CN112080468A - 一种用于自体淋巴细胞培养的组合物、培养液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于自体淋巴细胞培养的组合物、培养液及其应用。本发明所要保护的用于自体淋巴细胞培养的组合物的活性成分由血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL‑2、IL‑7、IL‑15和PHA‑P组成。相比较于作为对照的用于培养淋巴细胞的组合物,使用含有本发明所提供的组合物的培养基诱导培养外周血单个核细胞得到的T淋巴细胞亚群的含量显著升高;淋巴细胞数量在培养14天时也显著升高,升高了1.15倍;淋巴细胞对K562细胞的杀伤活性也显著增强,增强了1.6倍。本发明所提供的用于自体淋巴细胞培养的组合物可以用于特异性诱导扩增单个核细胞产生具有高纯度和较强生物学活性的自体淋巴细胞。
Description
技术领域
本发明涉及淋巴细胞培养技术领域,具体涉及一种用于自体淋巴细胞培养的培养液。
背景技术
淋巴细胞作为一类不均一的细胞群体,包括许多具有不同免疫功能的亚群。是机体免疫应答功能的重要细胞组分,是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者,是机体抵抗外界感染和监控体内细胞变异的一线防御系统。淋巴细胞作为一类具有免疫识别功能的细胞系,根据其发生迁移、表面蛋白分子和功能的不同,可以分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞。淋巴细胞的过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)是指通过体外诱导扩增具有抗肿瘤活性的淋巴细胞,过继于患者体内,通过激活机体的细胞和体液免疫应答,重启并维持肿瘤-免疫循环,恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应,从而达到控制和清除肿瘤的目的。现有体外诱导扩增自体淋巴细胞制备技术,由于不能产业化生产,质量较难控制,限制其临床的广泛应用。亟需一种可满足产业化生产需求,扩增效率稳定的可以满足临床治疗需求的淋巴细胞培养基。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何培养高细胞纯度的淋巴细胞或如何培养具有较强生物活性的淋巴细胞或如何改善免疫细胞的增殖状态或如何使淋巴细胞的扩增效率稳定。
为了解决上述技术问题,本发明首先提供了一种用于培养淋巴细胞的组合物。
本发明所提供的用于培养淋巴细胞的组合物由血浆、抗人CD3单克隆抗体(克隆号OKT3)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-15(IL-15)、植物凝集素P(PHA-P)组成。所述组合物中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的配比为血浆50~200uL,人CD3单克隆抗体50~150ng,PHA-P 100~1000ng,IL-2 300~1000U,IL-7 10~50ng,IL-15 30~100ng。
上述组合物中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的配比为血浆100μL,人CD3单克隆抗体50~150ng,PHA-P 100~1000ng,IL-2 300~1000U,IL-7 10~50ng,IL-15 30~100ng。
上述组合物中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的配比为血浆100uL,人CD3单克隆抗体100ng,PHA-P 500ng,IL-2 500U,IL-7 25ng,IL-15 50ng。
上述血浆为患者的自体血浆,上述淋巴细胞为患者的自体淋巴细胞。
上述淋巴细胞可为哺乳动物淋巴细胞,如人淋巴细胞。所述淋巴细胞可为患者的自体淋巴细胞。
上述血浆可为哺乳动物血浆,如人血浆。所述血浆可为患者的自体血浆。
上述组合物除了所述活性成分外,还可含有注射用水。
上述组合物中,各组分可以混合在一起,也可以各自独立包装,使用时再混合在一起。
含有上述组合物的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围,所述试剂盒用于培养淋巴细胞。
上述试剂或试剂盒包括用于培养淋巴细胞的基础培养基。
上述试剂可为用于培养淋巴细胞的培养液。
上述用于培养淋巴细胞的基础培养基可为LONZA X-VIVO 15X培养基。
本发明还提供了制备淋巴细胞的方法,包括用上文任一所述的组合物的培养液培养离体的外周血单个核细胞,得到淋巴细胞。
所述淋巴细胞可为哺乳动物淋巴细胞,如人淋巴细胞。所述淋巴细胞可为患者的自体淋巴细胞。所述外周血单个核细胞可为哺乳动物的外周血单个核细胞,如人外周血单个核细胞。所述外周血单个核细胞可为患者的自体外周血单个核细胞。
