CN111560351A - 一种ca9肿瘤抗原特异性的细胞毒性t淋巴细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肾细胞癌肿瘤抗原CA9特异性细胞毒性T淋巴细胞制备方法，包括以下步骤：将含靶向SOCS1的siRNA和碳酸酐酶9的重组载体感染成熟DC细胞，得到iSOCS1‑CA9‑DC细胞；然后将iSOCS1‑CA9‑DC细胞与T细胞混合培养，获得CA9‑DC‑CTL细胞，即具有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。本发明采用复制缺陷型腺病毒介导RNAi下调SOCS1基因表达，联合CA9及S‑Flagellin刺激DC细胞成熟，诱导特异性的CTL抗肾细胞癌。有效的增强了CTL对肾癌细胞的靶向性，避免对自体细胞的损伤，可以有效的抑制肿瘤的生长，延长患者生存期。

Description

一种CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞
技术领域
本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种经携带抑制免疫负调控基因及碳酸酐酶IX基因的腺病毒载体修饰的树突状细胞激活的CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞及其培养方法。
背景技术
免疫细胞治疗是治疗癌症的新的一种治疗手段，分离患者外周血的淋巴细胞对多种外来抗原具有很好的反应能力。因此通过体外培养DC细胞、诱导高效的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、回输患者，成为很好的治疗方法。目前常采用肿瘤细胞裂解物加载DC，但其有不足，非肿瘤相关抗原种类多，易诱发自身免疫病，且多抗原带来免疫原性低等缺点。另一种刺激诱导物采用肿瘤抗原肽致敏DC，其特异性好，可多次免疫等优点，但也存在不足：抗原肽一般价格较贵，且半衰期短，需要多次免疫才能获得良好的CTL。
为了克服上述缺点，发展了沉默免疫负调控基因（inhibition of antigen-presentation attenuator, iAPA）技术。沉默免疫负调控基因技术核心是采用腺病毒载体或其他非整合染色体技术介导siRNA特异性阻断抗原呈递细胞中的负调控因子，使其基因表达沉默，能够解除自体免疫耐受，增强抗原特异性免疫防疫。Si-Yi Chen等首先提出了iAPA的概念和设想并进行了系列研究，结果表明，采用RNAi方法沉默DC内细胞因子信号传导抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling-1，SOCS1）基因的表达，能够促进DC的成熟，改变其耐受原性；增强DC细胞诱导免疫的免疫强度和时间，同时增强免疫记忆功能，从而打破宿主水平的自身耐受性并超激活抗原特异性的CTL反应，控制弱免疫源性肿瘤的生长；可以更好的促进DC的成熟，进而提高DC的抗原呈递功能； 同时表达分泌游离态Flagellin，能够进一步刺激DC细胞成熟。
碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CAIX或CA9）是分布于细胞膜和细胞核膜的糖蛋白。Oosterwi JK等首先获得鼠源的CA9单抗，利用单抗对多数类型的肾细胞癌进行免疫组化，88%有该抗原表达，而多数组织不表达，只在胃粘膜和大胆管上皮细胞有少量表达。因此，肿瘤相关抗原CA9可以作为肾细胞癌的肿瘤标志物或靶标。
发明内容
针对目前免疫细胞治疗对肾癌细胞的靶向性差的问题，本发明提供一种经携带抑制免疫负调控基因及碳酸酐酶IX基因的腺病毒载体修饰的树突状细胞激活的CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的培养方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）将含靶向SOCS1的siRNA、CA9和Flagellin鞭毛蛋白基因的重组载体感染成熟DC细胞，得到iSOCS1-CA9-DC细胞；
（2）将步骤（1）得到的iSOCS1-CA9-DC细胞与T细胞混合培养，获得CA9-DC-CTL细胞，即具有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。
步骤（1）中，所述重组载体的目的基因序列依次为U6启动子-SOCS1 siRNA -CMV启动子-CA9基因-IRES序列-Flagellin鞭毛蛋白基因序列。
优选的，所述SOCS1 siRNA的结构为发卡siRNA。
步骤（1）中，所述重组载体为病毒；优选为腺病毒；更优选的，腺病毒MOI 为100。
步骤（2）中，所述iSOCS1-CA9-DC细胞与T细胞的比例为1:5；两者的总密度为1×106/mL。。
步骤（2）中，所述T细胞是将T细胞在CD3单抗50 ng/mL，CD28单抗50 ng/mL，IL-21000 U/mL刺激培养48h后的T细胞。
优选的，步骤（2）中，所述T细胞来源于熟DC细胞分离过程。
一种上述方法获得的CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。
本发明具有以下优点：
本发明采用复制缺陷型腺病毒介导RNAi下调SOCS1基因表达， S-Flagellin刺激DC细胞成熟，联合CA9增强DC细胞肾癌靶向性，诱导特异性的CTL抗肾细胞癌。此外，T细胞来源于DC细胞分离过程，冻存后复苏再使用，可以减少采血量，减轻患者痛苦；而且通过本发明获得的DC细胞刺激获得的CTL细胞与采用新鲜分离的T细胞并没有差异。有效的增强了CTL对肾癌细胞的靶向性，避免对自体细胞的损伤，可以有效的抑制肿瘤的生长，延长患者生存期。
