CN116814545A - 人脐带间充质干细胞体外抑制IFN-γ分泌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种人脐带间充质干细胞体外抑制IFN‑γ分泌的方法。所述方法涉及一种组合物，所述组合物包括：第一激活剂和第二激活剂；所述第一激活剂包括植物血球凝集素P；所述第二激活剂包括佛波酯和离子霉素。根据本发明实施例所述双激活剂与保护剂联用可有效激活T淋巴细胞，并降低实验过程中细胞死亡率，保证细胞高活性和高增殖率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及人脐带间充质干细胞体外抑制IFN-γ分泌的方法，更具体地，本发明涉及组合物、药物联合及其用途、激活T淋巴细胞的方法、试剂盒。
背景技术
间充质干细胞由于其易于分离扩增和多能性，以及其低免疫原性和免疫调节能力意味着它们可以移植到自体和同种异体系统中。间充质干细胞的抗凋亡、旁分泌，组织修复和多向分化能力推动了它们目前对治疗最常见疾病的转化研究和临床试验的评估，包括涉及神经系统疾病，心血管疾病、代谢消化病，软组织病等。
目前可以将人间充质干细胞(MSC)和外周血单个核细胞(PBMC)体外进行共培养抑制细胞因子IFN-γ分泌，通过流式细胞术检测Th1细胞分泌因子IFN-γ的表达水平去评估间充质干细胞对Th1细胞的调节功能。PBMC中T淋巴细胞主要由第一信号T细胞受体TCR-CD3复合体、第二信号共刺激因子和第三信号特定的细胞因子三个信号激活。但体内活化的T淋巴细胞在体外环境静息状态下缺少刺激因素，细胞因子产生的含量很低，一般很难检测到。目前已报道可通过体外诱导刺激T细胞活化产生更多的细胞因子，如加入刺激剂如抗CD3和抗CD28抗体、植物血球凝集素P(PHA-P)或佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)等多克隆刺激剂模拟体内刺激因素，使其继续合成和分泌相关细胞因子。但该方法的缺点是由于激活剂的加入，随着刺激时间的延长，细胞会出现死亡现象，导致对本身分泌量就较少的INF-γ的检测效果低，且结果的重复性较差。另外，通过先加入抗CD3抗体去刺激T细胞，构成活化第一信号，再加入抗CD28抗体协同刺激构成第二信号活化T细胞，则实验中需要抗CD3抗体和抗CD28抗体等功能学抗体或磁珠法中的CD3/CD28抗体偶联磁珠，由于两种抗体和磁珠价格较贵，导致实验成本偏高。
因此，亟需开发一种能够高效刺激淋巴细胞转化、提高IFN-γ的检出率、防止细胞大量死亡并能够节约成本的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：第一激活剂和第二激活剂。所述第一激活剂包括植物血球凝集素P(PHA-P)；所述第二激活剂包括佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)。发明人发现，对于单独用PHA-P刺激剂去刺激T细胞活化，是作用于TCR-CD3复合体，只适用于检测T细胞增殖，且在培养72h后容易引发细胞死亡。所以对于Th1细胞特定分泌细胞因子IFN-γ的检测用PMA、离子霉素(Ionomycin)刺激，既可以避免培养中细胞的死亡，还能够提高T淋巴细胞的激活作用。此外，PHA-P作为第一激活剂活化初始淋巴细胞，其价格较低，刺激温和且效果较强。因此，发明人选择PHA-P作为第一激活剂活化初始淋巴细胞。
根据本发明的实施例，上述组合物还可以进一步包括如下技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述组合物中第一激活剂与所述第二激活剂的质量比为9.5:1。发明人发现，第一激活剂与第二激活剂的摩尔比或质量比在上述条件下，对T淋巴细胞的激活效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为0.05:1。
根据本发明的实施例，所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为10:0.05:1。发明人发现，所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的摩尔比或质量比在上述条件下，对T淋巴细胞的激活效率进一步提高。
需要说明的是，在本申请中，还可以根据需要在所述组合物中加入布雷非德菌素A(Brefeldin A，BFA)可以防止分泌因子分泌到细胞外。
根据本发明的实施例，所述组合物进一步包括保护剂。其中，所述保护剂的成分选自多聚糖聚乙烯吡咯烷酮(PVC)、聚乙二醇、海藻糖、β巯基乙醇以及人血清白蛋白中的一种或多种组合。β巯基乙醇作为一种还原剂，可以中和掉细胞生长过程中向培养基中释放积累的氧自由基，减少对细胞的伤害以及在高密度生长环境中的死亡率。海藻糖主要是通过α-1,1-糖苷键连接的葡萄糖二聚体，其缩醛键防止每个单体中C-1的还原，进而增加了本身的稳定性，并降低了其在低pH条件下对酸水解的敏感性。其多聚糖的性质还能抑制细胞外盐浓度的增加，稳定细胞膜。此外，保护剂中的人血清白蛋白可用于调节细胞渗透压并给予细胞营养。发明人发现，添加上述保护剂可以使细胞维持较好的生长状态，减少细胞死亡，保证细胞高活性和较高的增殖率。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，所述药物联合包括：第一激活剂和第二激活剂。所述第一激活剂包括植物血球凝集素P；所述第二激活剂包括佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)。发明人发现，包括植物血球凝集素P的第一激活剂和包括佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)的第二激活剂联用，对T淋巴细胞的激活作用显著增强。