所述培养液中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的含量为血浆50~200μL/mL,人CD3单克隆抗体50~150ng/mL,PHA-P 100~1000ng/mL,IL-2 300~1000U/mL,IL-7 10~50ng/mL,IL-15 30~100ng/mL。
所述培养液中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的含量可为血浆100μL/mL,人CD3单克隆抗体50~150ng/mL,PHA-P 100~1000ng/mL,IL-2 300~1000U/mL,IL-7 10~50ng/mL,IL-15 30~100ng/mL。
所述培养液中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的含量可为血浆100μL/mL,人CD3单克隆抗体100ng/mL,PHA-P 500ng/mL,IL-2 500U/mL,IL-7 25ng/mL,IL-15 50ng/mL。
所述培养液还含有用于培养淋巴细胞的基础培养基。所述用于培养淋巴细胞的基础培养基可为LONZA X-VIVO 15X培养基。所述基础培养基为加入了人γ干扰素IFN-γ得到的含1000U/ml IFN-γ的的液体。
所述培养液具体可为向LONZA X-VIVO 15X培养基(含IFN-γ1000U/ml)中加入血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P得到的液体。
本发明还提供了下述任意一种应用:
P1、上文所述的组合物和/或上文所述的试剂或试剂盒和/或上文所述的方法在制备扩增自体淋巴细胞产品中的应用;
P2、上文所述的组合物和/或上文所述的试剂或试剂盒和/或上文所述的方法在制备提高单个核细胞诱导的自体淋巴细胞纯度产品中的应用;
P3、上文所述的组合物和/或上文所述的试剂或试剂盒和/或上文所述的方法在制备增强自体淋巴细胞生物学活性的产品中的应用;
所述生物学活性可为对靶细胞的杀伤活性。
P4、上文所述的组合物和/或上文所述的试剂或试剂盒和/或上文所述的方法在制备改善体外免疫细胞的增殖状态产品中的应用;
P5、上文所述的组合物和/或上文所述的试剂或试剂盒和/或上文所述的方法在扩增自体淋巴细胞中的应用。
实验证明,与作为对照的用于培养淋巴细胞的组合物相比,使用本发明的用于培养淋巴细胞的组合物,从人外周血单个核细胞中制备的自体淋巴细胞中CD3+CD56-、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、D3+CD45RO+等T淋巴细胞亚群的含量均显著升高,其中CD3+CD56-升高了30.4%,CD3+CD4+升高了31.9%,CD3+CD8+升高了22.8%,CD3+CD56+升高了28.9%,CD3+CD45RO+升高了31.6%;淋巴细胞数量在培养14天时显著升高,升高了1.15倍;淋巴细胞对K562细胞的杀伤活性也显著增强,增强了1.6倍。表明本发明所提供的用于自体淋巴细胞培养的培养液可显著提高单核细胞诱导的自体淋巴细胞纯度并可诱导获得具有较强生物学活性自体淋巴细胞。
附图说明
图1为外周血T淋巴细胞亚群绝对计数。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图2为免疫细胞的生长曲线。
图3为免疫细胞的扩增效率曲线。
图4为淋巴细胞在不同的效靶比条件下对K562细胞的杀伤活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的人自体血浆和人外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)来自中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院患者,患者已签署知情同意书,本研究得到中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院伦理委员会的批准。
下述实施例中的LONZA X-VIVO 15X培养基(货号:04-418Q)为LONZA公司产品,
所述LONZA X-VIVO 15X培养基含有人白蛋白、重组人胰岛素及巴氏消毒转铁蛋白;抗人CD3单克隆抗体(克隆号OKT3)为TAKARA公司产品,产品目录号为T210;白细胞介素2(IL-2)为北京双鹭药业股份有限公司公司的产品,产品目录号为国药准字S20020016;白细胞介素15(IL-15)为上海普欣生物技术有限公司产品,产品目录号为GMP-101-15;白细胞介素7(IL-7)为北京百奥莱博科技有限公司产品,产品目录号为JN0349-KFR;植物凝集素P(PHA-P)为sigma公司产品,产品目录号为L8754;抗体CD3-PerCP-Cy5.5为PeproTech(BioGems)产品,产品目录号:05121-70-100;CD4-FITC为BD Pharmingen产品,产品目录号:561005;CD8-APC为BD Pharmingen产品,产品目录号:561952;CD56-PE为BD Biosciences产品,产品目录号:340685;CD45RO-APC为BD Pharmingen产品,产品目录号:560899;人γ干扰素IFN-γ为上海普欣生物技术有限公司产品,产品目录号:GMP-106-06。
