CN111729079A - 一种针对新型冠状病毒的dc疫苗、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，所述DC疫苗，包括COVID‑19的S蛋白、趋化因子CCL19。本发明用自体外周血制作DC疫苗安全性高，没有排斥反应。相比其他疫苗来说持续时间长，能更快的识别抗原，启动T细胞的杀伤功能，同时产生抗体，体外试验中，DC疫苗联合CIK在4h时就已经启动对靶细胞的杀伤；本发明制备的2019nCOV‑S‑CCL19 DC疫苗与CIK细胞联合杀伤实验效果好，体外试验中，两者联合使用，与靶细胞混合24h进行检测，在效靶比10:1时，对靶细胞的细胞毒性高达93.2％，在效靶比5:1时，对靶细胞的细胞毒性高达68.6%。

Description

一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
树突状细胞（Dendritic cells，DC）是最有效的专业抗原提呈细胞（APC），在调节先天性和适应性免疫反应中发挥着重要作用。在其未成熟状态下，DC在组织微环境中巡逻，并在外来病原体的存在下被激活。这种激活是在外源性危险信号通过Toll样受体（TLR）等模式识别受体（PRR）刺激后发生的，并导致DC向引流淋巴结的迁移和处理过的表位向T细胞的呈现。在T细胞活化过程中，DC与T细胞受体（TCR）结合，分泌特异性细胞因子，并根据细胞因子环境刺激对TH1、TH2或Tregs的免疫反应。
最新研究表明，在COVID-19与SARS病毒S蛋白的保守性最高，其在结合细胞受体和介导病毒与宿主细胞膜的融合过程中起着重要作用，在COVID-19感染过程中是中和病毒感染的主要靶标。因此，选取COVID-19病毒的S蛋白作为抗原，刺激培养的DC细胞，制备成DC疫苗，可以快速识别病毒，并呈递给T细胞，启动T细胞的杀伤作用。
国内已采取多种技术手段快速开发新型冠状病毒疫苗(COVID-19)。为加快疫苗开发速度并提高成功率，国家同时开发多种候选疫苗，包括灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗、DC疫苗。目前国内外用于新冠病毒的疫苗还没有上市，但国内开发速度最快的核酸疫苗已经入Ⅱ期临床，其次两款灭活疫苗已获得临床审批。
灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗其作用机制均作为抗原刺激体内的组织细胞，通过一系列的反应刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，在体内形成抗体。这三种疫苗主要通过肌肉注射进入体内，肌注后被肌肉细胞提取的抗原仅有很少一部分，所以对其在体内是否有抗体的形成，是无法预测的。
DC疫苗主要是负载相关的抗原，由于DC细胞不增殖，现有的DC疫苗发挥的作用处于一般水平。由于新冠病毒是新发现的病毒，目前还没有相应的DC疫苗。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用，采集自体外周血分离出单核细胞培养成DC细胞，利用COVID-19的S蛋白作为抗原刺激DC细胞，并整合到DC细胞中，回输到体内，起到预防与治疗的作用；实现以下发明目的：
本发明的DC疫苗缩短T细胞识别抗原的时间，更加快速启动体内的免疫应答反应；和CIK细胞联用，提高CIK细胞对COVID-19病毒的杀伤效果。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，所述DC疫苗，包括COVID-19的S蛋白、趋化因子CCL19。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述COVID-19的S蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述CCL19的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
所述DC疫苗，包括融合基因片段CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19。
所述CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的制备方法，所述制备方法，包括S蛋白抗原表达载体的构建、腺相关病毒的包装、感染DC细胞。
所述S蛋白抗原表达载体的构建，将融合基因片段CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19，插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP，得到重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S-CCL19，质粒浓度高于200ng/ul。
所述腺相关病毒的包装，将重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S-CCL19转染HEK293细胞，得到pAAV-2019nCOV-S-CCL19腺病毒，病毒滴度为1.2-1.3×108TU/ml。
一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的应用，所述DC疫苗用于预防和治疗新型冠状病毒COVID-19。
所述DC疫苗和CIK细胞联合使用，所述CIK细胞和DC细胞的数量比为9.5-10.5：1。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
（1）本发明用自体外周血制作DC疫苗安全性高，没有排斥反应。相比其他疫苗来说持续时间长，能更快的识别抗原，启动T细胞的杀伤功能，同时产生抗体，体外试验中，DC疫苗联合CIK在4h时就已经启动对靶细胞的杀伤。
（2）本发明制备的2019nCOV-S-CCL19 DC疫苗可以提高CIK细胞对新型冠状病毒COVID-19细胞的杀伤效果；本发明的2019nCOV-S-CCL19 DC疫苗与CIK细胞联合杀伤实验，CIK细胞和DC细胞的数量比为9.5-10.5：1，与靶细胞混合24h进行检测，在效靶比10:1时，对靶细胞的细胞毒性高达93.2％，在效靶比5:1时，对靶细胞的细胞毒性高达68.6%。
附图说明
图1为实施例2质粒转染包装成腺相关病毒的免疫荧光显微镜图；
图2为实施例3制备的未成熟的DC细胞；
图3为实施例3制备的成熟的DC细胞；
图4为 DC细胞表面标志物CD80的表达率的流式图；
图5为DC细胞表面标志物CD83的表达率的流式图；
图6为DC细胞表面标志物CD86的表达率的流式图；
图7为pAAV-2019nCOV-S感染DC细胞后GFP表达率的流式图；
图8为pAAV-2019nCOV-S-CCL19感染DC细胞后GFP表达率的流式图；
图9为不同效靶比下DC疫苗联合CIK细胞对新冠病毒的杀伤效率；
图10为不同时间下DC疫苗联合CIK细胞对新冠病毒的杀伤效率。
具体实施方式
实施例1、S蛋白抗原表达载体的构建
S蛋白抗原质粒构建各模块核酸序列如下：
（1）导引子Leader CD8 (SEQ ID NO.1）
