胞完全贴壁，在细胞尚未开始增殖时开始接种淋巴细胞。
在所述步骤S200中，所述利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组的方法包括：按照预设比例向容置有所述间充质干细胞的容器及空置容器中加入已知浓度的所述淋巴细胞悬液，得到所述共培养组和所述对照组；当加入的所述淋巴细胞悬液为染色后的所述细胞悬液时，得到第一共培养组和第一对照组；当加入的所述淋巴细胞悬液为未染色的所述细胞悬液时，得到第二共培养组和第二对照组。
更进一步的，制备所述第二共培养组和第二对照组的方法包括：取贴壁后的间充质干细胞1板，吸弃现有培养基，取分离完成的淋巴细胞悬液，按照间充质干细胞数量与淋巴细胞数量以一定比例(1:5-1:10，比如1:5，1:7或1:10等)接种相应数量的淋巴细胞悬液至已接种间充质干细胞的培养内，作为第二共培养组，并另外接种淋巴细胞至空孔内，作为第二对照组，共接种2-6孔，分别作为阴性对照组与阳性对照组，并补充培养基至2-3ml/孔。该孔板用于间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞)比例影响实验。
更进一步的，制备所述第一共培养组和第一对照组的方法包括：取贴壁后的间充质干细胞1板，吸弃现有培养基，取上述染色完成的淋巴细胞，按照与所述第二共培养组和第二对照组中淋巴细胞接种数量于接种方案，将染色后的淋巴细胞接种至该孔板内，设置所述第一共培养组及所述第一对照组，所述第一对照组包括阴性对照组与阳性对照组。然后向第一共培养组、阳性对照组孔内按照培养体系添加刺激剂活化淋巴细胞，可选的，所述刺激剂包括植物血凝素(PHA)，且加入PHA液的终体积为2-10ug/ml，如，4ug/ml。该孔板用于间充质干细胞对淋巴细胞增殖抑制实验、对特定淋巴细胞亚群(Treg细胞)比例影响实验、对淋巴细胞TNF-α分泌抑制实验。
在所述步骤S300中，所述根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果的方法包括：
从所述第一共培养组和所述第一对照组中收集培养后的淋巴细胞，并分离得到细胞沉淀和/或上清液；具体的，对所述第一共培养组和所述第一对照组培养72h-96h后，收集淋巴细胞；2)250g离心5min，将培养上清收集至新管内，做好标记备用；对于细胞沉淀，使用1xPBS洗涤2遍，使用1xPBS重悬细胞。
对所述细胞沉淀和/或所述上清液进行检测，得到淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量和/或淋巴细胞分泌TNF-α的变化量。在本实施方式中，采用酶联免疫法对所述上清液中进行TNF-α浓度进行检测，得到淋巴细胞分泌TNF-α的变化量。具体的，可以采用人TNF-αELISA试剂盒中的样本稀释液，对培养上清进行一定倍数稀释；3)按照试剂盒说明检测培养上清中的TNF-α的OD值；4)根据试剂盒标曲与相应的稀释倍数，计算TNF-α含量；与所述第一阳性对照组相比，所述第一共培养组TNF-α含量变化趋势表明共培养后淋巴细胞TNF-α分泌量的影响趋势，如，抑制或促进。
进一步的：对所述细胞沉淀进行死活标记及Treg细胞特异性抗体标记；对标记后的所述细胞沉淀进行检测，得到淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞Treg细胞亚群的比例变化量。在本实施方式中，向所述细胞沉淀内加入死活染料，所死活染料包括使用的氨基反应性染料包括但不限于BD公司的Fixable Viability Stain系列、Biolegend公司的Zombie Dyes系列、eBiosciences公司的Fixable Viability Dye系列、Invitrogen公司的LIVE/DEAD Fixable系列等，进行细胞死活标记；标记完成后，洗涤未反应的染料后，对细胞进行固定、破膜；破膜完成后向细胞加入抗体CD45、CD4、CD25、FoxP3，对Treg细胞进行标记；标记完成后，洗涤多余未结合抗体，使用1xPBS重选细胞，使用流式细胞仪进行上机分析；通过与所述第一阳性对照组相比，所述第一共培养组淋巴细胞增值峰变化趋势，高代次淋巴细胞比例变化趋势，表明共培养后淋巴细胞增殖比例变化趋势，间充质干细胞对淋巴细胞的增殖的作用类型，如，抑制或促进。进一步的，与所述第一阳性对照组相比，所述第一共培养组CD25+FoxP3+表达量的变化趋势，即Treg细胞比例变化趋势，表明共培养后淋巴细胞对表达Treg细胞的特征性标记CD25+FoxP3+表达的作用趋势，间充质干细胞对Treg细胞在淋巴细胞中的比例的影响趋势。