实施例1、使用本发明的用于培养淋巴细胞的组合物及培养液制备自体淋巴细胞
1、自体淋巴细胞培养液制备
1.1人自体血浆制备
将人自体血浆置于56℃水浴30分钟,2-8℃冰箱放置至少10分钟,低温2000rpm离心10分钟,去除沉淀即得人自体血浆,标记生产批号,置于2-8℃保存备用。
1.2自体淋巴细胞培养液配制
1.2.1本发明的自体淋巴细胞培养液的制备
利用本发明的用于培养淋巴细胞的组合物制备本发明的自体淋巴细胞培养液。本发明的用于培养淋巴细胞的组合物由人自体血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P组成,该组合物中,人自体血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的配比为人自体血浆100μL,人CD3单克隆抗体100ng,PHA-P 500ng,IL-2 500U,IL-7 25ng,IL-15 50ng。该组合物的各个组分可独立包装也可混合存放。
向LONZA X-VIVO 15X培养基中加入人γ干扰素IFN-γ,得到的液体即为含IFN-γ1000U/ml的LONZA X-VIVO 15X基础培养基,然后向其中加入1.1中制备的人自体血浆、以及抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P得到本发明的自体淋巴细胞培养液,每毫升本发明的自体淋巴细胞培养液含有:人自体血浆100uL、抗人CD3单克隆抗体100ng、PHA-P500ng、IL-2 500U、IL-7 25ng和IL-15 50ng。
1.2.2对照自体淋巴细胞培养液的制备
利用作为对照的用于培养淋巴细胞的组合物制备对照自体淋巴细胞培养液。作为对照的用于培养淋巴细胞的组合物由人自体血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2和IL-1α组成,该组合物中,人自体血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2和IL-1α的配比为人自体血浆100uL、抗人CD3单克隆抗体100ng、IL-2 500U和IL-1α1ng。该组合物的各个组分独立包装。
向LONZA X-VIVO 15X培养基中加入人γ干扰素IFN-γ,得到的液体即为含IFN-γ1000U/ml的LONZA X-VIVO 15X基础培养基,然后向其中加入1.1中制备的人自体血浆、以及抗人CD3单克隆抗体、IL-2和IL-1α得到本发明的自体淋巴细胞培养液,每毫升本发明的自体淋巴细胞培养液含有:人自体血浆100uL、抗人CD3单克隆抗体100ng、IL-2 500U和IL-1α1ng。
2、制备自体淋巴细胞
同时进行下述实验组和对照组的平行实验,实验组和对照组的区别仅在于所采用的自体淋巴细胞培养液不同,其他完全相同。实验重复三次,每次实验方法如下:
2.1实验组:
(1)抽取患者空腹状态下外周血50ml,经过肝素管抗凝,用淋巴细胞分离液(ficoll)分离并收集人外周血单个核细胞(PBMC)并用T75培养瓶培养。按照1×106个细胞50ml培养液的比例将人外周血单个核细胞接入1.2.1中的本发明的自体淋巴细胞培养液(培养第0天),置于37℃、5%CO2条件下培养,隔天(培养第2天)补加培养基(1.2.1中的本发明的自体淋巴细胞培养液),静置培养72h(培养第5天),制得培养液(I);
(2)向培养液(I)中补加1.2.1中的本发明的自体淋巴细胞培养液至200~250mL,培养箱中静置培养96h(培养第9天),后吸取10~20ml液体做微生物培养检测。微生物培养检测阴性后,继续培养,制得培养液(II);
(3)向培养液(II)中添加1.2.1中的本发明的自体淋巴细胞培养液至900mL,静置培养72h(培养第12天),后吸取10~20ml液体做微生物培养检测。微生物检测阴性后,继续培养,制得培养液(III);
(4)向培养液(III)中添加1.2.1中的本发明的自体淋巴细胞培养液至1800mL,静置培养72h(培养第15天),后吸取10~20ml液体做微生物培养检测。微生物检测阴性后,继续培养。重复此步骤一次后,制得自体淋巴细胞,以下简称本发明的自体淋巴细胞。结果表明从50ml外周血中得到了5.7×109个本发明的自体淋巴细胞。
2.2对照组:
(1)抽取患者(该患者与2.1为同一患者)空腹状态下外周血50ml,经过肝素管抗凝,用淋巴细胞分离液(ficoll)分离并收集人外周血单个核细胞(PBMC)并用T75培养瓶培养。按照1×106个细胞50ml培养液的比例将人外周血单个核细胞接入1.2.2中的对照自体淋巴细胞培养液,置于37℃、5%CO2条件下培养,隔天补加培养基(1.2.2中的对照自体淋巴细胞培养液),静置培养72h,制得培养液(I);
