CN102816735A - 一种自体外周血淋巴细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，包括如下步骤：（1）从外周血中分离PBMC，然后，重悬于无血清培养基中，静置培养，制得初培养液；（2）向初培养液中补加无血清培养基，同时添加IL-2，静置培养，得二次培养液；（3）向二次培养液中补加无血清培养基，同时添加IL-2，静置培养，得培养液；（4）将培养液均匀分成2份，然后用无血清培养基补足体积并添加IL-2，静置培养，重复本步骤，制得自体外周血淋巴细胞；本发明通过向无血清培养基中添加多种单抗及细胞因子，提高效应细胞群活化效率和扩增效率。经检测，活化及扩增效率较现有方法明显提高，激活3天左右有大量细胞团出现。

Description

一种自体外周血淋巴细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及一种自体外周血淋巴细胞（Autologous immunotherapy lymphocytes，AIL）的培养方法，属于免疫细胞体外培养技术领域。

背景技术

过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞（具有特异免疫力）或其产物输给细胞免疫功能低下者（如肿瘤病人），使其获得抗肿瘤免疫力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法。基于肿瘤的发生、发展和预后与机体免疫功能，尤其是细胞免疫功能关系密切，1985年美国国家癌症研究委员会将癌症的免疫疗法确立为继外科手术、放射疗法和化学药物疗法之后的第四种疗法。AIL细胞即属于过继免疫疗法中的一员。与传统方法相比，AIL细胞因具有以下四个方面的优势而广泛应用于临床：

1、减少恶性肿瘤术后复发与转移。手术后进行免疫治疗，可显著增强肿瘤患者免疫系统功能，有利于清除术后体内残留的癌细胞及微转移灶，降低局部复发和向远处转移的概率。

2、参与肿瘤综合治疗。肿瘤是一个由遗传因素及环境因素综合作用引起的多基因突变疾病。因此它的治疗方案也是几种治疗方式的综合。在肿瘤放疗和化疗间歇期间进行免疫细胞治疗，有助于增强患者自身的免疫力，从而增加对放疗和化疗毒副反应的耐受能力，提高癌症综合治疗的疗效。

3、少数肿瘤的主要治疗手段。免疫细胞治疗是肝癌、肾癌、恶性黑色素瘤等一些对放化疗敏感性较低的恶性肿瘤的有效治疗手段。

4、改善晚期癌症患者的生活质量。由于免疫细胞治疗的副作用极低，可以减轻晚期患者的痛苦，提高他们的生活质量。

AIL技术较之其他过继免疫治疗方法，如LAK、TIL等技术，在安全性和有效性上作了近一步的提高和优化，具有如下特点：

I、AIL细胞是以杀伤性T淋巴细胞为主的混合性T淋巴细胞和NK细胞群体；其中CD3⁺CD56⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞是主要的效应细胞。

II、采用无血清培养体系：AIL细胞体外培养体系采用独特的无血清培养基和细胞因子组合。无血清培养系统避免了因使用血清可能导致的细胞污染及其它对细胞生长的不利因素；所采用的细胞因子均为药用级别。

III、细胞扩增效率高，不需要使用单核细胞采集机：在体外高效活化和扩增患者自身的T淋巴细胞，从1-2×10⁷外周血单个核细胞开始，可以获得1-2×10¹⁰活化扩增的以杀伤性T淋巴细胞为主的T细胞和NK细胞混合细胞群体，这种高效扩增，避免了需要使用大量起始外周血单个核细胞对患者整体免疫细胞系统的破坏作用。

IV、细胞活性高、稳定性好：AIL细胞培养体系培养出的细胞，活性和稳定性好，细胞可保存12个小时而不影响其治疗效果（细胞活性>95%）。特别是AIL可以冻存细胞，精准的培养系统紧密配合手术、放疗和化疗。

现有的自体淋巴细胞培养技术扩增效率较低，细胞杀瘤活性弱，批间稳定性较差，往往需要采集较多的外周血，甚至需要用单采机直接采集患者单个核细胞，对患者身体影响较大，有的患者在采集后会出现浑噩的现象。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种培养自体外周血淋巴细胞的方法。