根据本发明的实施例，上述药物联合还可以进一步包括如下技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物联合中第一激活剂与所述第二激活剂的质量比为9.5:1。发明人发现，第一激活剂与第二激活剂的摩尔比或质量比在上述条件下，对T淋巴细胞的激活效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为0.05:1。
根据本发明的实施例，所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为10:0.05:1。发明人发现，所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的摩尔比或质量比在上述条件下，对T淋巴细胞的激活效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述药物联合进一步包括保护剂。其中，所述保护剂的成分选自多聚糖聚乙烯吡咯烷酮(PVC)、聚乙二醇、海藻糖、β巯基乙醇以及人血清白蛋白中的一种或多种组合。发明人发现，添加上述保护剂可以使细胞维持较好的生长状态，减少细胞死亡，保证细胞高活性和较高的增殖率。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种激活T淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将T淋巴细胞在本发明第一方面所述组合物或本发明第二方面药物联合存在的条件下进行培养处理。根据本发明的实施例，通过使用本发明提出的组合物或药物联合物进行培养，可以增强激活T淋巴细胞的效果，并提供一种规范化、高效和稳定的方法。有望在免疫学研究和临床实践中产生广泛的应用。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述培养处理是通过如下方式进行的：将T淋巴细胞在第一激活剂存在的条件下进行第一培养处理70～74小时；和将第一培养处理产物在第二激活剂存在的条件下进行第二培养处理。发明人发现，第一培养处理时间低于70小时，会导致细胞激活不充分，第一培养处理时间长于74小时，会导致细胞大量死亡。第一培养处理时间在70～74小时内，可进一步提高T淋巴细胞的激活效果，且保持T淋巴细胞的活力。
根据本发明的实施例，所述第一培养处理时间为72小时。
根据本发明的实施例，所述第一激活剂在第一培养体系中的浓度为8～12μg/ml。发明人发现，浓度太低，细胞激活效果差，浓度太高细胞容易死亡。
根据本发明的实施例，所述第一激活剂在所述第一培养处理体系中的浓度为10μg/ml。
根据本发明的实施例，佛波酯在第二培养处理体系中的浓度为50ng/ml；离子霉素在所述第二培养处理体系中浓度为1μg/ml。发明人发现，该浓度下，激活剂对细胞的激活能力最适，也可减少细胞死亡。
根据本发明的实施例，所述第一培养处理中，进一步包括在保护剂存在的条件下进行所述第一培养处理。发明人发现，保护剂的添加能抑制细胞外盐浓度的增加，稳定细胞膜，减少激活剂及BFA中成分对细胞带来的伤害，加强对细胞的保护作用，减少细胞死亡。还可以调节细胞渗透压并给予细胞营养，使细胞维持较好的生长状态，使细胞维持高活性，从而保证细胞较高的增殖效率，提高了实验准确性与稳定性。
根据本发明的实施例，所述第二培养处理中，进一步包括在保护剂存在的条件下进行所述第二培养处理。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种本发明第一方面所述的组合物或本发明第二方面所述的药物联合在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于激活T淋巴细胞。根据本发明的实施例，利用所述试剂盒激活T淋巴细胞简易、方便、快速。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的组合物或本发明第二方面所述的药物联合。根据本发明的实施例，通过采用本发明所提供的试剂盒用于T淋巴细胞的激活，可以方便简单、高效、稳定地得到激活效果的结果。这可以提供一种易于操作的方法，为广泛的神经系统疾病，心血管疾病、代谢消化病，软组织病等的研究提供了一个新的工具。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例4中间充质干细胞对Th1细胞抑制作用在实施例1与3个对比例中的结果统计图(p<0.05被认为有统计学意义，**p<0.01)；
图2为本发明实施例4中实施例1中流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果；其中，右下象限中的数字代表Th1淋巴细胞在CD3+T淋巴细胞中的比例，Th1细胞亚群表达为CD3+CD8-IFNγ+，E为实验组(MSC和PBMC共培养+激活剂+保护剂)，P为阳性对照组(PBMC+激活剂+保护剂)，N为阴性对照组N(PBMC单独培养+保护剂)；