(2)向培养液(I)中补加1.2.2中的对照自体淋巴细胞培养液至200~250mL,培养箱中静置培养96h,后吸取10~20ml液体做微生物培养检测。微生物培养检测阴性后,继续培养,制得培养液(II);
(3)向培养液(II)中添加1.2.2中的对照自体淋巴细胞培养液至900mL,静置培养72h,后吸取10~20ml液体做微生物培养检测。微生物检测阴性后,继续培养,制得培养液(III);
向培养液(III)中添加1.2.2中的对照自体淋巴细胞培养液至1800mL,静置培养72h,后吸取10~20ml液体做微生物培养检测。微生物检测阴性后,继续培养。重复此步骤一次后,制得自体淋巴细胞,以下简称对照自体淋巴细胞。结果表明从50ml外周血中得到了2.6×109个对照自体淋巴细胞。
3.自体淋巴细胞的特性分析
3.1免疫细胞表面免疫表型测定及绝对计数测定
取步骤2中制备的本发明的自体淋巴细胞和对照自体淋巴细胞,使用PBS洗涤后用PBS制成细胞悬液1×106个细胞/100uL,分别加入CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD8-APC、CD56-PE、CD45RO-APC抗体,避光孵育30min后,1500rpm离心5分钟,PBS洗涤2次,最后加入2%多聚甲醛100μl,振荡混匀,静置20分钟后。流式细胞仪检测免疫细胞表面免疫表型即T淋巴细胞亚群含量。
采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理,实验结果以平均值±标准偏差表示,采用t检验进行差异显著性分型。
实验结果表明,通过对外周血T淋巴细胞亚群进行绝对计数发现,与对照自体淋巴细胞相比较,本发明的自体淋巴细胞CD3+CD56-、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3+CD45RO+均显著升高,其中CD3+CD56-升高了30.4%(***P<0.001),CD3+CD4+升高了31.9%(***P<0.001),CD3+CD8+升高了22.8%(**P<0.01),CD3+CD56+升高了28.9%(*P<0.05),CD3+CD45RO+升高了31.6%(**P<0.01)(图1)。因此使用本发明的自体淋巴细胞培养液培养,单核细胞诱导的自体淋巴细胞纯度显著提高。
3.2、免疫细胞生长曲线的测定
分别取2.1的实验组和2.2的对照组培养的第0、3、5、7、9、11、14天的细胞,洗涤后用PBS制成细胞悬液1×106个/mL,将细胞悬液与0.4%台盼蓝以9:1混合混匀后,用血分仪进行计数,计算活细胞总数绘制免疫细胞的生长曲线(图2),并计算活细胞比例绘制免疫细胞扩增效率曲线(图3)。
实验结果的免疫细胞的生长曲线显示培养至第9天之后,实验组淋巴细胞数量明显高于对照组,第14天时差异性显著,升高了1.15倍(图2),表明本发明的自体淋巴细胞培养液较对照自体淋巴细胞培养液能明显改善免疫细胞的增殖状态;免疫细胞扩增效率曲线显示培养第3天之后,实验组淋巴细胞活细胞比例维持在90%以上,高于对照组4%-11%(图3),表明本发明的自体淋巴细胞培养液较对照自体淋巴细胞培养液能保持免疫细胞更稳定的扩增效率。
3.3、免疫细胞毒性测定
分别取2.1中实验组的本发明的自体淋巴细胞悬液和2.2中对照组的对照自体淋巴细胞悬液离心洗涤后调整细胞密度为1×106个细胞/mL,用移液器充分混匀得到CIK细胞(细胞因子诱导的杀伤细胞),作为效应细胞。将浓度为1μg/μl的荧光染料Calcein-AM溶液(终浓度保持在1-10μM,Invitrogen公司生产,产品目录号:C3099))和靶细胞K562细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)悬液体积按照1:200(1×106个细胞靶细胞中对应5μL Calcein-AM溶液)比例进行完全混合后置于37℃孵育30min。孵育后的靶细胞1000rpm离心5min,用PBS洗涤两次,使用培养基将染色后细胞浓度调整至2×105个细胞/mL,加入96孔板,每孔50μl,孔密度为1×104个细胞/孔。将效应细胞重悬离心后用PBS洗两次,完全去除残留培养基,1000rpm离心,5min。用RPMI 1640培养基重悬后计数,按照50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和1:3这7种不同的效靶比(效应细胞的个数/靶细胞的个数),计数出所需的细胞数,并取出接入RPMI 1640培养基中,50μL/孔,加入已含有靶细胞的96孔板中,用于实验组和对照组的荧光测定,以分析实验组和对照组的CIK细胞的杀伤作用。同时设置三个组,一组为靶细胞自发释放组(作为背景值用于校正靶细胞自发释放出的荧光),50μL/孔相同数量的靶细胞,补加50μL/孔培养基;一组为靶细胞完全释放组(靶细胞能够释放100%的荧光),50μL/孔相同数量的靶细胞,补加50μL/孔培养基;一组为只添加培养基的空白对照组,只加入培养基。将实验组和对照组及上述三个组的96孔板均放于37℃细胞培养箱中孵育4h。孵育结束后在靶细胞完全释放组中加入100μL/孔5%Triton-100,反复吹吸,将靶细胞完全裂解,并在其他孔中加入100μL/孔PBS,再在培养箱中孵育60min。将实验组和对照组及上述三个组的96孔板2000rpm/min,离心5min,吸取上清100μL转移至黑壁96孔荧光酶标板中,使用酶标仪进行荧光强度检测,激发波长490nm,发射波长515nm。计算:以单纯靶细胞自发释放孔作为空白对照,以靶细胞完全释放孔作为阳性对照,以培养基空白对照孔作为阴性对照,分析实验组和对照组的CIK细胞杀伤作用。杀伤效率(%)=(实验组或对照组荧光值-自发释放组荧光值)/(完全释放组荧光值-自发释放组荧光值)×100%。