术语说明

PBMC：外周血单个核细胞；

IL-2：白细胞介素2；

PHA-p：植物凝集素P；

IL-1α：白细胞介素1α；

IFN-γ：干扰素γ；

CD3mAb：细胞表面分子3单克隆抗体；

CD28mAb：细胞表面分子28单克隆抗体。

本发明的技术方案如下：

一种培养自体外周血淋巴细胞的方法，包括如下步骤：

（1）从外周血中分离PBMC，然后，重悬于无血清培养基中，使PBMC的细胞浓度为（1～2）×10⁶个/mL，静置培养72～84小时，制得初培养液；

（2）向步骤（1）制得的初培养液中补加无血清培养基至初培养液的2～3倍，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，静置培养84～96小时，得二次培养液；

（3）向步骤（2）制得的二次培养液中补加无血清培养基至二次培养液的4～5倍，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为（1～2）×10³U/mL，静置培养72～84小时，得培养液；

（4）将步骤（3）制得的培养液均匀分成2份，然后用无血清培养基补足体积并添加IL-2，使IL-2的浓度为（1～2）×10³U/mL，静置培养72～84小时，重复本步骤2～3次，制得自体外周血淋巴细胞；

所述步骤（1）中的无血清培养基，每毫升含有如下组分：

IFN-γ500～2500U、PHA-p 250～1500ng、IL-1α50～250U、CD3mAb 25～150ng、CD28mAb 25～150ng。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的无血清培养基，每毫升含有如下组分：

IFN-γ1000～2000U、PHA-p 500～1000ng、IL-1α100～200U、CD3mAb 50～100ng、CD28mAb 50～100ng。

根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的无血清培养基，每毫升含有如下组分：

IFN-γ2000U、PHA-p 1000ng、IL-1α200U、CD3mAb 100ng、CD28mAb 100ng。

所述步骤（1）～（4）中的静置培养条件为在温度为37℃、CO₂体积百分比为含量为5～7.5%、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中培养。

所述步骤（4）还包括将制得的自体外周血淋巴细胞经离心后，重悬于保存液中，所述保存液每百毫升含有如下组分：

体积百分比为20%的人血清白蛋白1～7mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

根据本发明优选的，所述保存液含有如下组分：

体积百分比为20%的人血清白蛋白5mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

在AIL的培养体系中，AIL细胞是通过诱导活化的T细胞分化而来，CD3分子能够转导T细胞抗原受体识别抗原所产生的活化信号，因此加入CD3mAb可提高T细胞活化效率；CD28分子表达与T细胞表面，它提供共刺激分子信号，这是T细胞活化必不可少的一部分，因此加入CD28mAb可以提高T细胞活化效率；而IFN-γ是由活化T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）产生的具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性的一类细胞因子。可以与结合到干扰素γ受体（IFNGR），激活抗原提呈细胞从而促进I型辅助T细胞（Th1细胞）的分化；PHA-p可以促进细胞的有丝分裂，从而提高AIL细胞的扩增效率。IL-1α可促进细胞分泌IL-2，共刺激CD8+/IL-1α+细胞并且可以杀伤部分肿瘤细胞。