在另一个实施方式中，所述根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果的方法包括：对培养后的所述第二共培养组和所述第二对照组加入刺激剂，并使得所述刺激剂的浓度达到预设的刺激剂浓度范围；收集刺激处理后的淋巴细胞，并进行死活标记及Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞中至少一种的特异性标记；对所述特异性标记后的淋巴细胞进行检测，确定特定淋巴细胞Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞亚群中至少一种的比例变化量。其中，所述刺激剂包括佛波酯、离子霉素或莫能霉素中的至少一种；所述所述佛波酯的添加终浓度为5-250ng/ml、所述离子霉素添加终浓度为0.1-5μg/ml、所述莫能霉素添加终浓度为0.5-5μg/ml。具体的，所述Th1细胞表型为CD3+CD4+IFN-γ+；所述Th2细胞表型为CD3+CD4+IL-4+；所述Th17细胞表型为CD3+CD4+IL-17A+；所述Treg细胞表型为CD4+CD25+FoxP3+。
在本实施方式中，对所述第二共培养组和所述第二对照组培养24h-72h后，开始进行刺激；2)向第二阳性对照孔、共培养组培养孔内分别加入佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)与莫能霉素(Monensin)，使得PMA的终浓度为50ng/ml、Ionomycin终浓度为1μg/ml、Monensin终浓度为0.67μg/ml，轻晃混匀；3)培养刺激4-6h后收集淋巴细胞，离心力250g离心5min，弃上清，使用1xPBS洗涤2遍，使用1xPBS重悬细胞；4)向每支细胞内加入氨基反应性死活染料Fixable Viability Stain，进行细胞死活标记；5)标记完成后，洗涤未反应的染料后，对细胞进行固定、破膜；6)破膜完成后向细胞加入抗体CD3、CD4、IFN-γ、IL-4、IL-17A，对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞进行标记；7)标记完成后，洗涤多余未结合抗体，使用1xPBS重选细胞，使用流式细胞仪进行上机分析；8)与所述第二阳性对照组相比，所述第二共培养组IFN-γ表达量变化趋势，即Th1细胞比例变化趋势，表明共培养后淋巴细胞对表达Th1细胞的特征性标记IFN-γ的影响趋势，间充质干细胞对Th1细胞在淋巴细胞中的比例的影响方式。与所述第二阳性对照组相比，所述第二共培养组IL-4表达量的变化趋势，即Th2细胞比例变化趋势，表明共培养后淋巴细胞对表达Th2细胞的特征性标记IL-4的影响趋势，间充质干细胞对了Th2细胞在淋巴细胞中的影响方式。与所述第二阳性对照组相比，所述第二共培养组IL-17A表达量变化趋势，即Th17细胞比例的变化趋势，表明共培养后淋巴细胞对表达Th17细胞的特征性标记IL-17A的影响趋势，间充质干细胞对Th17细胞在淋巴细胞中的比例的影响方式。
下面，通过具体的实施方式对本申请的技术方案进行阐释：
实施例1：一种检测间充质干细胞免疫调控功能评测的淋巴细胞分离的方法
1)取10-20ml健康人抗凝全血，小心将血液加入预先装有等体积淋巴细胞分离液的50ml离心管内，离心力500-1100g，离心20-30min；2)离心后，此时离心管中由上至下分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；3)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一离心管中，向离心管内加入40ml生理盐水，混匀细胞，离心力250g，离心10min；4)弃上清，向离心管内加入40ml生理盐水，混匀细胞，离心力250g，离心10min；5)弃上清，使用淋巴细胞完全培养基3-5ml重悬细胞，得到淋巴细胞悬液；6)取部分细胞悬液进行血细胞计数，根据计数所得的淋巴细胞浓度调整细胞悬液体积用于后续实验。
实施例2：间充质干细胞接种与淋巴细胞共培养的方法
1)取新鲜收集的间充质干细胞，按照一定比例接种至12孔板内，加入间充质干细胞完全培养基至1ml/孔，每个孔板接种1-3孔，共接种2个12孔板；2)接种后置于37℃、5％CO2培养箱内培养一定时间至间充质干细胞完全贴壁，在细胞尚未开始增殖时开始接种淋巴细胞；3)取贴壁后的间充质干细胞1板，吸弃现有培养基，取实施例1中分离完成的淋巴细胞悬液，按照间充质干细胞数量与淋巴细胞数量以一定比例(比如1:5，1:10等)接种相应数量的淋巴细胞悬液至已接种间充质干细胞的培养内，作为共培养组，并另外接种淋巴细胞至空孔内，作为对照组，共接种2-6孔，分别作为阴性对照组与阳性对照组，并补充培养基至2-3ml/孔。该孔板用于间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞)比例影响实验；4)取实施例1中分离完成且未接种完的淋巴细胞悬液，调整细胞悬液浓度至5E6-5E7/ml，取5-10mM的CFSE染料，按照终浓度为5μM将CFSE加入细胞悬液中，37℃避光孵育10min标记细胞；5)孵育完成后加入5倍的淋巴细胞完全培养基，置于4℃冰箱避光孵育5min，然后清洗细胞两次，离心力250g，离心10min，使用淋巴细胞完全培养基重选细胞，并计数，根据计数结果调整细胞浓度；6)取贴壁后的间充质干细胞1板，吸弃现有培养基，取5)中染色完成的淋巴细胞，按照与3)中淋巴细胞接种数量于接种方案，将染色后的淋巴细胞接种至该孔板内，设置共培养组、阴性对照组与阳性对照组。然后向共培养组、阳性对照组孔内按照培养体系，加入终体积为4ug/ml的PHA液。该孔板用于间充质干细胞对淋巴细胞增殖抑制实验、对特定淋巴细胞亚群(Treg细胞)比例影响实验、对淋巴细胞TNF-α分泌抑制实验。