实验重复三次,采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理,实验结果以平均值±标准偏差表示,采用单因素方差分析检验进行差异显著性分型。
实验结果如图4所示,本发明的自体淋巴细胞较对照自体淋巴细胞对K562细胞的杀伤活性在不同的效靶比条件下(2:1、5:1、10:1、20:1、50:1)均显著高于对照组(*P<0.05;**P<0.01),其中,效靶比50:1的杀伤活性提高了1.6倍,表明本发明的自体淋巴细胞培养液诱导的淋巴细胞较对照自体淋巴细胞培养液诱导的淋巴细胞具有较强的生物学活性即对靶细胞具有较强的杀伤活性。
Claims (10)
1.用于培养淋巴细胞的组合物,所述组合物的活性成分由血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P组成,所述组合物中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的配比为血浆50~200μL,人CD3单克隆抗体50~150ng,PHA-P 100~1000ng,IL-2 300~1000U,IL-7 10~50ng,IL-15 30~100ng。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于:所述组合物中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的配比为血浆100μL,人CD3单克隆抗体50~150ng,PHA-P 100~1000ng,IL-2 300~1000U,IL-7 10~50ng,IL-15 30~100ng。
3.根据权利要求2所述的组合物,其特征在于:所述组合物中,血浆、抗人CD3单克隆抗体、IL-2、IL-7、IL-15和PHA-P的配比为血浆100μL,人CD3单克隆抗体100ng,PHA-P 500ng,IL-2 500U,IL-7 25ng,IL-15 50ng。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的组合物,其特征在于:所述血浆为患者的自体血浆,所述淋巴细胞为患者的自体淋巴细胞。
5.含有权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物的试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒用于培养淋巴细胞。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒,其特征在于:所述试剂或试剂盒包括IFN-γ。
7.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒,其特征在于:所述试剂或试剂盒包括用于培养淋巴细胞的基础培养基。
8.制备淋巴细胞的方法,包括用含有权利要求1-4中任一所述的组合物的培养液培养离体的外周血单个核细胞,得到淋巴细胞。
9.下述任意一种应用:
P1、权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物和/或权利要求5-7中任一权利要求所述的试剂或试剂盒和/或权利要求8所述的方法在制备扩增自体淋巴细胞产品中的应用;
P2、权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物和/或权利要求5-7中任一权利要求所述的试剂或试剂盒和/或权利要求8所述的方法在制备提高单个核细胞诱导的自体淋巴细胞纯度产品中的应用;
P3、权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物和/或权利要求5-7中任一权利要求所述的试剂或试剂盒和/或权利要求8所述的方法在制备增强自体淋巴细胞生物学活性的产品中的应用;
P4、权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物和/或权利要求5-7中任一权利要求所述的试剂或试剂盒和/或权利要求8所述的方法在制备改善体外免疫细胞的增殖状态产品中的应用;
P5、权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物和/或权利要求5-7中任一权利要求所述的试剂或试剂盒和/或权利要求8所述的方法在扩增自体淋巴细胞中的应用。