图3为本发明实施例4中对比例1中流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果；其中，右下象限中的数字代表Th1淋巴细胞在CD3+T淋巴细胞中的比例，Th1细胞亚群表达为CD3+CD8-IFNγ+，E为实验组(MSC和PBMC共培养+激活剂)，P为阳性对照组(PBMC+激活剂)，N为阴性对照组N(PBMC单独培养)；
图4为本发明实施例4中对比例2中流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果；其中，右下象限中的数字代表Th1淋巴细胞在CD3+T淋巴细胞中的比例，Th1细胞亚群表达为CD3+CD8-IFNγ+，E为实验组(MSC和PBMC共培养+激活剂)，P为阳性对照组(PBMC+激活剂)，N为阴性对照组N(PBMC单独培养)；
图5为本发明实施例4中对比例3中流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果；其中，右下象限中的数字代表Th1淋巴细胞在CD3+T淋巴细胞中的比例，Th1细胞亚群表达为CD3+CD8-IFNγ+，E为实验组(MSC和PBMC共培养+激活剂)，P为阳性对照组(PBMC+激活剂)，N为阴性对照组N(PBMC单独培养)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
定义和说明
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
组合物
在本发明的一方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：第一激活剂和第二激活剂。所述第一激活剂包括植物血球凝集素P(PHA-P)；所述第二激活剂包括佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)。发明人的实验研究证实，将第一激活剂和第二激活剂一起使用，可以显著提高T淋巴细胞的激活效果。
需要说明的是，植物血球凝集素P(PHA-P)作为一种从植物种子中提取的蛋白质，可以刺激T淋巴细胞的增殖和分化。佛波酯可以刺激T淋巴细胞的分化，而离子霉素可以增强T淋巴细胞的细胞因子产生和功能。在本申请的一个优选实施例中，选择所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为10:0.05:1。
根据本发明的实施例，组合物进一步包括保护剂。其中，所述保护剂的成分选自多聚糖聚乙烯吡咯烷酮(PVC)、聚乙二醇、海藻糖、β巯基乙醇以及人血清白蛋白中的一种或多种组合。添加所述保护剂具有以下优势：
1)增强稳定性：保护剂可以稳定组合物，从而防止其变性或降解。这有助于维护组合物的生物活性和有效性。
2)改善溶解度：某些组合物可能在水中难以溶解或不稳定，但通过添加适当的保护剂，可以提高它们的水溶性和稳定性。
3)减少毒性：一些药物可能具有一定的毒性，但通过添加保护剂，可以减少其毒性。例如，人血清白蛋白可以通过减少药物在体内的毒性而保护身体免受伤害。
4)提高生物利用度：保护剂可以延长组合物在体内的时间，从而增加生物利用度。这有助于提高药物的疗效并降低剂量，减少副作用。
药物联合
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，所述药物联合包括：第一激活剂和第二激活剂。所述第一激活剂包括植物血球凝集素P(PHA-P)；所述第二激活剂包括佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)。
需要说明的是，发明人在使用PHA-P对T淋巴细胞进行刺激后，T淋巴细胞分泌的IFN-γ含量很少，为了提高IFN-γ的分泌以便于后续实验需要，再次加入第二刺激因子佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)继续刺激细胞促进T淋巴细胞分化。
在本申请的一个优选实施例中，选择所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为10:0.05:1。发明人发现，所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的摩尔比或质量比在上述条件下，对T淋巴细胞的激活效率最佳。
根据本发明的实施例，所述药物联合进一步包括保护剂。其中，所述保护剂的成分选自多聚糖聚乙烯吡咯烷酮(PVC)、聚乙二醇、海藻糖、β巯基乙醇以及人血清白蛋白中的一种或多种组合。发明人发现，添加上述保护剂有助于提高药物联合物的稳定性、水溶性和生物利用度，降低其毒性，从而有望增强该药物联合物的治疗效果并减少其副作用。
激活T淋巴细胞的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种激活T淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将T淋巴细胞在前述组合物或药物联合存在的条件下进行培养处理。
需要说明的是，本申请所述激活T淋巴细胞的方法具有以下优势：