实施例3：间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞)比例影响实验
1)将实施例2中3)的培养孔板，培养48h-72h后，开始进行刺激；2)向阳性对照孔、共培养组培养孔内分别加入佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)与莫能霉素(Monensin)，使得PMA的终浓度为50ng/ml、Ionomycin终浓度为1μg/ml、Monensin终浓度为0.67μg/ml，轻晃混匀；3)培养刺激4-6h后收集淋巴细胞，离心力250g离心5min，弃上清，使用1xPBS洗涤2遍，使用1xPBS重悬细胞；
4)向每支细胞内加入氨基反应性死活染料Fixable Viability Stain，进行细胞死活标记；5)标记完成后，洗涤未反应的染料后，对细胞进行固定、破膜；6)破膜完成后向细胞加入抗体CD3、CD4、IFN-γ、IL-4、IL-17A，对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞进行标记；7)标记完成后，洗涤多余未结合抗体，使用1xPBS重选细胞，使用流式细胞仪进行上机分析；8)Th1细胞表达量如图例1A所示，与阳性对照组相比，共培养组IFN-γ表达量显著降低，即Th1细胞比例降低，表明共培养后淋巴细胞显著下调表达Th1细胞的特征性标记IFN-γ，间充质干细胞降低了Th1细胞在淋巴细胞中的比例；9)Th2细胞表达量如图例1B所示，与阳性对照组相比，共培养组IL-4表达量降低，即Th2细胞比例降低，表明共培养后淋巴细胞下调表达Th2细胞的特征性标记IL-4，间充质干细胞降低了Th2细胞在淋巴细胞中的比例；10)Th17细胞表达量如图例1C所示，与阳性对照组相比，共培养组IL-17A表达量降低，即Th17细胞比例降低，表明共培养后淋巴细胞下调表达Th17细胞的特征性标记IL-17A，间充质干细胞降低了Th17细胞在淋巴细胞中的比例。
实施例4：间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群(Treg细胞)比例影响实验与间充质干细胞对淋巴细胞增殖抑制实验
1)将实施例2中6)的培养孔板，培养72h-96h后，收集淋巴细胞；2)离心力250g离心5min，将培养上清收集至新管内，做好标记备用；对于细胞沉淀，使用1xPBS洗涤2遍，使用1xPBS重悬细胞；3)向每支细胞内加入氨基反应性死活染料Fixable Viability Stain，进行细胞死活标记；4)标记完成后，洗涤未反应的染料后，对细胞进行固定、破膜；5)破膜完成后向细胞加入抗体CD45、CD4、CD25、FoxP3，对Treg细胞进行标记；6)标记完成后，洗涤多余未结合抗体，使用1xPBS重选细胞，使用流式细胞仪进行上机分析；7)淋巴细胞增殖抑制如图例2A所示，与阳性对照组相比，共培养组淋巴细胞增值峰显著减少，高代次淋巴细胞比例显著降低，表明共培养后淋巴细胞增殖比例显著降低，间充质干细胞抑制了淋巴细胞的增殖；8)Treg细胞表达量如图例2B所示，与阳性对照组相比，共培养组CD25+FoxP3+表达量显著上升，即Treg细胞比例增高，表明共培养后淋巴细胞显著上调表达Treg细胞的特征性标记CD25+FoxP3+，间充质干细胞提高了Treg细胞在淋巴细胞中的比例。
实施例5：间充质干细胞对淋巴细胞TNF-α分泌抑制实验
1)使用实施例4中2)收集的培养上清，检测其中的TNF-α含量；2)使用人TNF-αELISA试剂盒中的样本稀释液，对培养上清进行一定倍数稀释；3)按照试剂盒说明检测培养上清中的TNF-αOD值；4)根据试剂盒标曲与相应的稀释倍数，计算TNF-α含量；5)TNF-α含量如图例3所示，与阳性对照组相比，共培养组TNF-α含量显著降低，表明共培养后淋巴细胞显著下调TNF-α分泌量，间充质干细胞抑制了淋巴细胞TNF-α分泌量。