本发明的有益效果如下：

1、本发明通过向无血清培养基中添加多种单抗及细胞因子，提高效应细胞群活化效率和扩增效率。经检测，活化及扩增效率较现有方法明显提高，激活3天左右有大量细胞团出现。

2、本发明采用无血清培养基，减少因添加血清带来的不稳定因素，保持AIL细胞批次间质量的稳定性。

3、本发明通过保护液来保存制得的AIL细胞，该保护液可以使制备的AIL细胞经长途运输后，仍然保持较高的活性和稳定性。

附图说明

图1、实施例1的自体外周血淋巴细胞扩增曲线图；

图2、实施例2的自体外周血淋巴细胞扩增曲线图；

图3、实施例3的自体外周血淋巴细胞扩增曲线图；

图4、对比例的自体外周血淋巴细胞扩增曲线图；

图5、实施例1的自体外周血淋巴细胞细胞毒性实验实验结果柱状图；

图6、实施例2的自体外周血淋巴细胞细胞毒性实验实验结果柱状图；

图7、实施例3的自体外周血淋巴细胞细胞毒性实验实验结果柱状图；

图8、对比例的自体外周血淋巴细胞细胞毒性实验结果柱状图；

图9、实施例1培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD8标记；

图10、实施例2培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD8标记；

图11、实施例3培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD8标记；

图12、对比例培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD8标记；

图13、实施例1培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD56标记；

图14、实施例2培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD56标记；

图15、实施例3培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD56标记；

图16、对比例培养14天后的自体外周血淋巴细胞表面CD3\CD56标记；

图17、细胞保存液组分与细胞活性关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

原料说明

PBMC，采自肿瘤患者外周血，经分离后得到。

IL-2，购自山东泉港药业有限公司。

PHA-p，购自Sigma公司。

IL-1α，购自R&D Systems公司，10μg/支。

CD3mAb，购自R&D Systems公司。

CD28mAb，购自R&D Systems公司。

IFN-γ，购自上海凯茂生物医药有限公司，10⁶U/mL。

本实施例的目的是通过与现有技术实施方案的对比，使本领域技术人员充分了解本发明的技术方案及相应的技术效果，至于本实施例所用到的各种试剂均在市场上能够买到，不同厂家生产的试剂按照本领域常规处理后，不会造成本实施例实验结果的不同。

实施例1

一种培养自体外周血淋巴细胞的方法，包括如下步骤：

（1）从50～100mL外周血中分离PBMC后，重悬于50mL无血清培养基中，PBMC的细胞浓度为2×10⁶个/mL，置于37℃、体积百分比为7.5%CO₂、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中静置培养72小时，制得初培养液；

（2）向步骤（1）制得的初培养液中补加无血清培养基至200mL，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，置于37℃、体积百分比为7.5%CO₂、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中静置培养96小时，得二次培养液；

（3）将步骤（2）制得的二次培养液转移至1.8L细胞培养袋中，补加无血清培养基至1000mL，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，置于37℃、体积百分比为7.5%CO₂、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中静置培养72小时，得培养液；

（4）将步骤（3）制得的培养液均匀分成2份，然后用无血清培养基补足体积并添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，置于37℃、体积百分比为7.5%CO₂、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中静置培养72小时，重复本步骤连续培养28天，分批收获AIL细胞，制得自体外周血淋巴细胞；

所述无血清培养基每毫升含有如下组分：

IFN-γ1000U、PHA-p 500ng、IL-1α100U、CD3mAb 50ng、CD28mAb 50ng。

实验结果

分别在第1、6、9、12、14、16、19、21天收集本实施例制得的自体外周血淋巴细胞用于以下各项测试。

1、细胞增殖倍数的测定

将取得的细胞用台盼蓝染色后再用血球计数板进行计数，并记录计数结果，以培养天数为横坐标，以扩增倍数为纵坐标（扩增倍数=将当前活细胞总数÷第1天起始培养的单个核细胞数）作图，结果如图1所示。

结果显示，培养在1～21天时，AIL细胞的扩增倍数随时间的推移而逐渐上升，1～5天时基本呈直线持平趋势，扩增效率保持恒定，6～21天由于细胞基数较大和传代的原因使扩增倍数缓慢上升，在培养到第21天时达到最大值。

2、细胞毒性实验

取培养至第14天的AIL细胞，与宫颈癌细胞株（又名Hela细胞，购自中国科学院上海细胞研究所）按40:1、20:1和10:1的比例铺于96孔板中在37℃、体积百分比为7.5%CO₂的条件下进行共培养，培养24h后每孔加入CCK-8试剂10μL进行染色，在培养箱中（37℃、体积百分比为7.5%CO₂）孵育2h后在450nm的波长下检测每个孔的OD值，按如下公式计算AIL细胞的杀伤率，结果如图5所示。

细胞存活率(％)=（实验组A₄₅₀平均值-调零组A₄₅₀平均值）/（对照组A₄₅₀平均值-调零组A₄₅₀平均值）×100%

杀瘤活性（%）=1-细胞存活率

结果显示，培养至第14天的AIL细胞对Hela细胞的高杀伤力均高于50%（效靶比为10:1的AIL细胞杀伤率为51.05%）。且效靶比越高，AIL细胞的杀瘤活性越强，效靶比为40:1时达到75.06%。

3、细胞表面标记分析

取培养14天的AIL细胞6×10⁶，洗涤后用生理盐水制成悬液，平均分成6份，每份1mL。分别加入CD3mAb、CD56mAb、CD8mAb、CD3mAb+CD8mAb、CD3mAb+CD56mAb以及等体积的生理盐水，避光孵育30min后，洗涤去除多余抗体，进行流式细胞检测，结果如图9、13所示。

结果显示，培养14天的AIL细胞其表面的CD3⁺CD56⁺细胞的比率为10.65%、CD3⁺CD8⁺的70.91%，CD3⁺CD56⁺和CD3⁺CD8⁺是AIL的主要效应细胞群。CD3⁺CD56⁺细胞和CD3⁺CD8⁺的含量越高，细胞杀瘤活性越强。

