CN110699319A - 检测脐带间充质干细胞影响t淋巴细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，涉及干细胞与再生医学领域。本发明的检测方法，包括分组培养、刺激T淋巴细胞、检测等步骤，根据共培养组和对照组的检测结果判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。本发明的方法能够更精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。

Description

检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及干细胞与再生医学领域，特别是涉及一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法。
背景技术
脐带间充质干细胞是一种多功能干细胞，免疫调节是评价脐带间充质干细胞功能的重要指标之一。T淋巴细胞是机体免疫系统的重要组成，T淋巴细胞在经抗原刺激等条件激活后，可分化为多种细胞亚群，探究脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响，有助于更好的理解间充质干细胞对机体免疫系统的调节作用，为未来干细胞临床应用提供更加全面的临床前研究证据。现有检测脐带间充质干细胞对淋巴细胞分化的方法不够全面，因而得到的结论也有待商榷。
发明内容
基于此，有必要针对现有的检测方法不够全面的问题，提供一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，能够更加精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。
一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，包括以下步骤：
分组培养：将获取的T淋巴细胞液分为共培养组和对照组，向共培养组中加入CD3抗体、CD28抗体和脐带间充质干细胞，向对照组中加入与共培养组等量的CD3抗体和CD28抗体，将共培养组和对照组放置于相同的条件下培养2～7天；
刺激T淋巴细胞：向共培养的细胞液中加入Cocktail，反应2～4h，收集悬浮细胞；
检测：检测所述悬浮细胞中细胞活化标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B的表达丰度；根据共培养组和对照组中细胞活化标记的表达丰度判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。
上述检测方法，将T淋巴细胞和脐带间充质干细胞进行共培养，加入CD3抗体和CD28是为了体外模拟T细胞在体内接受抗原提呈细胞刺激的过程，检测前加入Cocktail可以激活T淋巴细胞，促进T淋巴细胞合成细胞因子，同时抑制高尔基体转运分泌蛋白到细胞外，以便采用流式检测细胞因子的表达情况；检测时采用多种细胞标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B等表征相应T淋巴细胞亚群变化，其中CD4+Foxp3+为Treg细胞，CD4+IFN-r+为Th1细胞，CD4+IL-4+为Th2细胞，CD4+IL-17+为Th17细胞，CD4+IL21+为Th21细胞，CD8+颗粒酶B+为杀伤性T细胞，将共培养组和对照组对比，能够精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。
在其中一个实施例中，所述共培养步骤中，所述T淋巴细胞的获取方法包括以下步骤：
稀释：将血液与生理盐水混合得到稀释血液；
离心：将稀释血液加至淋巴细胞分离液中，离心；
分离：离心后，去除上层液体，保留沉淀，加入PBS重悬，离心，舍弃上层液体，保留沉淀，加入1640培养基和5～20％的血清重悬，得到T淋巴细胞液。
在其中一个实施例中，所述稀释步骤中，所述血液与所述生理盐水的体积比为1:(2～3)。优选地，血液与生理盐水的体积比为1:2.5。
在其中一个实施例中，所述离心步骤中，所述淋巴细胞分离液与血液的体积比为(1～2)：1。优选地，淋巴细胞分离液液与血液的体积比为1.5:1。
在其中一个实施例中，所述离心步骤中，离心温度为18～22℃，离心时间为18～22min，升速为7，降速为0。血液刚加在淋巴液上层，升速应略缓慢；离心结束后，淋巴细胞层已经分离出来，此时降速应最小，防止扰动。
在其中一个实施例中，所述分离步骤中，离心温度为4±1℃，离心时间为7～9min，升速为9，降速为9。淋巴细胞已经分离出来，为尽可能地缩短分离时间，将升降速调到最大。
在其中一个实施例中，所述分组培养步骤中共培养组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×106个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mL CD28抗体，再加入脐带间充质干细胞液，所述T淋巴细胞与所述脐带间充质干细胞的数量比为(48～52)：1，进行共培养；