10.由权利要求8所述的方法制备的淋巴细胞。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113207871A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-08-06 | 新乡医学院 | 一种用于体外保存t记忆性干细胞的储存液及其应用 |
CN113398262A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-17 | 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司 | 用于治疗her2阳性胃癌的组合物及应用 |
CN113583955A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-11-02 | 羽铂精制生物技术(成都)有限公司 | 一种因子法扩增t细胞的培养基及培养方法 |
CN115927169A (zh) * | 2022-10-11 | 2023-04-07 | 再造再生医学科技(杭州)有限公司 | 用于扩增cd34+造血干细胞的培养液和体外扩增cd34+造血干细胞的方法 |
CN116814545A (zh) * | 2023-06-15 | 2023-09-29 | 深圳华大基因细胞科技有限责任公司 | 人脐带间充质干细胞体外抑制IFN-γ分泌的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102816735A (zh) * | 2012-09-12 | 2012-12-12 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞的培养方法 |
CN105238753A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-13 | 成都百赛泰科生物科技有限公司 | 一种用于制备ctl的试剂盒及其应用 |
CN110904045A (zh) * | 2018-09-17 | 2020-03-24 | 中国科学院动物研究所 | 经修饰的t细胞、其制备方法及用途 |
-
2020
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102816735A (zh) * | 2012-09-12 | 2012-12-12 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞的培养方法 |
CN105238753A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-13 | 成都百赛泰科生物科技有限公司 | 一种用于制备ctl的试剂盒及其应用 |
CN110904045A (zh) * | 2018-09-17 | 2020-03-24 | 中国科学院动物研究所 | 经修饰的t细胞、其制备方法及用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
孙凌云: "《分子风湿病学》", 30 June 1997 * |
朱大诚等: "《医学功能学科实验指导》", 31 March 2010 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113207871A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-08-06 | 新乡医学院 | 一种用于体外保存t记忆性干细胞的储存液及其应用 |
CN113398262A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-17 | 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司 | 用于治疗her2阳性胃癌的组合物及应用 |
CN113583955A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-11-02 | 羽铂精制生物技术(成都)有限公司 | 一种因子法扩增t细胞的培养基及培养方法 |
CN115927169A (zh) * | 2022-10-11 | 2023-04-07 | 再造再生医学科技(杭州)有限公司 | 用于扩增cd34+造血干细胞的培养液和体外扩增cd34+造血干细胞的方法 |
CN115927169B (zh) * | 2022-10-11 | 2023-08-11 | 再造再生医学科技(杭州)有限公司 | 用于扩增cd34+造血干细胞的培养液和体外扩增cd34+造血干细胞的方法 |
CN116814545A (zh) * | 2023-06-15 | 2023-09-29 | 深圳华大基因细胞科技有限责任公司 | 人脐带间充质干细胞体外抑制IFN-γ分泌的方法 |
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