1)规范化：通过使用特定的组合物或药物联合物，以激活T淋巴细胞。可以确保每次实验中得到相同的结果，从而提供更准确和可重复的数据。
2)高效：所述组合物或药物联合物提供的刺激可以促进T淋巴细胞的高效激活。这样可以节省时间，并且使实验的结果更加准确、快速。
3)稳定性：该组合物或药物联合物可以增强T淋巴细胞激活效果，并且可以使细胞在培养过程中保持其活性和稳定性。这有助于提高该方法的可靠性和稳定性。
组合物与药物联合在制备试剂盒中的用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种上述组合物与药物联合在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于激活T淋巴细胞。根据本发明的实施例，利用所述试剂盒激活T淋巴细胞简易、方便、快速。
试剂盒
在本发明的再一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含上述组合物或药物联合。
根据本发明的实施例，所述试剂盒具有以下优势：
1)简便易行：试剂盒中的组合物或药物联合物可以直接用于T淋巴细胞的激活，省去了制备和调配试剂的过程。令试验过程更加简便和易行，尤其是在需要完成高通量分析的情况下。
2)规范化：使用该试剂盒可以为不同用户提供相同且规范化的条件，以保证结果之间的可重复性和可比性。这有助于提高研究人员之间的数据共享和交流，也有助于确保结果的准确性和可靠性。
3)稳定性：试剂盒中的组合物或药物联合物可以保持相对稳定的质量，从而产生更加稳定和可再现的结果。这可以提高数据的一致性，并将潜在的变异降至最低。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
1、实验仪器与试剂
保护剂制备：2ml 1640完全培养基中包含1.5mg/mL的聚乙二醇(PEG)，10mg/ml的海藻糖，2μl的55mM的β-巯基乙醇。
2、间充质干细胞(MSC)去增殖预处理
在一个汇合度达80％左右MSC细胞的T75培养瓶中，加入400ul浓度为1μg/μl的丝裂霉素C预处理2h。
3、间充质干细胞接种六孔板
将丝裂霉素C处理过的间充质干细胞弃去上清液，并用PBS缓冲液洗涤两次，弃上清液。加2ml胰酶消化1min，加5ml人脐带间充质干细胞完全培养基终止，过100μm细胞筛后500×g离心5min，弃上清，加入新鲜人脐带间充质干细胞完全培养基重悬细胞，吸取10μl细胞悬液和台盼蓝混合均匀计数。根据计数结果按照每孔4×105个细胞的数量接种到6孔板种，每孔加入2ml培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
4、PBMC复苏与培养
液氮中取出冻存的PBMC，快速放入37℃水浴锅中轻轻晃动冻存管60-90秒，直至细胞融化。将其转移至包含10ml培养基的15ml离心管中，再加1ml 1640完全培养基冲洗冻存管，吹打均匀，500×g离心5min。弃上清，加1ml培养基重悬细胞，将其转移至装有20ml 1640完全培养基的T175中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
5、MSC与PBMC共培养
设置阳性对照组P(PBMC+激活剂)、阴性对照组N(PBMC单独培养)以及实验组E(MSC和PBMC共培养+激活剂)。在步骤4中的培养24h后的PBMC转移至50ml离心管中，再加20ml生理盐水吹打均匀，吸取10μl细胞悬液和丫啶橙一碘化丙啶(AOPI)混合均匀进行计数，按照计数结果将MSC与PBMC的比例1:5的比例进行接种，即每个六孔板种2×106个PBMC细胞。
6、第一激活剂活化初始T淋巴细胞
在三个组别中每孔加入2ml配制好的保护剂，分别在阳性对照组P和实验组中E中加入终浓度为10μg/ml的PHA-P。于37℃，5％ CO2的培养箱中培养72h。
7、第二激活剂激活T淋巴细胞
分别在阳性对照组P和实验组中E的孔中加入PMA使其终浓度为50ng/ml和终浓度为1μg/ml的离子霉素(Ionomycin)，分别在三个组别(E、P、N)的孔中各加2μl布雷非德菌素A(Brefeldin A，BFA)，吹打均匀后继续培养6h。
8、培养终止
吸取步骤7中培养6h后培养板中每孔上清液至15ml离心管中，分别标为E、P、N，500×g离心5min，弃上清。加入有3％血清的PBS缓冲液(染色缓冲液)清洗1-2次。再向离心管中分别加入100μl染色缓冲液重悬细胞，分别加入5-10μl Fc-block(受体封闭剂)，常温避光孵育10-15min。
9、抗体表面染色
向步骤8Fc-block封闭后的细胞中各加入100μl染色缓冲液，重悬细胞使其均匀分布。按照不同组别转移至流式管中，分为实验组E，实验组同型对照组(E-ISO)，阳性对照组P，阳性同型对照组(P-ISO)和阴性对照组N，阴性同型对照组(N-ISO)。每个管中加入100μl细胞悬液。对应Th1细胞亚群的表面抗原加入适量抗体，分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl CD3-FITC和5μl CD8-APC。于4℃，避光孵育30min。
10、终止染色