实施例2

如实施例1所述的方法，不同之处在于，无血清培养基每毫升含有如下组分：

IFN-γ1500U、PHA-p 750ng、IL-1α150U、CD3mAb 75ng、CD28mAb 75ng。

实验结果

检测过程如实施例1所述。经检测，

1、细胞增殖倍数的测定

结果显示，培养在1～21天时，AIL细胞的扩增倍数随时间的推移而逐渐上升，1～5天时基本呈直线持平趋势，扩增效率保持恒定，6～18天由于细胞基数较大和传代的原因使扩增倍数基本呈直线上升，18～21天扩增效率增加，在培养到第21天时达到最大值，与实施例1相比，最大扩增倍数提高1倍，结果如图2所示。

2、细胞毒性实验

结果显示，培养至第14天的AIL细胞对Hela细胞的高杀伤力均高于59%（效靶比为10:1的AIL细胞杀伤率为59.13%）。且效靶比越高，AIL细胞的杀瘤活性越强，效靶比为40:1时达到84.01%，与实施例1相比，平均杀伤率提高10%左右，结果如图6所示。

3、细胞表面标记分析

结果显示，培养14天的AIL细胞其表面的CD3⁺CD56⁺细胞的比率为34.91%、CD3⁺CD8⁺的56.94%，CD3⁺CD56⁺和CD3⁺CD8⁺是AIL的主要效应细胞群。与实施例1相比，按实施例2培养得到的AIL细胞其CD3+CD56+细胞的含量有大幅度提高，结果如图10、14所示。

实施例3

如实施例1所述的方法，不同之处在于，无血清培养基每毫升含有如下组分：

IFN-γ2000U、PHA-p 1000ng、IL-1α200U、CD3mAb 100ng、CD28mAb 100ng。

实验结果

检测过程如实施例1所述。经检测，

1、细胞增殖倍数的测定

结果显示，培养在1～21天时，AIL的扩增倍数随时间的推移而逐渐上升，1～5天时基本呈直线持平趋势，扩增效率保持恒定，6～15天由于细胞基数较大和传代的原因使扩增倍数基本呈直线上升，18～21天扩增效率增加呈直线上升，在培养到第21天时达到最大值，与实施例2相比，最大扩增倍数约提高1/3，结果如图3所示。

2、细胞毒性实验

结果显示，培养至第14天的AIL细胞对Hela细胞具有较高杀伤力，均高于67%（效靶比为10:1的AIL细胞杀伤率为67.14%）。且效靶比越高，AIL的杀瘤活性越强，效靶比为40:1时达到92.01%，与实施例2相比，平均杀伤率提高8%左右，结果如图7所示。

3、细胞表面标记分析

结果显示，培养14天的AIL细胞其表面的CD3⁺CD56⁺细胞的比率为70.11%、CD3⁺CD8⁺的35.70%，CD3⁺CD56⁺和CD3⁺CD8⁺是AIL的主要效应细胞群。因CD3⁺CD56⁺是非特异性杀伤肿瘤的效应细胞群，因此其细胞比例的提高对抗肿瘤谱的扩大有十分积极的意义。CD3⁺CD56⁺细胞和CD3⁺CD8⁺的比例越高，细胞杀瘤活性越强，实验2和3相互印证了通过该法培养的AIL细胞具有较好的癌细胞杀伤效果，结果如图11、15所示。

对比例

一种培养淋巴细胞的传统方法，包括如下步骤：

（1）从50～100mL外周血中分离PBMC后，重悬于含10%FBS的RPMI-1640培养基中，置于37℃、体积百分比为7.5%CO₂、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中静置培养72小时，制得初培养液；

（2）向步骤（1）制得的初培养液中补加上述培养基至200mL，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，置于37℃、体积百分比为7.5%CO₂、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中静置培养96小时，得二次培养液；

（3）将步骤（2）制得的二次培养液转移至1.8L细胞培养袋中，补加上述培养基至1000mL，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，置于37℃、体积百分比为7.5%CO₂、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中静置培养72小时，得培养液；

（4）将步骤（3）制得的培养液均匀分成2份，然后用上述培养基补足体积并添加IL-2，使IL-2的浓度为1×10³U/mL，，静置培养72小时，重复本步骤连续培养28天，分批收获细胞，制得淋巴细胞；