（2）2019nCOV-S(SEQ ID NO.2)
（3）T2A(SEQ ID NO.3)
（4）CCL19 (SEQ ID NO.4)
委托北京博迈德生物技术有限公司分别按照融合基因CD8-2019nCOV-S（SEQ ID NO.5）和CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19（SEQ ID NO.6）依次串联合成人工核酸序列，插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP，转化到E.coli（TOP10），经测序鉴定正确后，利用Qiagen质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S和pAAV-2019nCOV-S-CCL19，其质粒浓度高于200ng/ul。
实施例2、腺相关病毒的包装与滴度测定
①HEK293细胞的复苏与传代
从液氮罐中取出冻存的HEK293细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50ml离心管中，并在其中加上5 ml新鲜的完全培养基（含10%FBS），混匀后离心，1500 rpm，5 min。去掉上清，加入1 ml新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后，转入T75瓶中，每个瓶中补足到10ml完全培养基。将培养瓶平稳放入37℃、5 %CO2和95 %相对湿度的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况，在细胞铺满瓶底的80%-90%时传代，传代后细胞用于转染。
②质粒转染包装成腺相关病毒
当传代后细胞铺板达到60%-70%时，用于转染。转染前1-3小时，更换新鲜DMEM培养基。
转染试剂的准备：在5ml离心管中，分别配制A管与B管试剂（Tube A and Tube B）
Figure RE-148647DEST_PATH_IMAGE001
配好后，放置5min，然后将A管缓慢加入B管，混合均匀。室温放置20min，使得脂质体-DNA混合物形成。加入7mL的完全培养基混合均匀，加入培养瓶中，轻微混匀。置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h。更换新鲜的完全培养基，继续培养24-48h，用免疫荧光显微镜观察转染情况（如图1），收取上清，转移至50ml离心管，3000rpm在4℃离心15min，去除沉淀。上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。利用倍比稀释技术法测定病毒滴度，本发明中pAAV-2019nCOV-S的病毒滴度为1.3×108TU/ml，pAAV-2019nCOV-S-CCL19的病毒滴度为1.25×108TU/ml。
上述完全培养基是指含10%FBS的DMEM培养基。
实施例3、DC疫苗制备
采集健康供者外周静脉血50ml，加入50ml生理盐水进行稀释，在50ml离心管里先加入淋巴细胞分离液20ml，然后缓慢加入25ml的血液，900g离心25min。液面分为四层，吸取中间的白细胞层，加入DC培养基。37℃，5% CO2培养箱中孵育2h，使单核细胞贴壁。丢弃培养上清，在贴壁细胞中加入含重组人 GM-CSF(500-1000U/ml)和重组人IL-4 (500U/ml)的DC培养基（购自达优），37℃，5% CO2培养箱中培养，隔天进行换液，培养5天得到imDC（如图2）。
取出制备好的pAAV-2019nCOV-S和pAAV-2019nCOV-S-CCL19病毒，以MOI＝5感染上述imDC，感染8-12h后，用PBS洗涤细胞2-3次，加入成熟因子TNF-α（10ng/ml）继续培养诱导得到成熟的DC细胞（mDC），通过倒置显微镜观察DC成熟后细胞形态（如图3）。流式细胞仪分析DC细胞成熟标志CD80、CD83、CD86的表达情况和腺相关病毒感染DC细胞的效率。如图4-8所示，本发明中，DC细胞中CD80的表达率为89.9%，CD83的表达率为95.2%，CD86的表达率为86.7%，pAAV-2019nCOV-S感染DC细胞后GFP的表达率为72.2%，pAAV-2019nCOV-S-CCL19感染DC细胞后GFP的表达率为72%。
实施例4、DC疫苗联合CIK细胞对新冠病毒的体外杀伤作用
①2019nCOV-vero细胞系的构建
将2019nCOV-S抗原构建到真核表达载体pcDNA3.1-eGFP中，利用脂质体将其转染到vero细胞系中，并利用抗生素进行筛选，得到表达2019nCOV S蛋白的vero细胞系，作为杀伤实验中的靶细胞。
②CIK细胞的培养
采集健康供者50ml外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1500IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5%的患者自体血浆诱导继续培养。每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80%，CD3+CD56+双阳性率>20%，视为CIK细胞诱导成功，并留取该CIK细胞用于后续实验。
③DC疫苗联合CIK细胞对新冠病毒的体外杀伤实验
由于DC细胞只起到递呈的作用，自身不起杀伤作用，需要和CIK细胞先共培养3天，再进行杀伤实验。杀伤实验中对照组为：
对照组1：靶细胞最大释放LDH，需加入相同体积的细胞裂解液 ；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH；
对照组4：空白培养基的背景；
对照组5：体积校准的背景，空白培养基加入相同体积的细胞裂解液。
实验分组为：
A组、CIK细胞
B组、CIK细胞+DC细胞
C组、CIK细胞+DC-2019nCOV-S疫苗
D组、CIK细胞+DC-2019nCOV-S-CCL19疫苗
B-D组实验组中CIK细胞和DC细胞的数量为10：1，先将两种细胞共培养3天（共培养的条件:CIK培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养），对CIK细胞进行计数；然后加入到靶细胞中，其中靶细胞数量为1×104/孔，以效靶比为10:1、5:1、1:1加入对应的效应细胞，各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。检测时间为细胞混合后24h。同时对A组、B组、D组混合培养后的4h、8h、12h、16h进行检测，见图10；
上述效靶比是 CIK细胞与靶细胞的数量比。
检测方法：采用CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒（Promega公司）进行检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶（LDH）。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐（INT）转化为红色的甲臜（formazan）。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