向步骤9中各组流式管中加入1mL染色缓冲液终止抗体结合染色。于1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入染色缓冲液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
11、固定破膜
弃去步骤10中缓冲液。向各组中加入250μl固定破膜液，混合静置，避光，4℃，20min。加入1ml1×含破膜剂的破膜洗涤液洗涤，保持细胞渗透性，有利于抗体进入细胞。然后500×g，离心5min，弃上清。再加入1ml破膜洗涤液，常温放置15min，500×g离心5min。
12、抗体胞内染色
将步骤11上清液弃去，每管各加50μl破膜洗涤液，重悬细胞。分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl IFNγ-PE，在E-ISO、P-ISO和N-ISO组的细胞悬液中加入20μl PEIsotype Control，于4℃，避光孵育30min。
13、终止染色
向步骤9中各组流式管中加入1ml破膜洗涤液终止抗体结合染色。1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入1mL破膜洗涤液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
14、上机检测
弃去上清加入200μl染色缓冲液重悬细胞沉淀，上机检测。
对比例1
1、本申请对比例1所用仪器与试剂同实施例1。
2、间充质干细胞(MSC)去增殖预处理
在一个汇合度达80％左右MSC细胞的T75培养瓶中，加入400μl浓度为1μg/μl的丝裂霉素C预处理2h。
3、间充质干细胞接种六孔板
将丝裂霉素C处理过的间充质干细胞弃去上清液，并用PBS缓冲液洗涤两次，弃上清液。加2ml胰酶消化1min，加5ml培养基终止，过100μm细胞筛后500×g离心5min，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，吸取10μl细胞悬液和台盼蓝混合均匀计数。根据计数结果按照每孔4×105个细胞的数量接种到6孔板种，每孔加入2ml培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
4、PBMC复苏与培养
液氮中取出冻存的PBMC，快速放入37℃水浴锅中轻轻晃动冻存管60-90秒，直至细胞融化。将其转移至包含10ml培养基的15ml离心管中，再加1ml培养基冲洗冻存管，吹打均匀，500×g离心5min。弃上清，加1ml培养基重悬细胞，将其转移至装有20ml培养基的T175中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
5、MSC与PBMC共培养
设置阳性对照组P(PBMC+激活剂)、阴性对照组N(PBMC单独培养)以及实验组E(MSC和PBMC共培养+激活剂)。在步骤4中的培养24h后的PBMC转移至50ml离心管中，再加20ml生理盐水吹打均匀，吸取10μl细胞悬液和丫啶橙一碘化丙啶(AOPI)混合均匀进行计数，按照计数结果将MSC与PBMC的比例1:5的比例进行接种，即每个六孔板种2×106个PBMC细胞。
6、第一激活剂活化初始T淋巴细胞
分别在阳性对照组P和实验组中E中加入终浓度为10μg/ml的PHA-P。于37℃，5％CO2的培养箱中培养72h。
7、第二激活剂激活T淋巴细胞
分别在阳性对照组P和实验组中E的孔中加入PMA使其终浓度为50ng/ml和终浓度为1μg/ml的Ionomycin，分别在三个组别(E、P、N)的孔中各加2μl布雷非德菌素A(BrefeldinA，BFA)，吹打均匀后继续培养6h。
8、培养终止
吸取步骤7中培养6h后培养板中每孔上清液至15ml离心管中，分别标为E、P、N，500×g离心5min，弃上清。加入有3％血清的PBS缓冲液(染色缓冲液)清洗1-2次。再向离心管中分别加入100μl染色缓冲液重悬细胞，分别加入5-10μl Fc-block(受体封闭剂)，常温避光孵育10-15min。
9、抗体表面染色
向步骤8Fc-block封闭后的细胞中各加入100μl染色缓冲液，重悬细胞使其均匀分布。按照不同组别转移至流式管中，分为实验组E，实验组同型对照组(E-ISO)，阳性对照组P，阳性同型对照组(P-ISO)和阴性对照组N，阴性同型对照组(N-ISO)。每个管中加入100μl细胞悬液。对应Th1细胞亚群的表面抗原加入适量抗体，分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl CD3-FITC和5μl CD8-APC。于4℃，避光孵育30min。
10、终止染色
向步骤9中各组流式管中加入1mL染色缓冲液终止抗体结合染色。于1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入染色缓冲液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
11、固定破膜
弃去步骤10中缓冲液。向各组中加入250μl固定破膜液，混合静置，避光，4℃，20min。加入1ml1×含破膜剂的破膜洗涤液洗涤，保持细胞渗透性，有利于抗体进入细胞。然后500×g，离心5min，弃上清。再加入1ml破膜洗涤液，常温放置15min，500×g离心5min。
12、抗体胞内染色