所述分组培养步骤中对照组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×106个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mL CD28抗体，进行培养。
在其中一个实施例中，所述刺激T淋巴细胞步骤中，所述Cocktail包括佛波酯、离子霉素和布雷非德菌素A。
在其中一个实施例中，所述佛波酯终浓度为19～21ng/mL，离子霉素浓度为0.8～1.2μg/mL，布雷非德菌素A浓度为14～16μg/mL。优选地，佛波酯终浓度为20ng/mL，离子霉素浓度为1μg/mL，布雷非德菌素A浓度为15μg/mL。
在其中一个实施例中，所述Cocktail的添加量为3～5μg/孔。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的检测方法，将T淋巴细胞和脐带间充质干细胞进行共培养，加入CD3抗体和CD28是为了体外模拟T细胞在体内接受抗原提呈细胞刺激的过程，检测前加入Cocktail可以激活T淋巴细胞，促进T细胞合成细胞因子，同时抑制高尔基体转运分泌蛋白到细胞外，以便采用流式检测细胞因子的表达情况；检测时采用多种细胞标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B等表征相应T淋巴细胞亚群变化，其中CD4+Foxp3+为Treg细胞，CD4+IFN-r+为Th1细胞，CD4+IL-4+为Th2细胞，CD4+IL-17+为Th17细胞，CD4+IL21+为Th21细胞，CD8+颗粒酶B+为杀伤性T细胞，将共培养组和对照组对比，能够精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。
附图说明
图1为实施例Foxp3的表达情况图；
图2为实施例IL-17的表达情况图；
图3为实施例IL-21的表达情况图；
图4为实施例IFN-γ的表达情况图；
图5为实施例IL-4的表达情况图；
图6为实施例颗粒酶B的；
图7为实施例和对比例的IL-21和颗粒酶B表达情况图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，包括以下步骤：
1)向10mL健康人捐赠的血液中加入25mL生理盐水，混合均匀，得到稀释血液，向50mL离心管中缓慢加入15mL淋巴细胞分离液，倒入时离心管壁上不要有残留，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上，人为操作时受力不均匀，会导致淋巴细胞分离液无法从血液中分离细胞，因此添加稀释血液时应小心防止两相混合；
2)将离心管放于离心机中，温度设置为20℃，离心20min，升速为7，降速为0；此时，血液刚加在淋巴细胞分离液上层，升速应略缓慢；离心结束后，T淋巴细胞层已经分离出来，此时降速应最小，防止扰动；
3)用移液管去掉上层液体，保留沉淀，向沉淀中加入PBS至50mL，重悬，在4℃下离心8min，升速为9，降速为9，此时，T淋巴细胞已经分离出来，为尽可能地缩短分离时间，将升降速调到最大；离心后舍弃上层液体，保留沉淀，拍散细胞，加入1640培养基，同时加入10％的血清，细胞浓度为5×106个/mL；
4)将3)中得到的细胞液铺板于96孔板内，每孔体积200μL，将以上孔板平均分为两组，分别为共培养组和对照组；在共培养组的每孔加入浓度为3μg/mL的CD3抗体、3μg/mL的CD28抗体和脐带间充质干细胞，T淋巴细胞与脐带间充质干细胞的数量比为50：1，共培养3天；在对照组的每孔加入浓度为3μg/mL的CD3抗体和3μg/m L的CD28抗体，培养3天；
5)分组培养完成后，共培养组和对照组的每孔均加入3.204μg的Cocktail，佛波酯终浓度为20ng/ml，离子霉素浓度为1μg/ml，布雷非德菌素A浓度为15μg/ml，刺激T淋巴细胞4h后，收集孔中悬浮的细胞；Cocktail可以激活T细胞，同时抑制高尔基体转运分泌蛋白到细胞外；
6)使用流式细胞仪检测T淋巴细胞CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B的表达丰度。对共培养组和对照组中细胞活化标记的表达丰度进行对比，判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。
Foxp3的表达情况如图1所示，与对照组相比，共培养组表达的Foxp3显著增加，表明共培养后T淋巴细胞显著上调表达Treg细胞特征性标记Foxp3，脐带间充质干细胞促进了T淋巴细胞向Treg细胞分化。
IL-17的表达情况如图2所示，与对照组相比，共培养组表达的IL-17显著增加，表明共培养后T淋巴细胞显著上调表达Th17细胞特征性标记IL-17，脐带间充质干细胞促进了T淋巴细胞向Th17细胞分化。
IL-21的表达情况如图3所示，与对照组相比，共培养组表达的IL-21显著增加，表明共培养后T淋巴细胞显著上调表达Tfh细胞因子IL-21，脐带间充质干细胞促进了T淋巴细胞向Tfh细胞的分化。
IFN-γ的表达情况如图4所示，与对照组相比，共培养组表达的IFN-γ显著减少，表明共培养后T淋巴细胞下调表达Th1细胞特征性细胞因子IFN-γ，脐带间充质干细胞抑制了T细胞向Th1细胞的分化。