附图说明
图1为CA9-DC-CTL细胞的培养流程示意图；
图2是经不同腺病毒感染然后DC细胞形态、成熟表型和CA9蛋白的表达量；
图3为不同CTL细胞的HLA.A*2402/EYRALQLHL四聚体特异性；
图4为CA9-DC-CTL细胞和GFP-DC-CTL细胞在效靶比为1:1和1:3时对靶细胞CA9-293FT的杀伤活性；
图5为CA9-Frozen-CTL细胞和GFP-nonF-CTL细胞在效靶比为3:1、1:1和1:3时对靶细胞CA9-293FT的杀伤活性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 CA9-DC-CTL细胞的培养
CA9-DC-CTL细胞的培养流程如图1所示，包括如下步骤：分别制备重组腺病毒Ad-siSOCS1-CA9-IRES-F和对照腺病毒Ad-GFP；全血中分离单个核细胞，经过7天诱导获得DC细胞；DC细胞经腺病毒感染后培养24h，与T细胞混合培养获得CA9特异性细胞毒性T淋巴细胞。
1. AD5-siSOCS1-CA9重组腺病毒的制备
siSOCS1-CA9重组腺病毒目的基因序列设计如下：U6启动子-SOCS1 shRNA -CMV启动子-CA9基因-IRES序列-Flagellin鞭毛蛋白基因序列。然后由外包公司将上述目的基因与AD5腺病毒骨架包装成腺病毒，获得携带目的基因的Ad-siSOCS1-CA9-IRES-F重组腺病毒。同时，制备携带GFP（绿色荧光蛋白）基因和非靶向SOCS1序列的无关siRNA对照腺病毒Ad-GFP。
2. DC细胞的分离、分化、成熟及感染
按照全血：生理盐水：淋巴细胞分离液为1：1：1的比例，离心力为600g，离心时间为20min，升速为4、降速为0。离心后提取淋巴细胞分离液上方单个核细胞层，洗涤两遍；
DC细胞的分化诱导及iSOCS1-CA9-DC的制备：调整单个核细胞密度到5×106/ml，按照106/cm2的细胞数量加入到培养瓶中，37℃、5%CO2浓度培养箱中培养2h，轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细胞离心收集、冻存。原培养瓶中加入含2 IU/mL DC细胞培养因子（Novoprotein，Shanghai，China）的Lymphocyte serum-free medium KBM 581培养基（Corning，Jiangsu，China），于37℃、5%CO2浓度培养箱中培养。过夜培养后，第二天轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细胞离心收集、再次冻存。DC细胞培养瓶中再次加入含DC细胞培养因子的581培养基，继续培养3天。培养至第5天，将培养基完全换为含2 IU/mL DC细胞成熟因子（Novoprotein，Shanghai，China）的Lymphocyte serum-free medium KBM 581培养基，继续培养48h。收集悬浮细胞，计算细胞总量。按照MOI 100进行腺病毒感染，分别加入不同腺病毒2h后换液，继续培养48h，获得iSOCS1-CA9-DC细胞和对照DC细胞。分别经Ad-siSOCS1-CA9-IRES-F和Ad-GFP两种腺病毒感染的DC细胞形态、表型及CA9表达情况如图2所示。经Ad-siSOCS1-CA9-IRES-F感染的DC细胞形态上更加成熟，细胞突触的数量及长度均比Ad-GFP感染的DC多且长（图2A）。腺病毒感染后DC表型如图2B所示，感染Ad-siSOCS1-CA9-IRES-F腺病毒后DC成熟表型CD83及协同刺激分子CD80表达量明显提高这个专利腺病毒框架是有专利的，包括SOCS和Flagellin,我们不做权利要求。（**p<0.001），CD86变化不大。经腺病毒感染后CA9表达情况如图2C所示，感染Ad-siSOCS1-CA9-IRES-F腺病毒后的DC细胞中表达CA9的比例高达91.3%，显著高于正常DC细胞的10.0%。
3. CA9特异性细胞毒性T淋巴细胞制备及增殖
将步骤2中冻存的细胞（即T细胞）复苏，按照以下浓度加入刺激因子：CD3单抗50 ng/ml，CD28单抗50 ng/ml，IL-2 1000 U/ml，刺激T细胞增殖；刺激培养48小时后，收获T细胞；将感染不同腺病毒的DC细胞分别培养7天，收获DC细胞；按照DC:T=1：5的比例混合培养，调整混合细胞密度为1×106/mL，添加含有IL2（终浓度为1000 U/mL）的581培养基。根据细胞生长情况进行补液操作，分别在第1、3、6、9、12、15天，记录不同CTL细胞量，以第1天的细胞量为起始细胞量，计算不同CTL细胞增殖倍数，结果如图3A所示，第6天起两种CTL细胞均进入指数生长期，且CA9-DC-CTL细胞增殖倍数显著提高（**p<0.001）。
检测CA9-DC-CTL中CA9抗原特异性CTL细胞用抗体为HLA.A*2402/EYRALQLHL-APC，其中EYRALQLHL多肽为CA9蛋白特异性多肽，当EYRALQLHL四聚体为阳性时表明CTL细胞具有CA9蛋白特异性。流式细胞仪鉴定不同CTL细胞HLA.A*2402/EYRALQLHL四聚体特异性如图3B所示：经CA9-DC细胞激活后的CTL细胞其CA9特异性多肽HLA.A*2402/EYRALQLHL四聚体特异性为5.3%，GFP-DC-CTL细胞没有CA9特异性。
实施例2 不同CTL细胞对靶细胞CA9-293FT的杀伤活性