将步骤11上清液弃去，每管各加50μl破膜洗涤液，重悬细胞。分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl IFNγ-PE，在E-ISO、P-ISO和N-ISO组的细胞悬液中加入20μl PEIsotype Control，于4℃，避光孵育30min。
13、终止染色
向步骤9中各组流式管中加入1ml破膜洗涤液终止抗体结合染色。1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入1mL破膜洗涤液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
14、上机检测
弃去上清加入200μl染色缓冲液重悬细胞沉淀，上机检测。
对比例2
1、本申请对比例2所用仪器与试剂同实施例1。
2、间充质干细胞(MSC)去增殖预处理
在一个汇合度达80％左右MSC细胞的T75培养瓶中，加入400μl浓度为1μg/μl的丝裂霉素C预处理2h。
3、间充质干细胞接种六孔板
将丝裂霉素C处理过的间充质干细胞弃去上清液，并用PBS缓冲液洗涤两次，弃上清液。加2ml胰酶消化1min，加5ml培养基终止，过100μm细胞筛后500×g离心5min，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，吸取10μl细胞悬液和台盼蓝混合均匀计数。根据计数结果按照每孔4×105个细胞的数量接种到6孔板种，每孔加入2ml培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
4、PBMC复苏与培养
液氮中取出冻存的PBMC，快速放入37℃水浴锅中轻轻晃动冻存管60-90秒，直至细胞融化。将其转移至包含10ml培养基的15ml离心管中，再加1ml培养基冲洗冻存管，吹打均匀，500×g离心5min。弃上清，加1ml培养基重悬细胞，将其转移至装有20ml培养基的T175中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
5、MSC与PBMC共培养
设置阳性对照组P(PBMC+激活剂)、阴性对照组N(PBMC单独培养)以及实验组E(MSC和PBMC共培养+激活剂)。在步骤4中的培养24h后的PBMC转移至50ml离心管中，再加20ml生理盐水吹打均匀，吸取10μl细胞悬液和丫啶橙一碘化丙啶(AOPI)混合均匀进行计数，按照计数结果将MSC与PBMC的比例1:5的比例进行接种，即每个六孔板种2×106个PBMC细胞。
6、第一激活剂活化初始T淋巴细胞
分别在阳性对照组P和实验组中E中加入终浓度为10μg/ml的PHA-P。于37℃，5％CO2的培养箱中培养72h。
7、PHA-P进行二次激活T淋巴细胞
分别在阳性对照组P和实验组中E的孔中第二次加入终浓度为10μg/ml的PHA-P，分别在三个组别(E、P、N)的孔中各加2μl布雷非德菌素A(Brefeldin A，BFA)，吹打均匀后继续培养6h。
8、培养终止
吸取步骤7中培养6h后培养板中每孔上清液至15ml离心管中，分别标为E、P、N，500×g离心5min，弃上清。加入有3％血清的PBS缓冲液(染色缓冲液)清洗1-2次。再向离心管中分别加入100μl染色缓冲液重悬细胞，分别加入5-10μl Fc-block(受体封闭剂)，常温避光孵育10-15min。
9、抗体表面染色
向步骤8Fc-block封闭后的细胞中各加入100μl染色缓冲液，重悬细胞使其均匀分布。按照不同组别转移至流式管中，分为实验组E，实验组同型对照组(E-ISO)，阳性对照组P，阳性同型对照组(P-ISO)和阴性对照组N，阴性同型对照组(N-ISO)。每个管中加入100μl细胞悬液。对应Th1细胞亚群的表面抗原加入适量抗体，分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl CD3-FITC和5μl CD8-APC。于4℃，避光孵育30min。
10、终止染色
向步骤9中各组流式管中加入1mL染色缓冲液终止抗体结合染色。于1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入染色缓冲液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
11、固定破膜
弃去步骤10中缓冲液。向各组中加入250μl固定破膜液，混合静置，避光，4℃，20min。加入1ml 1×含破膜剂的破膜洗涤液洗涤，保持细胞渗透性，有利于抗体进入细胞。然后500×g，离心5min，弃上清。再加入1ml破膜洗涤液，常温放置15min，500×g离心5min。
12、抗体胞内染色
将步骤11上清液弃去，每管各加50μl破膜洗涤液，重悬细胞。分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl IFNγ-PE，在E-ISO、P-ISO和N-ISO组的细胞悬液中加入20μl PEIsotype Control，于4℃，避光孵育30min。
13、终止染色
向步骤9中各组流式管中加入1ml破膜洗涤液终止抗体结合染色。1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入1mL破膜洗涤液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