实验结果

检测过程如实施例1所述。经检测，

1、细胞增殖倍数的测定

结果显示，培养在1～21天时，淋巴细胞的扩增倍数随时间的推移而缓慢上升，且增殖效率始终低于100，远远低于AIL细胞的增殖倍数（最高扩增倍数522），结果如图4所示。

2、细胞毒性实验

结果显示，培养至第14天的淋巴细胞对Hela细胞的杀伤效率较低，最大值仍不足50%。最小值只有21.43%，远远低于AIL细胞的杀伤效率（51.05%～92.01%），结果如图8所示。

3、细胞表面标记分析

结果显示，培养14天的AIL细胞其表面的CD3⁺CD56⁺细胞的比率为3.94%、CD3⁺CD8⁺的10.99%，CD3⁺CD56⁺细胞和CD3⁺CD8⁺的含量越高，细胞杀瘤活性越强，这也印证了与传统培养方法相比，AIL细胞具有较好的癌细胞杀伤效果，结果如图12、16所示。

实施例4

配制保存液1～4组，其中：

保存液1组，含有如下组分：

体积百分比为20%人血清白蛋白1mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

保存液2组，含有如下组分：

体积百分比为20%人血清白蛋白3mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

保存液3组，含有如下组分：

体积百分比为20%人血清白蛋白5mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

保存液4组，含有如下组分：

体积百分比为20%人血清白蛋白7mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

对照组，含有如下组分：

体积百分比为20%人血清白蛋白0mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

将实施例3制得的自体外周血淋巴细胞平均分为5份，4份分别重悬于保存液1～4组中，第5份重悬于对照组，经10～15℃保温箱内放置12小时后，将细胞悬液取出测定细胞的活性。

实验结果

将取得的细胞用台盼蓝染色后再用血球计数板进行计数，并记录计数结果，以组别为横坐标，以细胞存活率为纵坐标（细胞存活率=将当前活细胞总数÷细胞总数×100%）作图，结果如图17所示。

对照组细胞活性最低，只有65%，1～4组细胞活性依次递增，其中组3和组4的细胞活性均在90%以上，达到我们细胞的质量标准，且两组之间差别不大，考虑到以后量产的成本因素，选择组3为最佳细胞保存液。

Claims (6)

1.一种培养自体外周血淋巴细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从外周血中分离外周血单个核细胞，然后，重悬于无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为（1～2）×10⁶个/mL，静置培养72～84小时，制得初培养液；

（2）向步骤（1）制得的初培养液中补加无血清培养基至初培养液的2～3倍，同时添加白细胞介素2，使白细胞介素2的浓度为1×10³U/mL，静置培养84～96小时，得二次培养液；

（3）向步骤（2）制得的二次培养液中补加无血清培养基至二次培养液的4～5倍，同时添加白细胞介素2，使白细胞介素2的浓度为（1～2）×10³U/mL，静置培养72～84小时，得培养液；

（4）将步骤（3）制得的培养液均匀分成2份，然后用无血清培养基补足体积并添加白细胞介素2，使白细胞介素2的浓度为（1～2）×10³U/mL，静置培养72～84小时，重复本步骤2～3次，制得自体外周血淋巴细胞；

所述步骤（1）中的无血清培养基，每毫升含有如下组分：

干扰素γ500～2500U、植物凝集素P 250～1500ng、白细胞介素1α50～250U、细胞表面分子3单克隆抗体25～150ng、细胞表面分子28单克隆抗体25～150ng。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的无血清培养基，每毫升含有如下组分：

干扰素γ1000～2000U、植物凝集素P 500～1000ng、白细胞介素1α100～200U、细胞表面分子3单克隆抗体50～100ng、细胞表面分子28单克隆抗体50～100ng。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的无血清培养基，每毫升含有如下组分：

干扰素γ2000U、植物凝集素P 1000ng、白细胞介素1α200U、细胞表面分子3单克隆抗体100ng、细胞表面分子28单克隆抗体100ng。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）～（4）中的静置培养条件为在温度为37℃、CO₂体积百分比为含量为5～7.5%、相对饱和湿度为100%的CO₂培养箱中培养。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）还包括将制得的自体外周血淋巴细胞经离心后，重悬于保存液中，所述保存液含有如下组分：

体积百分比为20%的人血清白蛋白1～7mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述保存液含有如下组分：

体积百分比为20%的人血清白蛋白5mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。

Images