IL-4的表达情况如图5所示，与对照组相比，共培养组表达的IL-4显著减少，表明共培养后T淋巴细胞下调表达Th2细胞特征性细胞因子IL-4，，表明脐带间充质干细胞抑制了T细胞向Th2的分化。
颗粒酶B的表达情况如图6所示，与对照组相比，共培养组表达的颗粒酶B显著减少，共培养后T淋巴细胞下调表达细胞毒性T细胞标记颗粒酶B，表明脐带间充质干细胞抑制了T细胞向细胞毒性T细胞(CTL)的分化。
以上结果显示，脐带间充质干细胞能明显促进T淋巴细胞分化为调节性T细胞(Treg)、Th17和Tfh细胞，抑制T细胞分化为Th1细胞、Th2细胞和细胞毒性T细胞(CTL)。
对照例1
一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，与实施例1的区别在于，共培养组和对照组的步骤5)中Cocktail的用量为0.3204μg，其中佛波酯终浓度为2ng/ml、离子霉素浓度为0.1μg/ml、布雷非德菌素A浓度为1.5μg/ml
实施例1与对比例1的方法，细胞分泌IL-21与颗粒酶-B的情况如图7所示。其中，A为采用实施例1的方法细胞分泌IL-21的情况，B为采用对比例1的方法细胞分泌IL-21的情况，C为采用实施例1的方法细胞分泌颗粒酶-B的情况，D为采用对比例1的方法细胞分泌颗粒酶-B的情况。
经过对比可以发现，采用实施例1的方法，IL-21和颗粒酶B的检出比例较高；采用对比例1的方法，IL-21和颗粒酶B的检出比例较低，原因是低浓度的Cocktail不能完全抑制高尔基体对分泌蛋白的转运，T淋巴细胞合成的细胞因子部分被分泌到细胞外，导致检出效率较低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分组培养：将获取的T淋巴细胞液分为共培养组和对照组，向共培养组中加入CD3抗体、CD28抗体和脐带间充质干细胞，向对照组中加入与共培养组等量的CD3抗体和CD28抗体，将共培养组和对照组放置于相同条件下培养2～7天；
刺激T淋巴细胞：向共培养的细胞液中加入Cocktail，反应2～4h，收集悬浮细胞；
检测：检测所述悬浮细胞中细胞活化标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B的表达丰度；根据共培养组和对照组中细胞活化标记的表达丰度判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养步骤中，所述T淋巴细胞的获取方法包括以下步骤：
稀释：将血液与生理盐水混合得到稀释血液；
离心：将稀释血液加至淋巴细胞分离液中，离心；
分离：离心后，去除上层液体，保留沉淀，加入PBS重悬，离心，舍弃上层液体，保留沉淀，加入1640培养基和5～20％的血清重悬，得到T淋巴细胞液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述稀释步骤中，所述血液与所述生理盐水的体积比为1:(2～3)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心步骤中，所述淋巴细胞分离液与血液的体积比为(1～2)：1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心步骤中，离心温度为18～22℃，离心时间为18～22min，升速为7，降速为0。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离步骤中，离心温度为4±1℃，离心时间为7～9min，升速为9，降速为9。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分组培养步骤中共培养组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×106个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mL CD28抗体，再加入脐带间充质干细胞液，所述T淋巴细胞与所述脐带间充质干细胞的数量比为(48～52)：1，进行共培养；
所述分组培养步骤中对照组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×106个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mL CD28抗体，进行培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺激T淋巴细胞步骤中，所述Cocktail包括佛波酯、离子霉素和布雷非德菌素A。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述佛波酯终浓度为19～21ng/mL，离子霉素浓度为0.8～1.2μg/mL，布雷非德菌素A浓度为14～16μg/mL。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述Cocktail的添加量为3～5μg/孔。
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