14、上机检测
弃去上清加入200μl染色缓冲液重悬细胞沉淀，上机检测。
对比例3
1、本申请对比例3所用仪器与试剂同实施例1。
2、间充质干细胞(MSC)去增殖预处理
在一个汇合度达80％左右MSC细胞的T75培养瓶中，加入400μl浓度为1μg/μl的丝裂霉素C预处理2h。
3、间充质干细胞接种六孔板
将丝裂霉素C处理过的间充质干细胞弃去上清液，并用PBS缓冲液洗涤两次，弃上清液。加2ml胰酶消化1min，加5ml培养基终止，过100μm细胞筛后500×g离心5min，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，吸取10μl细胞悬液和台盼蓝混合均匀计数。根据计数结果按照每孔4×105个细胞的数量接种到6孔板种，每孔加入2ml培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
4、PBMC复苏与培养
液氮中取出冻存的PBMC，快速放入37℃水浴锅中轻轻晃动冻存管60-90秒，直至细胞融化。将其转移至包含10ml培养基的15ml离心管中，再加1ml培养基冲洗冻存管，吹打均匀，500×g离心5min。弃上清，加1ml培养基重悬细胞，将其转移至装有20ml培养基的T175中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
5、MSC与PBMC共培养
设置阳性对照组P(PBMC+激活剂)、阴性对照组N(PBMC单独培养)以及实验组E(MSC和PBMC共培养+激活剂)。在步骤4中的培养24h后的PBMC转移至50ml离心管中，再加20ml生理盐水吹打均匀，吸取10μl细胞悬液和丫啶橙一碘化丙啶(AOPI)混合均匀进行计数，按照计数结果将MSC与PBMC的比例1:5的比例进行接种，即每个六孔板种2×106个PBMC细胞。
6、第二激活剂活化初始T淋巴细胞
分别在阳性对照组P和实验组中E中加入终浓度为50ng/ml的PMA和终浓度为1μg/ml的离子霉素(Ionomycin)，分别在三个组别(E、P、N)的孔中各加2μl BFA，吹打均匀，于37℃，5％ CO2的培养箱中培养6h。
7、培养终止
吸取步骤6中培养6h后培养板中每孔上清液至15ml离心管中，分别标为E、P、N，500×g离心5min，弃上清。加入有3％血清的PBS缓冲液(染色缓冲液)清洗1-2次。再向离心管中分别加入100μl染色缓冲液重悬细胞，分别加入5-10μl Fc-block(受体封闭剂)，常温避光孵育10-15min。
8、抗体表面染色
向步骤7Fc-block封闭后的细胞中各加入100μl染色缓冲液，重悬细胞使其均匀分布。按照不同组别转移至流式管中，分为实验组E，实验组同型对照组(E-ISO)，阳性对照组P，阳性同型对照组(P-ISO)和阴性对照组N，阴性同型对照组(N-ISO)。每个管中加入100μl细胞悬液。对应Th1细胞亚群的表面抗原加入适量抗体，分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl CD3-FITC和5μl CD8-APC。于4℃，避光孵育30min。
9、终止染色
向步骤8中各组流式管中加入1mL染色缓冲液终止抗体结合染色。于1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入染色缓冲液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
10、固定破膜
弃去步骤9中缓冲液。向各组中加入250μl固定破膜液，混合静置，避光，4℃，20min。加入1ml1×含破膜剂的破膜洗涤液洗涤，保持细胞渗透性，有利于抗体进入细胞。然后500×g，离心5min，弃上清。再加入1ml破膜洗涤液，常温放置15min，500×g离心5min。
11、抗体胞内染色
将步骤10上清液弃去，每管各加50μl破膜洗涤液，重悬细胞。分别在E、P、N组的细胞悬液中加入20μl IFNγ-PE，在E-ISO、P-ISO和N-ISO组的细胞悬液中加入20μl PEIsotype Control，于4℃，避光孵育30min。
12、终止染色
向步骤9中各组流式管中加入1ml破膜洗涤液终止抗体结合染色。1000rpm，离心5min。弃去上清液，加入1mL破膜洗涤液清洗一遍，1000rpm，离心5min。
13、上机检测
弃去上清加入200μl染色缓冲液重悬细胞沉淀，上机检测。
实施例4
本发明实施例1与对比例1、2、3结果说明：
表1：实施例1与对比例1-3间充质干细胞对Th1细胞抑制作用检测结果。
采用不同激活剂组合激活淋巴细胞，不同培养时间及是否添加保护剂所获得间充质干细胞对Th1细胞亚群的抑制作用结果统计显示(图1)，实施例1中MSC对Th1抑制率最高，与对比例1、2、3相比具有显著差异性。
实施例1和对比例1的结果对比显示，选用相同的激活方式，并同样激活两次，在实施例1中添加保护剂，在对比例1中不添加保护剂，导致对比例1的Th1的检测效果和MSC对Th1的抑制率低于实施例1(表1)。实施例1中流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果如图2所示，说明MSC和PBMC共培养后，MSC抑制了Th1淋巴细胞亚群的比例。对比例1流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果如图3所示，说明MSC和PBMC共培养后，MSC抑制了Th1淋巴细胞亚群的比例。但对于Th1淋巴细胞亚群的检测效果没有实施例1高，说明了保护剂对细胞保护的重要性，可提高对Th1的检测效果。