细胞毒性计算公式为：
Figure RE-3471DEST_PATH_IMAGE002
实验结果表明，如图9所示，实验C组和实验D组对表达2019nCOV S蛋白的vero细胞均表现出显著的特异性细胞毒性作用，但是前者的细胞毒性作用要低于后者，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强。其中2019nCOV-S DC疫苗与CIK细胞联用，在效靶比10:1时对靶细胞的细胞毒性为53.4％；而2019nCOV-S-CCL19 DC疫苗与CIK细胞联用，在效靶比10:1时，对靶细胞的细胞毒性高达93.2％，在效靶比5:1时，对靶细胞的细胞毒性高达68.6%％；如图10所示，对不同时间下的A组、B组、D组细胞毒性进行了检测，结果显示，DC疫苗联合CIK在4h时就已经启动杀伤，而B组还没有启动，说明DC疫苗的加入缩短了T细胞识别抗原的时间，更加快速启动免疫反应。
序列表
<110> 山东兴瑞生物科技有限公司
<120> 一种针对新型冠状病毒的DC疫苗、制备方法及其应用
<130> 2020
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacaca 3819
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gaaggccgag ggagcctgct gacatgtggc gatgtggagg aaaacccagg acca 54
<210> 4
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60
agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120
tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180
gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240
cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294
<210> 5
<211> 3882
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccatgtttg tttttcttgt tttattgcca ctagtctcta gtcagtgtgt taatcttaca 120
accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtgt ttattaccct 180
gacaaagttt tcagatcctc agttttacat tcaactcagg acttgttctt acctttcttt 240
tccaatgtta cttggttcca tgctatacat gtctctggga ccaatggtac taagaggttt 300
gataaccctg tcctaccatt taatgatggt gtttattttg cttccactga gaagtctaac 360
ataataagag gctggatttt tggtactact ttagattcga agacccagtc cctacttatt 420
gttaataacg ctactaatgt tgttattaaa gtctgtgaat ttcaattttg taatgatcca 480
tttttgggtg tttattacca caaaaacaac aaaagttgga tggaaagtga gttcagagtt 540
tattctagtg cgaataattg cacttttgaa tatgtctctc agccttttct tatggacctt 600
gaaggaaaac agggtaattt caaaaatctt agggaatttg tgtttaagaa tattgatggt 660
tattttaaaa tatattctaa gcacacgcct attaatttag tgcgtgatct ccctcagggt 720
ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg ccaataggta ttaacatcac taggtttcaa 780
actttacttg ctttacatag aagttatttg actcctggtg attcttcttc aggttggaca 840
gctggtgctg cagcttatta tgtgggttat cttcaaccta ggacttttct attaaaatat 900
aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta gactgtgcac ttgaccctct ctcagaaaca 960
aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa aaaggaatct atcaaacttc taactttaga 1020
gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt cctaatatta caaacttgtg cccttttggt 1080
gaagttttta acgccaccag atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc 1140
aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat aattccgcat cattttccac ttttaagtgt 1200
tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca 1260
tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct 1320
gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac 1380
aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt taggaagtct 1440
aatctcaaac cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg tagcacacct 1500
tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc 1560
actaatggtg ttggttacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga acttctacat 1620
gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc 1680
aatttcaact tcaatggttt aacaggcaca ggtgttctta ctgagtctaa caaaaagttt 1740