综上所述，本申请公开了一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，所述方法包括：一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，所述间充质干细胞免疫调控功能参数包括淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF-α的变化量，其中，所述方法包括：按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞；利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组；根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果。有效解决了现有技术中间充质干细胞免疫调控功能检测过程繁琐的问题，有利于提高检测效率。也即本发明与传统方法相比，创造性的将间充质干细胞对淋巴细胞亚群增殖抑制检测、间充质干细胞对Treg细胞的影响、间充质干细胞对淋巴细胞TNF-α分泌抑制检测的培养过程和而为一，使用同一共培养样本检测，极大简化了检测过程的操作步骤，同时提高了检测的准确性，可高效地对间充质干细胞的生物有效性进行评价。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞免疫调控功能的检测方法，所述间充质干细胞免疫调控功能参数包括淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF-α的变化量，其特征在于，所述方法包括：
按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞；
利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组；
根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述按照需求培养和处理淋巴细胞及间充质干细胞包括：
制备淋巴细胞悬液，并检测所述淋巴细胞悬液的浓度；及
将间充质干细胞置于容器中，并将其培养至完全贴壁。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：
使用染色剂对所述淋巴细胞悬液进行染色处理，并检测染色处理后的所述淋巴细胞悬液的浓度。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括：
向所述淋巴细胞悬液中加入CFSE染色剂，使得所述染色剂的终浓度在第一染色剂浓度范围内；
对染色后的所述淋巴细胞悬液进行孵育及淋巴细胞完全培养基重选细胞操作，之后检测处理后的所述淋巴细胞悬液的浓度。
5.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述利用所述淋巴细胞及所述间充质干细胞制备共培养组及对照组的方法包括：
按照预设比例向容置有所述间充质干细胞的容器及空置容器中加入已知浓度的所述淋巴细胞悬液，得到所述共培养组和所述对照组；
当加入的所述淋巴细胞悬液为染色后的所述细胞悬液时，得到第一共培养组和第一对照组；
当加入的所述淋巴细胞悬液为未染色的所述细胞悬液时，得到第二共培养组和第二对照组。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果的方法包括：
从所述第一共培养组和所述第一对照组中收集培养后的淋巴细胞，并分离得到细胞沉淀和/或上清液；
对所述细胞沉淀和/或所述上清液进行检测，得到淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞亚群的比例变化量和/或淋巴细胞分泌TNF-α的变化量。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括：
采用酶联免疫法对所述上清液中进行TNF-α浓度进行检测，得到淋巴细胞分泌TNF-α的变化量。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括：
对所述细胞沉淀进行死活标记及Treg细胞特异性抗体标记；
对标记后的所述细胞沉淀进行检测，得到淋巴细胞增殖的变化量、特定淋巴细胞Treg细胞亚群的比例变化量。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述根据待检测项目的要求对所述共培养组及对照组进行检测处理，一次性输出间充质干细胞免疫评价功能参数中的至少两种的检测结果的方法包括：
对培养后的所述第二共培养组和所述第二对照组加入刺激剂，并使得所述刺激剂的浓度达到预设的刺激剂浓度范围；
收集刺激处理后的淋巴细胞，并进行死活标记及Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞中至少一种的特异性标记；
对所述特异性标记后的淋巴细胞进行检测，确定特定淋巴细胞Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞亚群中至少一种的比例变化量。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
所述刺激剂包括佛波酯、离子霉素或莫能霉素中的至少一种；
所述所述佛波酯的添加终浓度为5-250ng/ml、所述离子霉素添加终浓度为0.1-5μg/ml、所述莫能霉素添加终浓度为0.5-5μg/ml。
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