构建pHR-CA9表达载体，包装慢病毒，感染HEK293细胞，获得表达CA9的HEK293-FT细胞，作为CA9特异性DC-CTL细胞的靶细胞。将靶细胞CA9-293FT接种到RTCA仪器配套的16孔版中，经过6-8小时培养后，完全贴壁。
按设定的效靶比为1：3、1：1，在对应的孔内加入100μL的CA9-DC-CTL细胞和GFP-DC-CTL细胞（对照），RTCA实时动态检测两种细胞对肿瘤细胞的杀伤过程。图4为DC与T混合培养后第1-3天对CA9-293FT的杀伤的实时记录。结果显示， CA9-DC-CTL细胞对靶细胞的杀伤作用在效靶比为1:1时明显高于对照细胞；而效靶比1:3时杀伤作用相当。
实施例3 不同处理T细胞获得CTL细胞对靶细胞CA9-293FT的杀伤活性
按照实施例1中2的方法获得新鲜的单个核细胞，利用实施例1中3的方法此新鲜T细胞直接用于制备CA9-nonF-CTL细胞；按照实施例1中3的方法获得CA9-Frozen-CTL细胞。实施例2获得的CA9-293FT细胞为靶细胞，然后按照以下方法进行杀伤活性试验：
按设定的效靶比为3：1、1：3、1：1，在对应的孔内加入100μL的CA9-Frozen-CTL细胞和CA9-nonF-CTL细胞，RTCA实时动态检测两种细胞对肿瘤细胞的杀伤过程。图5为两种CTL对CA9-293FT的杀伤的实时记录。结果显示， 两种CTL细胞对靶细胞的杀伤作用在三种效靶比情况下，杀伤作用相当，说明T细胞经过冻存后并不影响CTL杀伤效力。
序列表
<110> 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司
<120> 一种CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞
<130> 20200410
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 300
acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 360
cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 420
tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 480
ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc 540
cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc caca 594
<210> 4
<211> 1492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flagellin
<400> 4
atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60
tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc 120
gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt 180
ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240
gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300
aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360
aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420
gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg 480
aagcagatca actctcagac cctgggtctg gatacgctga atgtgcaaca aaaatataag 540
gtcagcgata cggctgcaac tgttacagga tatgccgata ctacgattgc tttagacaat 600
agtactttta aagcctcggc tactggtctt ggtggtactg accagaaaat tgatggcgat 660
ttaaaatttg atgatacgac tggaaaatat tacgccaaag ttaccgttac ggggggaact 720
ggtaaagatg gctattatga agtttccgtt gataagacga acggtgaggt gactcttgct 780
ggcggtgcga cttccccgct tacaggtgga ctacctgcga cagcaactga ggatgtgaaa 840
aatgtacaag ttgcaaatgc tgatttgaca gaggctaaag ccgcattgac agcagcaggt 900
gttaccggca cagcatctgt tgttaagatg tcttatactg ataataacgg taaaactatt 960
gatggtggtt tagcagttaa ggtaggcgat gattactatt ctgcaactca aaataaagat 1020
ggttccataa gtattaatac tacgaaatac actgcagatg acggtacatc caaaactgca 1080
ctaaacaaac tgggtggcgc agacggcaaa accgaagttg tttctattgg tggtaaaact 1140