实施例1和对比例2的结果对比显示，同样激活两次，选用的激活剂联合方式不同，且未添加保护剂导致对比例2的Th1的检测效果和MSC对Th1的抑制率不如实施例1。对比例2流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果如图4所示，说明MSC和PBMC共培养后，MSC抑制了Th1淋巴细胞亚群的比例。但对于Th1淋巴细胞亚群的检测效果低于实施例1，和对比例1，说明采用两种不同激活剂及保护剂在很大程度上影响T淋巴细胞激活效果。
实施例1和对比例3的结果对比显示，单次激活，并且培养时间较短(对比例3：6h)，且未添加保护剂，令对比例3对胞内因子IFN-γ的检测效果低下，且MSC对Th1的抑制作用效果低。对比例3流式细胞术检测Th1细胞亚群比例结果如图5所示，说明MSC和PBMC共培养后，MSC抑制了Th1淋巴细胞亚群的比例。且Th1淋巴细胞亚群的检测效果显著低于实施例1、对比例1、对比例2，说明只使用一种激活剂，培养时间短且未添加保护剂使T淋巴细胞激活效果不理想。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (15)
1.一种组合物，其特征在于，包括：第一激活剂和第二激活剂；
所述第一激活剂包括植物血球凝集素P；
所述第二激活剂包括佛波酯和离子霉素。
2.一种药物联合，其特征在于，包括：第一激活剂和第二激活剂；
所述第一激活剂包括植物血球凝集素P；
所述第二激活剂包括佛波酯和离子霉素。
3.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的药物联合，其特征在于，所述第一激活剂与所述第二激活剂的质量比为9.5:1。
4.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的药物联合，其特征在于，所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为0.05:1；
所述植物血球凝集素P、所述佛波酯和所述离子霉素的质量比为10:0.05:1。
5.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的药物联合，其特征在于，所述组合物或药物联合进一步包括保护剂；
其中，所述保护剂的成分选自多聚糖聚乙烯吡咯烷酮(PVC)、聚乙二醇、海藻糖、β巯基乙醇以及人血清白蛋白中的一种或多种组合。
6.一种激活T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将T淋巴细胞在权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的药物联合存在的条件下进行培养处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养处理是通过如下方式进行的：
将T淋巴细胞在第一激活剂存在的条件下进行第一培养处理70～74小时；和
将第一培养处理产物在第二激活剂存在的条件下进行第二培养处理。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一培养处理时间为72小时。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一激活剂在第一培养处理体系中的浓度为8～12μg/ml。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一激活剂在所述第一培养处理体系中的浓度为10μg/ml。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，佛波酯在第二培养处理体系中的浓度为50ng/ml；
离子霉素在所述第二培养处理体系中浓度为1μg/ml。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一培养处理中，进一步包括在保护剂存在的条件下进行所述第一培养处理。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二培养处理中，进一步包括在保护剂存在的条件下进行所述第二培养处理。
14.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的药物联合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于激活T淋巴细胞。
15.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的药物联合。
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- 2023-06-15 CN CN202310711031.7A patent/CN116814545A/zh active Pending
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