ctgcctttcc aacaatttgg cagagacatt gctgacacta ctgatgctgt ccgtgatcca 1800
cagacacttg agattcttga cattacacca tgttcttttg gtggtgtcag tgttataaca 1860
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gtccctgttg ctattcatgc agatcaactt actcctactt ggcgtgttta ttctacaggt 1980
tctaatgttt ttcaaacacg tgcaggctgt ttaatagggg ctgaacatgt caacaactca 2040
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tctcctcggc gggcacgtag tgtagctagt caatccatca ttgcctacac tatgtcactt 2160
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atgtacattt gtggtgattc aactgaatgc agcaatcttt tgttgcaata tggcagtttt 2340
tgtacacaat taaaccgtgc tttaactgga atagctgttg aacaagacaa aaacacccaa 2400
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gatctacttt tcaacaaagt gacacttgca gatgctggct tcatcaaaca atatggtgat 2580
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gttttgccac ctttgctcac agatgaaatg attgctcaat acacttctgc actgttagcg 2700
ggtacaatca cttctggttg gacctttggt gcaggtgctg cattacaaat accatttgct 2760
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caaaaattga ttgccaacca atttaatagt gctattggca aaattcaaga ctcactttct 2880
tccacagcaa gtgcacttgg aaaacttcaa gatgtggtca accaaaatgc acaagcttta 2940
aacacgcttg ttaaacaact tagctccaat tttggtgcaa tttcaagtgt tttaaatgat 3000
atcctttcac gtcttgacaa agttgaggct gaagtgcaaa ttgataggtt gatcacaggc 3060
agacttcaaa gtttgcagac atatgtgact caacaattaa ttagagctgc agaaatcaga 3120
gcttctgcta atcttgctgc tactaaaatg tcagagtgtg tacttggaca atcaaaaaga 3180
gttgattttt gtggaaaggg ctatcatctt atgtccttcc ctcagtcagc acctcatggt 3240
gtagtcttct tgcatgtgac ttatgtccct gcacaagaaa agaacttcac aactgctcct 3300
gccatttgtc atgatggaaa agcacacttt cctcgtgaag gtgtctttgt ttcaaatggc 3360
acacactggt ttgtaacaca aaggaatttt tatgaaccac aaatcattac tacagacaac 3420
acatttgtgt ctggtaactg tgatgttgta ataggaattg tcaacaacac agtttatgat 3480
cctttgcaac ctgaattaga ctcattcaag gaggagttag ataaatattt taagaatcat 3540
acatcaccag atgttgattt aggtgacatc tctggcatta atgcttcagt tgtaaacatt 3600
caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc tctcatcgat 3660
ctccaagaac ttggaaagta tgagcagtat ataaaatggc catggtacat ttggctaggt 3720
tttatagctg gcttgattgc catagtaatg gtgacaatta tgctttgctg tatgaccagt 3780
tgctgtagtt gtctcaaggg ctgttgttct tgtggatcct gctgcaaatt tgatgaagac 3840
gactctgagc cagtgctcaa aggagtcaaa ttacattaca ca 3882
<210> 6
<211> 4176
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
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accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtgt ttattaccct 180
gacaaagttt tcagatcctc agttttacat tcaactcagg acttgttctt acctttcttt 240
tccaatgtta cttggttcca tgctatacat gtctctggga ccaatggtac taagaggttt 300
gataaccctg tcctaccatt taatgatggt gtttattttg cttccactga gaagtctaac 360
ataataagag gctggatttt tggtactact ttagattcga agacccagtc cctacttatt 420
gttaataacg ctactaatgt tgttattaaa gtctgtgaat ttcaattttg taatgatcca 480
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tattctagtg cgaataattg cacttttgaa tatgtctctc agccttttct tatggacctt 600
gaaggaaaac agggtaattt caaaaatctt agggaatttg tgtttaagaa tattgatggt 660
tattttaaaa tatattctaa gcacacgcct attaatttag tgcgtgatct ccctcagggt 720
ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg ccaataggta ttaacatcac taggtttcaa 780
actttacttg ctttacatag aagttatttg actcctggtg attcttcttc aggttggaca 840
gctggtgctg cagcttatta tgtgggttat cttcaaccta ggacttttct attaaaatat 900
aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta gactgtgcac ttgaccctct ctcagaaaca 960
aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa aaaggaatct atcaaacttc taactttaga 1020
gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt cctaatatta caaacttgtg cccttttggt 1080
gaagttttta acgccaccag atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc 1140
aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat aattccgcat cattttccac ttttaagtgt 1200
tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca 1260
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gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac 1380
aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt taggaagtct 1440
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acacactggt ttgtaacaca aaggaatttt tatgaaccac aaatcattac tacagacaac 3420
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cctttgcaac ctgaattaga ctcattcaag gaggagttag ataaatattt taagaatcat 3540
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caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc tctcatcgat 3660
ctccaagaac ttggaaagta tgagcagtat ataaaatggc catggtacat ttggctaggt 3720
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tgctgtagtt gtctcaaggg ctgttgttct tgtggatcct gctgcaaatt tgatgaagac 3840
gactctgagc cagtgctcaa aggagtcaaa ttacattaca caatggccct gctactggcc 3900
ctcagcctgc tggttctctg gacttcccca gccccaactc tgagtggcac caatgatgct 3960
gaagactgct gcctgtctgt gacccagaaa cccatccctg ggtacatcgt gaggaacttc 4020
cactaccttc tcatcaagga tggctgcagg gtgcctgctg tagtgttcac cacactgagg 4080
ggccgccagc tctgtgcacc cccagaccag ccctgggtag aacgcatcat ccagagactg 4140
cagaggacct cagccaagat gaagcgccgc agcagt 4176

Claims (9)

1.一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述DC疫苗，包括COVID-19的S蛋白、趋化因子CCL19。
2.根据权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述COVID-19的S蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述CCL19的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述DC疫苗，包括融合基因片段CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19。
4.根据权利要求3所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗，其特征在于：所述CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
5.一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法，包括S蛋白抗原表达载体的构建、腺相关病毒的包装、感染DC细胞。
6.根据权利要求5所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的制备方法，其特征在于：所述S蛋白抗原表达载体的构建，将融合基因片段CD8-2019nCOV-S-T2A-CCL19，插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP，得到重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S-CCL19，质粒浓度高于200ng/ul。
7.根据权利要求5所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的制备方法，其特征在于：所述腺相关病毒的包装，将重组腺相关病毒表达载体pAAV-2019nCOV-S-CCL19转染HEK293细胞，得到pAAV-2019nCOV-S-CCL19腺病毒，病毒滴度为1.2-1.3×108TU/ml。
8.一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的应用，其特征在于：所述DC疫苗用于预防和治疗新型冠状病毒COVID-19。
9.根据权利要求8所述的一种针对新型冠状病毒的DC疫苗的应用，其特征在于：所述DC疫苗和CIK细胞联合使用，所述CIK细胞和DC细胞的数量比为9.5-10.5：1。
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