tacgctgcaa gtaaagccga aggtcacaac tttaaagcac agcctgatct ggcggaagcg 1200
gctgctacaa ccaccgtttt aaaacccgct gcagaaaatt gatgctgctt tggcacaggt 1260
tgacacgtta cgttctgacc tgggtgcggt acagaaccgt ttcaactccg ctattaccaa 1320
cctgggcaac accgtaaaca acctgacttc tgcccgtagc cgtatcgaag attccgacta 1380
cgcgaccgaa gtttccaaca tgtctcgcgc gcagattctg cagcaggccg gtacctccgt 1440
tctggcgcag gcgaaccagg ttccgcaaaa cgtcctctct ttactgcgtt aa 1492

Claims (9)

1.一种CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含靶向SOCS1的siRNA、CA9和Flagellin鞭毛蛋白基因的重组载体感染成熟DC细胞，得到iSOCS1-CA9-DC细胞；
（2）将步骤（1）得到的iSOCS1-CA9-DC细胞与T细胞混合培养，获得CA9-DC-CTL细胞，即具有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述重组载体的目的基因序列依次为U6启动子-SOCS1 siRNA -CMV启动子-CA9基因-IRES序列-Flagellin鞭毛蛋白基因序列。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述SOCS1 siRNA的结构为发卡siRNA。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述重组载体为病毒。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述重组载体为为腺病毒；优选的，腺病毒MOI 为100。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述iSOCS1-CA9-DC细胞与T细胞的比例为1:5；两者的总密度为1×106/mL。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述T细胞是将诱导DC过程中未贴壁冻存细胞在CD3单抗50 ng/mL，CD28单抗50 ng/mL，IL-2 1000 U/mL刺激培养48h后的T细胞。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述T细胞来源于成熟DC细胞分离过程。
9.一种如权利要求1-8任一所述的培养方法获得的CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114277056A (zh) * 2021-12-24 2022-04-05 泉州师范学院 一种肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101932339A (zh) * 2007-11-30 2010-12-29 贝勒医学院 树突细胞疫苗组合物及其应用
CN102816735A (zh) * 2012-09-12 2012-12-12 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种自体外周血淋巴细胞的培养方法
CN105602900A (zh) * 2015-12-29 2016-05-25 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞的培养方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101932339A (zh) * 2007-11-30 2010-12-29 贝勒医学院 树突细胞疫苗组合物及其应用
CN102816735A (zh) * 2012-09-12 2012-12-12 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种自体外周血淋巴细胞的培养方法
CN105602900A (zh) * 2015-12-29 2016-05-25 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞的培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIDEKI MUKOUYAMA等: "Generation of Kidney Cancer-Specific Antitumor Immune Responses Using Peripheral Blood Monocytes Transduced With a Recombinant Adenovirus Encoding Carbonic Anhydrase 9", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114277056A (zh) * 2021-12-24 2022-04-05 泉州师范学院 一种肾癌抗原ca9蛋白特异性细胞毒性t淋巴细胞的制备方法

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